Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vivo Undersökning av Antimicrobial Blue Ljusterapi för multiresistent Acinetobacter baumannii Burn Infektioner Använda Bioluminescence Imaging

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997

Abstract

Bränn infektioner fortsätter att vara en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Den ökande uppkomsten av multiresistenta (MDR) bakterier har lett till ofta förekommande fel hos traditionella antibiotikabehandlingar. Alternativa läkemedel finns ett akut behov att ta itu med MDR bakterier.

En innovativ icke-antibiotisk strategi har antimikrobiell blått ljus (ABL), visat lovande effektivitet mot MDR-infektioner. Verkningsmekanismen av Abl är ännu inte klarlagd. Det är allmänt antagit att naturligt förekommande endogena fotosensibiliserande kromoforer i bakterier (t ex järnfria porfyriner, flaviner, etc.) exciteras av abl, som i sin tur producerar cytotoxiska reaktiva syrespecies (ROS) genom en fotokemisk process.

Skillnad från en annan ljusbaserad antimikrobiell tillvägagångssätt, antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT), Abl-terapi kräver inte medverkan av en exogen photosensitizer. Allt som behövs för att träda i kraft är bestrålning av blått ljus; Därför är det enkelt och billigt. ABL receptorer är de endogena cellulära fotosensibilisatorer i bakterier, snarare än DNA. Således är Abl tros vara mycket mindre genotoxisk till värdceller än ultraviolett C (UVC) bestrålning, som direkt orsakar DNA-skada i värdceller.

I detta dokument presenterar vi ett protokoll för att bedöma effektiviteten av abl terapi för MDR Acinetobacter baumannii infektioner i en musmodell av brännskador. Genom att använda en konstruerad bioluminescent stam, kunde vi icke-invasivt övervaka graden av infektion i realtid i levande djur. Denna teknik är också ett effektivt verktyg för att övervaka den geografiska fördelningen av infektioner hos djur.

Introduction

Burn infektioner, som ofta rapporteras på grund av kutana termiska skador, fortsätter att vara en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet 1. Hantering av bränn infektioner har vidare äventyras av den ökande uppkomsten av multiresistenta (MDR) bakteriestammar 2 på grund av den massiva användningen av antibiotika. Ett viktigt MDR gramnegativa bakterier är Acinetobacter baumannii, som är känd för att vara associerad med de senaste strids sår och är resistent mot nästan alla tillgängliga antibiotika 3. Närvaron av biofilmer på den skadade foci har rapporterats 4, 5 och tros förvärra tolerans mot antibiotika och värdförsvar 6, 7, vilket orsakar ihållande infektioner 8, 9. Därför finns det en pressing behöver för att utveckla alternativa behandlingar. I den nyligen meddelade nationella strategin för bekämpning av antibiotikaresistenta bakterier, har utvecklingen av alternativa läkemedel mot antibiotika noterats som en åtgärd av regeringen i USA 10.

Ljus-baserade antimikrobiella metoder, såsom indikeras av namnet, kräver ljusbestrålning med eller utan andra medel. Dessa tillvägagångssätt inkluderar antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT), ultraviolett-C (UVC) bestrålning, och antimikrobiell blått ljus (ABL). I tidigare studier, har de visat lovande effektivitet i att döda MDR bakteriestammar 11, 12, 13. Bland de tre ljusbaserade metoder har Abl rönt allt större uppmärksamhet under de senaste åren på grund av dess inneboende antibakteriella egenskaper utan användning av fotosensibiliserare 14. i jämIson till APDT, Abl involverar endast användning av ljus, medan APDT kräver en kombination av ljus och en fotosensibilisator. Därför är Abl enkel och billig 14. I jämförelse med UVC, är Abl tros vara mycket mindre cytotoxiskt och genotoxisk till värdceller 15.

Målet med detta protokoll är att undersöka effektiviteten av abl för behandling av bränn infektioner orsakade av MDR A. baumannii i en musmodell. Vi använder självlysande patogena bakterier att utveckla nya musmodeller för bränn infektioner som tillåter icke-invasiv övervakning av den bakteriella belastningen i realtid. Jämfört med den traditionella metoden för kroppsvätska / vävnads provtagning och efterföljande plätering och koloniräkning 16 ger denna teknik korrekta resultat. Processen för vävnadsprovtagning skulle kunna införa en annan källa till experimentella fel. Eftersom den bakteriella luminescensintensiteten är linjärt proportionell mot de motsvponding bakteriella CFU 17, kan vi direkt mäta överlevnaden av bakterier efter en viss dos av ljusbestrålning. Genom att övervaka den bakteriella bördan i levande djur emot ljusbehandlingen i realtid kan kinetiken för bakteriedödande karakteriseras med hjälp av ett kraftigt minskat antal möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av bakteriekultur

  1. Lägga 7,5 ml Brain Heart Infusion (BHI) medium till ett 50 ml centrifugrör. Utsädes A. baumannii celler i BHI-medium och sedan inkubera A. baumannii kultur i en orbital inkubator (37 ° C) under 18 h.
  2. Centrifugera kulturen av celler vid 3500 x g under 5 min, avlägsna supernatanten och tvätta pellets i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  3. Re-suspendera bakterier pellets i färsk PBS och grundligt pipettera suspensionen.
  4. Samla 100 mikroliter av bakteriesuspensionen och göra en 1:10 spädning med användning av färsk PBS.
  5. Överföra spädning till en 1,5 ml halvmikro kyvett och mäta den optiska densiteten (OD) vid en våglängd av 600 nm (OD 600 nm).
  6. Beräkna OD 600-nm av den ursprungliga (outspädda) suspension i PBS i enlighet med den uppmätta OD 600 nm värdet för utspädning och utspädningsfaktorn (10).
  7. justera the ursprungliga suspensionen i PBS till OD 600 nm = 0,6 (vilket motsvarar en celldensitet av 10 8 CFU / ml).

2. musmodell av Burn infektion orsakad av Bioluminescent A. baumannii

  1. Användning vuxen BALB / c-möss i åldern 7-8 veckor och med en vikt av 17-19 g. Låt mössen att acklimatisera till laboratoriemiljön under minst 3 dagar före starten av experimentet. Upprätthålla mössen i en 12 h ljus / mörker-cykel enligt en rumstemperatur på 21 ℃ och ge dem mat och vatten ad libitum.
  2. Söva möss med en intraperitoneal injektion av en ketamin-xylazin cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Lätt röra palpebra varje mus med en bomullspinne; en frånvaro av ögonlocksreflexen antyder en lämplig anestesidjup. Täck mus ögonen med veterinär salva för att förhindra att ögonen från torrhet under narkos.
  3. Raka mössen på baksidan för att exponera så mycket hud som möjligt genom att använda en 50-blad hårklippare.
  4. Placera locket på en 35 mm Petri skål under de bakkroppen hos mössen för att hålla ryggen i ett relativt horisontellt läge.
  5. Koka vatten i en 250 ml bägare (80% full) med användning av en 10" x 10" , 220 VAC kokplatta. Doppa ett mässingsblock (1 cm sektion x 1 cm kors) i bägaren tills termisk jämvikt med vattnet uppnås. Termisk jämvikt vanligtvis tar <5 min och indikeras av återkokning av vattnet i bägaren.
  6. Före skapa brännskada, administrera förebyggande analgetika (en subkutan injektion av 0,1 mg / kg buprenorfin) för smärtlindring.
  7. Tio minuter efter de förebyggande analgetika, tryck försiktigt uppvärmt mässingsblocket till det rakade området på baksidan av mössen under 7 s för att inducera brännsår.
    OBS: För att undvika termisk skada på arbets personal bär termoresistenta handskar när du utför den brinnande förfarandet.
  8. Administrera 0,5 ml steril saltlösning genom subcutaneous injektion för att förhindra uttorkning.
  9. Fem minuter efter induktion av värmeskada, inokulera 50 mikroliter av bakteriesuspension innehållande 5 x 10 6 CFU i PBS på musen brännskador med användning av en pipett. Genom att förflytta en steril bomullstopp i ett sicksackrörelse på huden, smeta alikvoterna på de brännskador för att fördela de bakteriella cellerna i det brända området så jämnt som möjligt.
  10. Omedelbart efter bakteriell inokulering, utför bioluminescens avbildning för de infekterade brännskador, såsom beskrivs i avsnitt 4.
  11. Placera mössen på en vattenuppvärmd kirurgisk säng (37 ° C, återställningsområdet) tills mössen helt har återhämtat sig från anestesin. Huset mössen med ett maximalt antal 5 per bur i en biosäkerhetsnivå-2 djur rum.
  12. Administrera analgetika (subkutan injektion av 0,1 mg / kg buprenorfin) två gånger dagligen under de första tre dagarna efter brännskador.

3. Antimicrobial Blue Light terapi för en. & #160; baumannii infektion hos möss

  1. Starta ABL terapi vid 24 timmar efter bakteriell ympning.
  2. Använda en Ijusemitterande diod (LED) med en toppemission vid 415 nm för abl bestrålning. Mount LED på en värmesänka för att förhindra termiska effekter på den bestrålade området hos möss 18. Fäst ledde till en optisk stödstång med klipp kontakter för att göra det möjligt för LED att flytta upp och ner.
  3. Slå på strömmen / energimätaren och tryck på våglängden för att välja 415 nm. Återställa effekt / energimätaren för att subtrahera bakgrunden (omgivande ljus).
  4. Placera effekt / energimätaren precis under LED. Bär blått ljus-skyddsglasögon. Slå på LED-ljus och justera avståndet mellan LED-bländare (en lins som konvergerar ljuset från LED) och ljussensorn (2 cm i diameter) av effekt / energimätaren, så att ljusfläcken täcker hela området av ljussensorn.
  5. Noggrant ställa in LED-föraren och registrera avläsningen av power / energimätare. Beräkna irradiansen enligt läsningen: irradians = avläsning (W) / Area (cm 2). Justera irradiansen av LED till 100 mW / cm2 genom avstämning av LED-driv.
  6. Stäng av LED. Mäta avståndet mellan LED-öppningen och ljussensorn hos effekt / energimätaren.
  7. Söva möss med en intraperitoneal injektion av en ketamin-xylazin cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). En avsaknad av ögonlocksreflexen antyder en lämplig anestesidjup.
  8. Slumpmässigt dela mössen in i ett Abl-behandlade gruppen (n = 10) och en obehandlad kontrollgrupp (n = 10).
  9. För Abl-behandlade gruppen, täcker ögonen på möss med aluminiumfolie för att undvika överexponering för ljus. Placera musen brännskador direkt under LED, med locket på en 35-mm petri skål under musen buken för att hålla ryggen i ett horisontellt läge.
  10. Ersätta den effekt / energimätare nämns i steg 3,5 med en mus på en fyrkantig petri dish. Justera höjden på musen tillbaka till ett läge där avståndet mellan LED-bländare och ytan av musen brännskada är lika med den mellan den LED-bländare och nivån av ljussensorn hos effekt / energimätaren (såsom diskuteras i steg 3,5).
  11. Bestråla de infekterade brännskador vid en irradians på 100 mW / cm 2. Leverera abl i doser om 72 J / cm 2 tills en total dos av 360 J / cm 2 har nåtts (t.ex. 0, 72, 144, 216, 288 och 360 J / cm 2). Efter varje ljusdos, utför bioluminescens avbildning för mössen, vilket diskuteras i avsnitt 4.
  12. För den obehandlade kontrollgruppen, utföra bioluminescens avbildning av musen brännskador, såsom diskuteras i avsnitt 4, med användning av samma tidsintervall som användes för Abl-behandlade gruppen.
  13. Innan återhämtningen av mössen, placera mössen på vattnet uppvärmd kirurgisk säng för att förhindra värmeförlust och hypotermi. Observera aktiviteten och ögonlocksreflexer hos mössen tills återhämtningen. efter the återhämtning av mössen, hysa dem 2-3 per bur.
  14. Efter abl terapi, utföra bioluminescens avbildning, såsom diskuteras i avsnitt 4, dagligen under de första 3 dagarna och sedan varannan dag för att övervaka den tidsmässiga bio-bördan av infektioner hos möss.

4. Bioluminescence Imaging av infektioner hos möss

  1. Image de möss med användning av en låg-ljusavbildningssystem som inkluderar en intensifierad laddningskopplad anordning kamera, en kamera styrenhet, en provkammare, och en bildprocessor 19.
  2. Söva möss med en intraperitoneal injektion av en ketamin-xylazin cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Lätt röra ögonlocks av möss med en bomullspinne; en frånvaro av ögonlocksreflexen antyder en lämplig anestesidjup.
  3. Starta live bildprogram. I kontrollpanelen som visas klickar initieras. Vänta tills färgen på temperaturrutan blir grön, vilket indikerar att temperaturen av sceneni provkammaren har nått 37 ° C.
  4. Placera mössen på scenen (37 ° C) i provkammaren av avbildningssystemet, med de infekterade brännskador direkt under kameran.
    OBS! Bioluminiscens av bakterien kan minska när brinner blir torra. Därför rekommenderas det att återfukta musen brinner med PBS innan avbildning.
  5. I kontrollpanelen, sätta en bock bredvid "luminiscens." Välj "Automatisk exponering", så att exponeringstiden för avbildning kommer att optimeras genom levande bildbehandlingsprogram baseras på bioluminescens intensitet.
  6. Välj "C" från "Field of View" listrutan. Välj "Scan mitten av intervallet" för att låta programmet bestämma brännvidden. Sätt en bock intill överlagring.
  7. Klicka på "Hämta" för att ta bilden. I "Redigera Bild Label" klickar "OK," en "Bild Window" och "Toll Palette" visas.
  8. Ställ Auto ROI parametrar för automatisk val.
  9. Kvantifiera bioluminescens intensiteten som relativa luminiscens heter (RLU) och visa bioluminiscens i en falsk-färgskala som sträcker sig från rosa (mest intensiva) till blått (stone kraftigt) 19, 20.
  10. Beräkna överlevnadsfraktionen av bakterierna i mus brännskador vid varierande tidpunkter baserade på bioluminescens intensitetsanalys. Överlevnadsfraktion av bakterier vid en given tidpunkt = den bioluminescens intensiteten mäts vid denna tidpunkt / den bioluminescens intensitet mätt precis innan abl exponering 17.

5. Eutanasi av Möss

  1. Slutpunkterna för experimentet är som följer: (a) upplösning av infektionen, vilket framgår av förlusten av bioluminescens bestämd genom avbildning; (B) förekomst av systematiska infektioner såsom anges av spridningen av bioluminescens utanför den brända ären; (C) förlust av ≥15% kroppsvikt i jämförelse med normala åldersmatchade möss, eller som lider av smärta och ångest såsom indikeras av avsaknaden av känslighet för manuell stimulering, orörlighet, en oförmåga att äta eller dricka. Under studien om vi stöter på en situation där vi är osäker på om en mus har fullt uppnått status av döende, som beskrivs av vår definition, och / eller vi är osäker på om vi behöver avliva det, kommer vi att kontakta en CCM veterinärpersonal för en handlingsplan; (D) i övrigt mössen kommer att avlivas 30 dagar efter påbörjandet av studien.
  2. Flytta mössen till slutna burar specifikt för eutanasi och euthanize möss genom att leverera koldioxid (CO 2) komprimerad gas i burarna.
    1. Öppna CO 2 tank eller ventilregulator för att initiera gasflödet. Verifiera att regulatorn ska kunna visa rätt psi (pounds per square inch) baserat på instruktioner som anslås av enheten, och justera regulator till korrekt psi efter behov, typiskt inte högre än 5 psi.
    2. Fyll långsamt. Flödeshastigheten bör förskjuta inte mer än 30% av kammaren / bur volym per min (för en typisk mus bur, ~ 2 L / min; för en råtta bur, ~ 7,5 L / min).
    3. Vänta cirka 3-5 min för djuret att sluta röra sig eller andas; ögonen bör fastställas och utvidgas. Stänga av CO 2 tank eller regulatorventil för att stoppa flödet av CO 2.
    4. Se till att hjärtat inte slår genom att känna bröstet mellan tummen och pekfingret. Se till att det inte finns någon blinkreflex genom att trycka på ögongloben.
      1. Om det finns ett hjärtslag eller blinkreflex, upprepa eutanasi process eller använda sax för att öppna brösthålan för att skapa en pneumothorax (djuret måste vara icke-svarar på en tå nypa före utförandet detta förfarande).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. baumannii stam som vi använde är en MDR kliniskt isolat, såsom tidigare 12, 17 rapporterats. Bakteriestammen gjordes bioluminescent genom transfektion av luxCDABE opera 11. Figur 1A visar de successiva bakteriella luminiscens bilder från en representativ mus bränna infekterade med 5 x 10 6 A. baumannii och exponeras för en enda Abl exponering vid 24 h efter bakteriell inokulering. En gram-fläck av histologisk sektion av en representativ mushud bränna prov (skördade vid 24 h efter ympning) visade närvaron av A. baumannii biofilmer på ytan av den infekterade bränn (Figur 1B). Såsom visas i fig 1A, var den bakteriella luminescensen nästan utrotad efter en exponering av 360 J / cm 2 Abl levererades (60 min av bestrålning viden irradians på 100 mW / cm 2). Figur 1C är den dos-respons-kurvan för medelvärdet bakteriell luminescens från mus brännskador infekterade med 5 x 10 6 A. baumannii och behandlade med Abl vid 24 h efter bakteriell inokulering (n = 10). För att uppnå en 3-log 10 inaktivering av A. baumannii i mus brännskador, ca 360 J / cm 2 ABL krävdes. Den bakteriella luminescensen av musen bränner oexponerade till Abl var nästan oförändrad under en ekvivalent tidsperiod (data ej visade; P <0,001).

Figur 1
Figur 1: Abl Inaktivering av Bakterier i Infected Mouse Burns. (A) På varandra följande bakteriella luminiscens bilder från en representativ mus bränna infekterades med 5 x 10 6 CFU av A. baumannii och exponerades för 360 J / cm 2 Abl vid 24h efter bakteriell inokulering. (B) Gram-färgade histologisk sektion av en representativ mushud bränn visar närvaron av A. baumannii biofilmer (pilar) i musens brinna. Hudprovet skördades vid 24 h efter bakteriell inokulering. (C) Dos-responskurvan för medel bakteriell luminescens av mus brännskador infekterade med 5 x 10 6 A. baumannii och behandlades med en exponering av 360 J / cm 2 Abl vid 24 h (n = 10) efter bakteriell inokulering. Bars: standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abl är en ny metod för behandling av infektioner. Sedan dess verkningsmekanism är helt annorlunda än kemoterapi, är det mer av en sjukgymnastik. Det medel som förmedlar den antimikrobiella effekten är blått ljus bestrålning (400-470 nm). Med utvecklingen av blå lysdioder, fick vi tillgång till en effektiv och enkel ljusbaserad antimikrobiell metod för MDR infektioner.

I detta protokoll, har vi beskrivit utvecklingen av en musmodell för brännskadeinfektioner orsakade av en bioluminescent stam av MDR, A. baumannii. Med hjälp av självlysande bakterier, kan omfattningen av infektionen vara icke-invasivt övervakas i realtid i levande djur via självlysande avbildning. Användningen av konstruerade bioluminiscenta stammar av bakterier och låg-ljusbildteknik skapar en effektiv teknik för att övervaka infektioner i realtid under antimikrobiell behandling. Denna metod kan också användas i undersökningarna av infektionerorsakas av andra mikrobiella arter och belägna vid andra ställen. Förutom effekten bedömning av antimikrobiella metoder, kan denna metod även användas för att följa utvecklingen av infektionen.

Genom att använda denna musmodell visade vi att ABL (415 nm) framgångsrikt inaktive bakterier i etablerade infektioner (Figur 1A och C). Före abl terapi, kluster av bakterier observerades i de etablerade infektioner (Figur 1B), vilket är ett särdrag hos biofilmer. Biofilmer är mer toleranta mot traditionella antibiotika och värdens försvar jämfört med deras plankton motsvarigheter 6, 7 och är ofta förknippade med ihållande infektioner 8, 9. De representativa resultaten är lovande i att 415 nm ABL är biofilm penetrerande. Dessutom tillsammans med tidigare rapporter 29,30, 31, 32, våra resultat visar att effektiviteten hos Abl kvarstår oberoende av läkemedelsresistens profilen av bakterier.

Protokollet som beskrivs här involverar tre huvudförfaranden: (1) utveckling av en musmodell för brännskadeinfektioner, (2) Abl terapi, och (3) bioluminescens imaging. Samtidigt utveckla en musmodell av brännskadeinfektioner, noterade vi att det fanns flera faktorer som påverkar graden av infektion och den efterföljande effekten av Abl: (1) Bränntiden påverkar såret djup och spridning av bakterier. När brinntiden ökades från 3 till 7 s, den bakteriella luminescensen var mycket starkare (vilket indikerar en högre grad av infektion) vid 24 h efter ympning, och utrotning av infektion krävs mycket högre abl exponeringar (> 360 J / cm 2 ). (2) Ympen av bakterierna är en nyckelparameter för utveckling of infektioner. En högre bakteriell inokulum resulterar vanligen i en högre grad av infektion, under det att en tillräckligt låg inokulum misslyckas ofta att utveckla stabila infektioner hos möss. I det senare tillståndet blir bakteriell luminiscens vanligtvis odetekterbara strax efter bakteriell ympning. (3) Samverkan mellan bakterier och värdar beror på de bakteriearter. Vi använde också P. aeruginosa att utveckla en infektionsmodell. Vi funnit att, under samma betingelser (dvs. brinntid och bakteriell ymp), de infektioner orsakade av P. aeruginosa fortskred mycket snabbare än A. baumannii infektioner och sepsis var alltid observerades i möss inom 48 h efter ympning 25.

För genomförandet av Abl terapi, finns det flera viktiga punkter som måste åtgärdas: (1) Rätt ljus bestrålning krävs för maximerad effekt av Abl terapi. (2) Ytan av brinn i mössen should placeras så horisontellt som möjligt. Ett misslyckande att på lämpligt sätt placera brännytan kan äventyra effektiviteten av abl-terapi. (3) Under ljusexponering, föreslås det att ögonen på möss skyddas med aluminiumfolie, speciellt när en laser används som ljuskälla. (4) Under ljusexponering, bör försiktighet iakttas för att övervaka mössen i de fall de vakna upp ur narkosen. I detta fall bör en liten extra dos av narkosmedel administreras för att hålla djuren sövda. (5) Båda Abl-behandlade möss och obehandlade möss bör placeras på en värmebädden för att upprätthålla kroppstemperaturen när under anestesi. Under processen för bioluminescens avbildning skulle bioluminescens av bakterier minska när de brinner blir torra. Därför rekommenderas det att återfukta musen brinner med PBS innan avbildning.

Det finns också några begränsningar av de tekniker som diskuteras i detta protokoll: (1) I syfte att övervakningen av Electroluxnt av infektion i realtid, måste självlysande bakteriestammar användas. Därför, innan en klinisk stam kan testas i djurmodellen, måste den genetiskt modifieras genom transfektion av lux CDABE operonet 11. (2) Effektiviteten hos Abl är relaterad till våglängderna 33 och bakteriearter / stammar 34 användas. De blåa våglängder, tillsammans med andra parametrar, bör optimeras ytterligare för inaktivering av olika bakterie arter / stammar. (3) Vi undersökte endast ytliga infektioner hos möss. För djupa infektioner, kan lokal leverans av ABL inte att kunna nå infektioner, så interstitiell ljus leverans kan behövas 35. (4) Det finns en känslighet begränsning av avbildningssystemet, speciellt vid avbildning djupa infektioner 19. Som ett resultat, även när pixlarna i bioluminiscens är helt elimineras, kan det fortfarande finnas VIsom kan bakterieceller kvar, vilket gör bakteriell återväxt skall ske. En utökad exponering för Abl rekommenderas efter eliminering av bakteriell luminiscens för att förhindra bakterie återväxt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

Immunology Antimicrobial blått ljus multiresistens, Brännskada musmodell infektion bioluminescens avbildning
<em>In Vivo</em> Undersökning av Antimicrobial Blue Ljusterapi för multiresistent <em>Acinetobacter baumannii</em> Burn Infektioner Använda Bioluminescence Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter