Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging'i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 4, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

Abstract

enfeksiyonlar morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir olmaya devam yak. çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterinin artan çıkması geleneksel antibiyotik tedavilerinin sık arızalanması yol açmıştır. Alternatif tedavi edici acilen MDR bakterileri mücadele etmek gerekmektedir.

Yenilikçi bir antibiyotik olmayan bir yaklaşım, antimikrobiyal mavi ışık (ABL), MDR enfeksiyonlara karşı da umut verici etkinlik göstermiştir. ABL etki mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Genellikle, doğal olarak (örneğin, demir içermeyen porfirinler, flavinler, vb) bakteriler endojen ışığa kromoforlar oluşan fotokimyasal süreci boyunca da sitotoksik reaktif oksijen türlerini üreten Abl, (ROS) heyecanlandırdıklarını varsayılmaktadır.

başka bir ışık bazlı antimikrobiyel yaklaşım farklı olarak, antimikrobiyal fotodinamik tedavi (APDT), Abl tedavisi eksojen bir photosensitiz katılımını gerektirmezer. yürürlüğe girmesi için gereken tüm mavi ışığın ışınlama olduğu; bu nedenle, basit ve ucuzdur. Abl reseptörleri bakterilerde endojen hücresel ışığa yerine DNA'dır. Bu nedenle, abl daha az genotoksik doğrudan ana hücrelerde DNA hasarına neden olan ultraviyole-C (UVC) ışınlama, daha konukçu hücrelere bağlı olduğu düşünülmektedir.

Bu yazıda, yanık yaralanması, bir fare modelinde Acinetobacter baumannii enfeksiyonları için ABL tedavinin etkinliğini değerlendirmek için bir protokol mevcut. tasarlanmış bir biyolüminesans gerginlik kullanarak, invaziv olmayan yaşayan hayvanlarda gerçek zamanlı olarak enfeksiyon oranının saptanması için başardık. Bu teknik aynı zamanda hayvanlarda enfeksiyonların uzaysal dağılımının izlenmesi için etkili bir araçtır.

Introduction

Sık sık, çünkü kutanöz termal yaralanmalar bildirilmiştir Yanık infeksiyonları, morbidite ve mortalite 1'in önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir. Yanık enfeksiyonlarının tedavisi nedeniyle daha da antibiyotik büyük kullanımına çok ilaca dirençli (MDR) bakteri suşları 2 artan ortaya çıkması ile aşıldığını. Önemli bir MDR Gram-negatif bakteriler son savaş yaralarla ilişkili olduğu bilinen ve hemen hemen tüm mevcut antibiyotiklere 3 karşı dayanıklı olan Acinetobacter baumannii vardır. Yaralı odaklarda biyofilmin varlığı inatçı enfeksiyonlara 8, 9 neden, 4, 5 bildirilmiştir ve antibiyotik ve bir ev sahibi savunma 6, 7 tolerans alevlenmesine inanılmaktadır. Bu nedenle, bir ezme varg alternatif tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir. Mücadele antibiyotiğe dirençli bakterilere için yeni duyurulan Ulusal Strateji olarak, antibiyotiklere alternatif tedavilerin geliştirilmesi ABD'de 10 hükümeti tarafından bir eylem olarak kaydedilmiştir.

Işık-bazlı antimikrobiyel yaklaşımlar, adı ile belirtildiği üzere, ya da diğer maddeler olmadan hafif ışınlama gerektirir. Bu yaklaşımlar, antimikrobiyal, fotodinamik tedavi (APDT), ultraviyole-C (UVC) ışınlama ve antimikrobiyal mavi ışık (ABL) içerir. Önceki çalışmalarda, onlar MDR bakteri suşları 11, 12, 13 öldürme umut verici etkinliğini göstermiştir. Üç ışık bazlı yaklaşımlar arasında, ABL nedeniyle fotosentezcilerin 14 kullanılmaksızın kendi içsel antibakteriyel özellikleri son yıllarda oldukça dikkat çekti. karş-InAPDT ışık ve bir photosensitizer bir arada gerektirir ederken APDT için müsait, ABL sadece ışığın kullanımını gerektirir. Bu nedenle, abl basit ve 14 ucuzdur. UVC karşılaştırıldığında, Abl daha az sitotoksik ve hücreleri 15 barındırmak için genotoksik olduğuna inanılmaktadır.

Bu protokolün amacı, bir fare modelinde MDR A. baumannii kaynaklanan yanık enfeksiyonların tedavisi için ABL etkinliğini araştırmaktır. Biz gerçek zamanlı olarak bakteriyel yükün non-invazif izlenmesine olanak yanık enfeksiyonların yeni fare modelleri geliştirmek için biyolüminesans patojenik bakterileri kullanırlar. Vücut sıvısı / doku numune alma ve daha sonra kaplama ve koloni 16 sayım geleneksel yöntem ile karşılaştırıldığında, bu teknik, doğru sonuçlar sağlar. Doku örnekleme işlemi, deneysel hatanın başka bir kaynak getirebilir. Bakteriyel lüminesans şiddeti Corres doğrusal olarak orantılı olduğuBakteri CFU 17 göllenen, doğrudan ışık ışınlama belli bir dozdan sonra bakterilerin hayatta ölçebilir. gerçek zamanlı olarak açık tedavi gören hayvanlar canlı bakteri yükünü izleyerek, bakteri öldürme kinetikleri farelerde önemli ölçüde daha az sayıda kullanılarak karakterize edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bakteriyel Kültür 1. Hazırlık

  1. Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) 50 ml santrifüj tüpüne ortamın 7.5 ml ekleyin. Tohum A.baumannii BHI ortamı içinde hücre ve daha sonra 18 st için bir orbital kuluçka makinesi (37 ° C) A baumannii kültürü inkübe edin.
  2. 5 dakika boyunca 3,500 x g 'de hücre kültürü santrifüj süpernatant kaldırmak ve fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde peletler yıkayın.
  3. Taze PBS içerisinde bakteri granül yeniden askıya alma ve iyice süspansiyonu pipetle.
  4. Bakteriyel süspansiyon, 100 uL toplama ve taze PBS kullanılarak 1:10 seyrelti.
  5. 1.5 ml yarı mikro küvete seyreltme aktarın ve 600 nm (OD 600 nm) dalga boyunda optik yoğunluk (OD) ölçün.
  6. Seyreltme, ölçülmüş OD 600 nm değer ve seyreltme faktörü (10) 'e göre PBS içinde orijinal (seyreltilmemiş) süspansiyona OD 600 nm hesaplayın.
  7. th ayarlayınPBS içinde E, orijinal süspansiyon 600 nm (= 10 8 CFU / mL'lik bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir) 0.6 OD.

Biyoluminesen A tarafından neden Yanık Enfeksiyonu 2. Fare Modeli. baumannii

  1. Kullanım yetişkin dişi BALB / c fareleri, 7-8 hafta arası ve 17-19 g ağırlığındaki. Fareler deney başlamadan önce en az 3 gün boyunca laboratuar koşullara alışmasına izin verin. 21 ℃ arasında bir oda sıcaklığında, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde fareler, bakımını ve yiyecek ve su ad libitum beslendi.
  2. (- 20 mg / kg, 100 mg / kg); bir ketamin-ksilazin kokteyli ile karından bir enjeksiyonla fareler anestezi. Hafifçe bir pamuklu çubuk ile her bir farenin palpebra dokunun; palpebral refleksin yokluğu, uygun bir anestezi derinliği göstermektedir. Anestezi sırasında kuruluğa karşı gözleri önlemek için veteriner merhemi ile fare gözleri örtün.
  3. 5 numara kullanarak mümkün olduğunca fazla deriyi açığa arkasındaki fareler Tıraş0 bıçaklı saç kesme makinesi.
  4. nispeten yatay bir konumda sırtlarını tutmak için farelerin karın bölgeleri altında bir 35 mm Petri kabı kapağını yerleştirin.
  5. 250 mL'lik bir beher (% 80, tam) içerisinde kaynatın su 10" x 10" , 220 VAC ocak gözünü kullanılmıştır. su ile termal dengeye ulaşılana kadar beher içine pirinç bloğu (1 cm x 1 cm kesit alanı) daldırın. Termal denge genellikle <5 dakika sürer ve bir beher içerisinde suda yeniden kaynatma ile gösterilir.
  6. yanık oluşturmaya önce, ağrı tedavisi için rüçhan analjezikler (0.1 mg / kg buprenorfin deri altı enjeksiyonu) yönetmek.
  7. On dakika rüçhan analjezikler sonra yavaşça yanık yaraları indükleme 7 saniye boyunca farelerin sırtında, traş edilmiş bölgeye kadar ısıtılır pirinç blok basın.
    NOT: yakma işlemi yaparken çalışan personele termal yaralanmayı önlemek için, termal dirençli eldiven kullanın.
  8. subcutaneou, steril tuzlu su, 0.5 mL yönetmes enjeksiyon kaybını önlemek için.
  9. Termal yaralanma indüksiyon beş dakika sonra, bir pipet kullanılarak, fare yanıklar üzerine PBS içinde 5 x 10 6 CFU içeren bakteri süspansiyonu 50 uL inoküle. deri üzerinde zikzak hareket içinde bir steril pamuklu çubuk hareket ettirerek, mümkün olduğunca eşit olarak yanık bölgeye bakteriyel hücrelerin dağıtılması için yanık alikot smear.
  10. Bölüm 4'te tarif edildiği gibi hemen bakteriyel aşılamadan sonra, enfekte olmuş yanıklarda biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek.
  11. fareler, tamamen anestezi kurtarıldı kadar suda ısıtılmış cerrahi yatağa (37 ° C, geri kazanım bölgesi) fareler yerleştirin. House Biyolojik Güvenlik Seviye-2 hayvan odasında kafes başına 5 en fazla olan fareler.
  12. Yanık sonrasında ilk üç gün için günde iki kez analjezikler (0.1 mg / kg buprenorfin subkutan enjeksiyon) uygulayınız.

A. & # 3. Antimikrobiyal Mavi Işık Terapi160; Farelerde baumannii Enfeksiyon

  1. Bakteriyel aşılamadan 24 saat sonra abl tedaviyi başlatın.
  2. Abl ışınlama 415 nm 'de bir tepe emisyon ile bir ışık yayan diyot (LED) kullanın. Bir ısı dağıtma tertibatı üzerine düzenek LED farelerde 18 ışınlanmış alan üzerinde ısı etkileri önlemek için. LED yukarı ve aşağı hareket için izin klip konnektörleri ile bir optik destek çubuğuna LED sabitleyin.
  3. güç / enerji metre açın ve 415 nm dalga boyu seçmek için düğmesine basın. Arka plan (ortam ışığı) çıkarmak için güç / enerji sayacı sıfırlayın.
  4. Sağ LED altında güç / enerji ölçer yerleştirin. mavi ışık koruyucu gözlük takın. ışık noktasının tüm alanı kaplayacak şekilde LED ışık açın ve LED açıklık (LED'den gelen ışık yakınsayan lens) ve güç / enerji metre ışık sensörü (çapı 2 cm) arasındaki mesafeyi ayarlamak ışık sensörü.
  5. Dikkatle ayar LED sürücü ve Petrolkimya değeri kaydedildir / enerji sayacı. Okuma değerine göre tenvirini hesaplayın: Işınım = Okuma (W) / Alan (cm2). LED sürücü ayar yaparak 100 mW / cm2 için LED'in ışınımını ayarlayın.
  6. LED kapatın. LED açıklık ve güç / enerji metre ışık sensörü arasındaki mesafeyi ölçün.
  7. (- 20 mg / kg, 100 mg / kg); bir ketamin-ksilazin kokteyli ile karından bir enjeksiyonla fareler anestezi. palpebral refleksin yokluğu, uygun bir anestezi derinliği göstermektedir.
  8. Rastgele bir Abl ile tedavi edilen grupta (n = 10) ve işlenmemiş bir kontrol grubu (n = 10), içine fareler bölün.
  9. Abl ile tedavi edilen grup için, ışık fazla maruz önlemek için alüminyum folyo ile farelerin gözleri kapsamaktadır. yatay konumda sırtlarını tutmak için fare karın altında bir 35 mm Petri kabı kapağı ile doğrudan LED altında fare yanıklar yerleştirin.
  10. Kare petri di üzerine fare ile adım 3.5 belirtilen güç / enerji sayacı değiştirinsh. aşamasında anlatıldığı gibi LED açıklık ve fare yanığı yüzeyi arasındaki mesafe LED açıklık ve güç / enerji metre ışık sensörü (düzeyi arasında eşittir geri pozisyona fare yüksekliğini ayarlama 3.5).
  11. 100 mW / cm2 ışınımda enfekte yanıklar ışın tedavisi. J / cm2 ulaşılana 360 toplam doz kadar 72 J / cm2 arasında dozlarda Abl teslim (örneğin, 0, 72, 144, 216, 288 ve 360 J / cm2). Bölüm 4'te tarif edildiği gibi her bir ışık dozundan sonra, fareler için biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek.
  12. Bölüm 4'te tarif edildiği gibi tedavi edilmemiş kontrol grubu için, Abl ile tedavi edilen grup için kullanılan ile aynı zaman aralıkları kullanılarak, fare yanık biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek.
  13. Farelerin kurtarma önce, ısı kaybını ve hipotermi önlemek için su ısıtmalı cerrahi yatağa fareler yerleştirin. aktivitesi ve kurtarma kadar farelerin palpebral refleks dikkate alınmalıdır. th sonraFarelerin e geri kazanımı, onları kafes başına 2-3 ev.
  14. Farelerde enfeksiyonların zamansal biyo-yük izlemek için günaşırı ilk önce 3 gün süreyle günlük olarak, Bölüm 4'te tartışıldığı gibi Abl tedavisinden sonra, biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek.

Fareler İnfeksiyonun 4. Biyoparlaklık Görüntüleme

  1. Resim yoğun bir yük-akuplaj düzenli bir kamera, bir kamera kontrolörü, bir numune haznesi ve bir görüntü işlemcisi 19 içeren bir düşük ışık görüntüleme sistemi kullanılarak fareler.
  2. (- 20 mg / kg, 100 mg / kg); bir ketamin-ksilazin kokteyli ile karından bir enjeksiyonla fareler anestezi. Hafif bir pamuklu çubuk ile farelerin palpebral dokunun; palpebral refleksin yokluğu, uygun bir anestezi derinliği göstermektedir.
  3. Canlı görüntüleme yazılımını başlatın. görünen Kontrol panelinde, Başlat'ı tıklatın. Sıcaklık kutusunun rengi gösteren yeşil olana kadar bekleyin bu aşamasının sıcaklığıNumune odası içinde 37 ° C sıcaklığa ulaşmıştır.
  4. doğrudan kameraya altında enfekte yanıklar ile, görüntüleme sistemi numune bölmesi içinde aşama (37 ° C) fareler yerleştirin.
    NOT: yanıklar kuru olunca bakterilerin biyolüminesans azaltabilir. Nedenle, görüntüleme önce PBS ile fare yanıklara nemlendirilmesi önerilir.
  5. Kontrol panelinde, yanında bir onay işareti koymak "Lüminesans." görüntüleme için maruz kalma süresi biyolüminesans yoğunluğuna dayalı canlı görüntüleme yazılımı tarafından optimize edilecek, böylece "Otomatik pozlama" seçiniz.
  6. "Görüş Alanı" açılır listeden "C" yi seçin. Yazılım odak mesafesini belirlemek sağlamak için "Tarama orta menzil" seçeneğini seçin. Yerleşimi yanına bir onay işareti koyun.
  7. görüntü yakalamak için "Edinme" tıklayın. "Tamam;" "Edit Görüntü Etiketi" kutusunda, tıklayın Bir "Görüntü Penceresi" ve "Toll Paleti" görünecektir.
  8. Otomatik seçim için Otomatik ROI parametrelerini ayarlayın.
  9. Göreli ışık birimleri (RLU'lar) olarak biyoışıldama yoğunluğunu ölçmek ve (en yoğun) pembe mavisi (en yoğun) 19, 20 arasında bir ters renk ölçeğinde ışıldaması görüntüler.
  10. biyoışıldama yoğunluğu analizine göre Farklı zaman aralıklarında fare yanıklar içinde bakterilerin yaşamda kalma fraksiyonu hesaplayın. Belirli bir zaman noktasında, bakterilerin hayatta kalma fraksiyonu = o zaman noktasında ölçülen biyoışıldama yoğunluğu / biyoışıldama yoğunluğu doğru Abl maruz 17. önce ölçülmüştür.

Farelerin 5. Ötenazi

  1. aşağıdaki gibi Deneyin son noktaları şunlardır: görüntüleme ile belirlenen bio-ışıldamanın kaybının kanıtladığı enfeksiyon, (a) çözünürlüğü; (B) sistematik enfeksiyonların oluşumunu olan yanmış dışında biyolüminesans yayılması ile gösterildiği gibia; (C) Normal yaş uyumlu farelere kıyasla ≥15% vücut ağırlığı kaybı veya manuel stimülasyon, hareketsizlik, yemek veya içecek için bir yetersizlik yanıt eksikliği ile gösterildiği gibi ağrı ve sıkıntı acı. Çalışma sırasında, bizler tanımı gereği belirtilen bir fare tam can çekişen durumunu ulaşmıştır ve / veya biz bunu ötenazi gerekiyorsa emin olmadığından emin olduğu bir durumla karşılaşırsanız, bir CCM veteriner personel irtibata geçecektir eylem planı için; (D) olarak fareler 30 gün çalışmaya başlamasından sonra ötenazi olacaktır.
  2. Kafeslerine (CO2), sıkıştırılmış gazı, özellikle ötenazi kapalı kafeslere fareler konumu tekrar ve karbon dioksit verilmesi ile farelerin euthanize.
    1. Gaz akışını başlatmak için CO2 tankı veya kapak regülatörü açın. regülatör birimi tarafından yayınlanmıştır talimatlara göre doğru psi (pound inç kare başına) okur emin olun ve yeniden ayarlamakGerektiğinde, doğru psi tipik olarak daha yüksek psi 5'ten gulator.
    2. yavaşça doldurun. (; 7.5 lt / dak ~, bir sıçan kafes için ~ 2 L / dak, tipik bir fare kafes için) akış hızı, dakikada bölme / kafes hacminin en fazla% 30 yerini gerekir.
    3. Hareketli veya solunum durdurmak için hayvan için yaklaşık 3-5 dakika bekleyin; Gözleri sabit ve genişlemiş olmalıdır. CO 2 akışını durdurmak için CO 2 tankı veya regülatör valfini kapatın.
    4. Kalp başparmak ve işaret parmağı arasında göğüs hissederek yenerek olmadığından emin olun. gözü dokunarak hiçbir göz kırpma refleksi olmadığından emin olun.
      1. Bir sinyal ya da göz kırpma refleksinin var ise, ötenazi işlemi tekrar veya pnömotoraks (hayvan, bu işlemi gerçekleştirmek için önce bir ayak tutam olmayan duyarlı olmalıdır) oluşturmak amacıyla göğüs boşluğu açmak için makas kullanımı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Daha önce 12 17 bildirilen Kullandığımız A. baumannii suşu, bir MDR klinik bir izolattır. Bakteri soyu luxCDABE opera 11 transfeksiyonu ile biyo-lüminesan yapıldı. Şekil 1A, temsili bir fareden ardışık bakteriyel lüminesans görüntüleri, 5 x 10 6 A. baumannii ile enfekte yanık ve bakteriyel aşılama 24 saat sonra tek bir Abl maruz maruz gösterir. Temsili bir fare derisinin histolojik kesitin bir Gram leke (24 saat sonra aşılama hasat) örnek yanık enfekte yanık (Şekil 1B) yüzeyi üzerinde A.baumannii biyofilm varlığını göstermiştir. Şekil 1A 'da gösterildiği üzere, bakteriyel lüminesans neredeyse Abl (yayınlanan ışınlama 60 dk oldu 360 J / cm2'lik bir maruz kaldıktan sonra ortadan kaldırıldı100 mW / cm2) arasında bir ışık şiddeti. Şekil 1C, 5 x 10 6 A. baumannii ile enfekte edilmiş ve bakteriyel aşılamadan sonra (n = 10) 24 saat sonra Abl ile muamele ile fare yanıklar ortalama bakteri lüminesans doz-yanıt eğrisi olduğu. Elde etmek için, 3-log fare yanıklarda A. baumannii 10 etkisiz hale, yaklaşık 360 J / cm2 Abl gerekmiştir. Fare bakteriyel lüminesans (veriler gösterilmemiştir; P <0.001) Abl'ye maruz kalmamış bir zaman eşdeğer bir süre içinde hemen hemen değişmemiştir yakar.

Şekil 1
Şekil 1: Enfekte Fare Burns Bakterilerin Abl inaktivasyonu. (A), temsili bir fareden ardışık bakteriyel lüminesans görüntüleri A. baumannii, 5 x 10 6 CFU ile enfekte edilmiş ve 24 ° C'da 360 J / cm2 Abl maruz yanıkbakteriyel aşılama sonrasında saat. (B) fare yanığı A. baumannii biyofilm (oklar) varlığını gösteren temsili bir fare deri yanığı histolojik bölümü Gram boyalı. deri numunesi bakteriyel aşılama 24 saat sonra hasat edilmiştir. Fare ortalama bakteri lüminesans (C), doz-tepki eğrisi, bakteriyel aşılama 24 saat sonra (n = 10), 360 J / cm2 ABL bir maruz kalma ile 5 x 10 6 A. baumannii ile enfekte edilmiş ve tedavi yanıklar. Çubuklar: Standart sapma. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abl enfeksiyonları tedavi etmek için yeni bir yöntemdir. etki mekanizması kemoterapinin bu tamamen farklı olduğu için, bu fizik daha fazladır. antimikrobiyal etkiye aracılık madde mavi ışık ışınlama (400-470 nm). mavi LED'ler gelişmesiyle birlikte, biz MDR enfeksiyonları için etkili ve basit bir ışık tabanlı antimikrobiyal yaklaşımın erişim kazandı.

Bu protokol, biz MDR, A. baumannii bir biyolüminesans türünün neden yanık enfeksiyonların bir fare modelinin geliştirilmesini nitelendirdiler. biyolüminesans bakterilerin kullanımı ile enfeksiyonun ne kadar olabilir, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme yoluyla, canlı hayvanlarda gerçek zamanlı olarak izlenebilir. bakteri mühendisliği biyolüminesan suşları ve düşük ışıklı görüntüleme tekniği kullanımı antimikrobiyal tedavisi sırasında, gerçek zamanlı olarak enfeksiyonların kontrolü için etkili bir teknik oluşturur. Bu yöntem aynı zamanda enfeksiyonların araştırmalarda kullanılabilecekdiğer mikrobiyal türlerin neden olduğu ve diğer sitelerde bulunan. Antimikrobiyal yöntemlerin etkisinin değerlendirilmesi yanında, bu yöntem, aynı zamanda enfeksiyonun ilerlemesini izlemek için kullanılabilir.

Bu fare modeli kullanarak, Abl (415 nm), başarılı bir şekilde yerleşmiş enfeksiyonların (Şekil 1A ve C) 'de bakterileri inaktive olduğunu göstermiştir. Abl tedavisi öncesinde, bakteri kümeleri biyofilm bir özelliğidir yerleşmiş enfeksiyonların (Şekil 1B), gözlendi. Biyofilmler geleneksel antibiyotik ve onların planktonik muadillerine 6, 7 ile karşılaştırıldığında konak savunmasının daha hoşgörülü ve sık sık inatçı enfeksiyon 8, 9 ile ilişkilidir. temsili sonuçlar, 415 nm Abl umut vericidir biyofilm delici. Buna ek olarak, birlikte önceki raporlar 29 ile,30, 31, 32, sonuçlar ABL etkinliği bağımsız olarak bakterilerin ilaç-direnç profilinin devam ettiğini göstermektedir.

yanık enfeksiyonların bir fare modeli (1) gelişimi, (2) Abl tedavisi, ve (3) biyoışıldama görüntüleme: Burada açıklanan protokol üç ana prosedürleri içerir. (1) yanma süresi yara derinliği ve bakterilerin çoğalmasını etkileyen: yanık enfeksiyon modelindeki geliştirirken, enfeksiyonun derecesi ve ABL sonraki etkinliğini etkileyen çeşitli faktörler olduğunu belirtti. Yanma süresi, 3 ila 7 s'den yükseltildiği zaman, bakteriyel ışıldama 24 saat sonra aşılama de (yüksek bir enfeksiyon derecesini gösteren) çok daha güçlü ve enfeksiyonun yok edilmesi (> 360 J / cm2 kadar yüksek Abl maruz gerekli ). (2) bakterilerin aşı geliştirme o anahtar bir parametre olduğuf enfeksiyonları. yeterince düşük bir aşı sık farede kararlı enfeksiyonlarını geliştirme başarısız ise daha yüksek bir bakteriyel aşı genellikle, yüksek bir enfeksiyon ölçüde sonuçlanır. İkinci durumda, bakteriyel ışıma genellikle bakteriyel aşılamadan hemen sonra saptanamaz hale gelir. (3) bakteri ve bilgisayarlar arasında bir etkileşim bakteri türleri bağlıdır. Ayrıca bir enfeksiyon modeli geliştirmek için P. aeruginosa kullandı. Aynı koşullar altında (yani, zaman ve bakteriyel inokulum yakma), P. aeruginosa'nın neden olduğu enfeksiyonların A.baumannii enfeksiyonlara göre daha hızlı bir şekilde ilerledi, tespit ve sepsis, her zaman 48 saat sonra aşılama 25 içinde olan fareler içinde gözlemlenmiştir.

(1) doğru ışık ışınım Abl tedavisinin maksimize etki için gerekli olan: Abl tedavisinin uygulanması için, ele alınması gereken birkaç önemli nokta vardır. (2) yanık yüzey faredenhould mümkün olduğu gibi yatay olarak yerleştirilebilir. uygun yanık yüzeyi konumlandırmak için bir başarısızlık Abl tedavinin etkinliğini olumsuz etkileyebilir. (3) ışığa maruz kalma sırasında, farelerin gözleri bir lazer ışık kaynağı olarak kullanıldığı zaman, alüminyum folyo ile korunabilir önerilmektedir. (4) ışığa maruz kalma sırasında bakım Anestezi uyandırmak durumda fareler izlemek için dikkat edilmelidir. Bu durumda, anestezi küçük bir ek doz anestezi hayvanları tutmak için düzenlenmelidir. (5) Her iki fare Abl-tedavi edilen ve edilmeyen farelerin zaman anestezi altında vücut ısısını korumak için bir ısıtma yatağı üzerine yerleştirilmelidir. yanıklar, kuru hale gelir biyoışıldama görüntüleme işlemi sırasında, bakteri biyoışıldama azaltabilir. Nedenle, görüntüleme önce PBS ile fare yanıklara nemlendirilmesi önerilir.

Bu protokolde açıklanan teknikler bazı sınırlamalar vardır: (1) Exte izlenmesi amacıylagerçek zamanlı olarak enfeksiyon nt, biyo bakteri türleri kullanılmalıdır. Klinik bir suş hayvan modelinde test edilebilir önce, bu nedenle, genetik olarak lux CDABE operonu 11 transfeksiyonu ile değiştirilmesi gerekir. (2) ABL etkinliği dalga boyu 33 ve bakteri türlerinin ilgilidir / 34 kullanılır suşlarının. mavi dalga boyları, diğer parametrelerle birlikte, bundan başka, farklı bakteri türleri / suşları inaktive edilmesi için optimize edilmelidir. (3) sadece farelerde yüzeysel enfeksiyonlar incelenmiştir. Derin enfeksiyonlar için ABL topikal teslimat enfeksiyonları ulaşmak mümkün olmayabilir, bu nedenle interstisyel ışık teslim 35 gerekebilir. (4), derin enfeksiyonların 19 görüntüleme, özellikle görüntüleme sisteminin hassasiyeti sınırlama yoktur. Bunun bir sonucu olarak, biyolüminesans piksel tamamen ortadan bile, yine de vi olabilirmümkün bakteri hücreleri, bakteriyel yeniden büyüme oluşmasına izin kalmıştır. ABL için Uzatılmış poz bakteriyel oluşuma önlemek için bakteriyel lüminesans eleme sonrasında önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

İmmünoloji Sayı 122 Antimikrobiyal mavi ışık çok ilaca direnç, Yanık fare modeli enfeksiyon biyolüminesans görüntüleme
Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin <em>Vivo İncelenmesinin</em> <em>Acinetobacter baumannii</em> Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,… More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter