Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l' imagerie par bioluminescence

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997

Abstract

Brûler les infections continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité. L'émergence croissante des bactéries multirésistantes (MDR) a conduit à l'échec fréquent des traitements antibiotiques traditionnels. D'autres sont thérapeutiques d'urgence nécessaires pour lutter contre les bactéries MDR.

Une approche innovante non-antibiotique, bleu clair antimicrobien (ABL), a montré l'efficacité prometteuse contre les infections MDR. Le mécanisme d'action de ABL est pas encore bien compris. Il est généralement supposé que sont excités par ABL, qui à son tour se produisant naturellement chromophores photosensibilisants endogènes dans des bactéries (par exemple, les porphyrines libres de fer, les flavines, etc.) produit des espèces oxygénées réactives cytotoxiques (ROS) par l' intermédiaire d' un processus photochimique.

Contrairement à une autre approche antimicrobienne à base de lumière, la thérapie photodynamique antimicrobien (aPDT), la thérapie ABL ne nécessite pas l'intervention d'un photosensitiz exogèneer. Tout ce qu'il a besoin de prendre effet est l'irradiation de la lumière bleue; , Il est donc simple et peu coûteuse. Les récepteurs ABL sont les photosensibilisants endogènes cellulaires chez les bactéries, plutôt que de l'ADN. Ainsi, Abl est considérée comme beaucoup moins génotoxique à des cellules hôtes que ultraviolets C (UVC) irradiation, ce qui provoque directement des dommages de l'ADN dans des cellules hôtes.

Dans cet article, nous présentons un protocole pour évaluer l'efficacité du traitement ABL pour MDR Acinetobacter baumannii infections dans un modèle de souris de brûlure. En utilisant une souche bioluminescente d'ingénierie, nous avons pu surveiller de manière non invasive l'étendue de l'infection en temps réel chez les animaux vivants. Cette technique est également un outil efficace pour la surveillance de la distribution spatiale des infections chez les animaux.

Introduction

Brûler les infections, qui sont fréquemment signalées en raison de blessures thermiques cutanées, continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité 1. La prise en charge des infections de brûlures a été compromise par l'autre émergence croissante de souches bactériennes résistantes (MDR) 2 en raison de l'utilisation massive d'antibiotiques. Important MDR bactéries Gram-négatives est Acinetobacter baumannii, qui est connu pour être associé à des blessures de combat récentes et résiste à presque tous les antibiotiques disponibles 3. La présence de biofilms dans les foyers blessé a été rapporté 4, 5 et on pense à exacerber la tolérance aux antibiotiques et à la défense de l' hôte 6, 7, ce qui provoque des infections persistantes 8, 9. Par conséquent, il y a un outig besoin pour le développement de traitements alternatifs. Dans la Stratégie nationale de lutte contre les bactéries résistantes aux antibiotiques, le développement de thérapies alternatives aux antibiotiques récemment annoncé a été noté comme une action par le gouvernement des États-Unis 10.

approches antimicrobiens à base de lumière, comme il est indiqué par le nom, nécessitent une irradiation lumineuse avec ou sans autres agents. Ces approches comprennent la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT), aux ultraviolets C (UVC) irradiation, et la lumière bleue antimicrobien (ABL). Dans des études antérieures, ils ont montré l' efficacité prometteuse pour tuer des souches MDR bactériennes 11, 12, 13. Parmi les trois approches à base de lumière, ABL a attiré une attention croissante au cours des dernières années en raison de ses propriétés antibactériennes intrinsèques sans l'utilisation de photosensibilisants 14. en comparison à aPDT, ABL implique que l'utilisation de la lumière, alors que aPDT nécessite une combinaison de lumière et un photosensibilisant. Par conséquent, ABL est 14 simple et peu coûteux. Par rapport à UVC, ABL semble être beaucoup moins cytotoxique et génotoxique pour les cellules hôtes 15.

L'objectif de ce protocole est d'étudier l'efficacité de ABL pour le traitement des infections causées par des brûlures MDR A. baumannii dans un modèle de souris. Nous utilisons des bactéries pathogènes bioluminescentes pour développer de nouveaux modèles de souris d'infections de brûlures qui permettent la surveillance non invasive de la charge bactérienne en temps réel. Par rapport à la méthode traditionnelle de prélèvement de fluide corporel / tissulaire et le placage subséquent et une colonie de comptage 16, cette technique fournit des résultats précis. Le processus de prélèvement de tissu pourrait introduire une autre source de l'erreur expérimentale. Comme l'intensité de luminescence bactérienne est linéairement proportionnelle aux corresponding CFU 17 bactérienne, on peut mesurer directement la survie des bactéries après une certaine dose d'irradiation de lumière. En surveillant la charge bactérienne chez les animaux vivants recevant le traitement par la lumière en temps réel, la cinétique de la destruction des bactéries peuvent être caractérisés par un nombre significativement réduit de souris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de la culture bactérienne

  1. Ajouter 7,5 ml de Brain Heart Infusion (BHI) moyenne à un tube de centrifugation de 50 ml. Graine A. baumannii cellules dans le milieu BHI et ensuite incuber la culture de A. baumannii dans un incubateur orbital (37 ° C) pendant 18 h.
  2. Centrifuger la culture de cellules à 3500 x g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant et laver les pastilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  3. Re-suspendre les pastilles de bactéries dans du PBS frais et la pipette soigneusement la suspension.
  4. Recueillir 100 pi de la suspension bactérienne et de faire une dilution 1:10 en utilisant du PBS frais.
  5. Transférer la dilution dans une cuvette semi-micro de 1,5 ml et mesurer la densité optique (DO) à une longueur d'onde de 600 nm (600 nm DO).
  6. Calculer la suspension DO 600 nm de la (non dilué) d' origine dans du PBS en fonction de la valeur OD à 600 nm mesurée de la dilution et le facteur de dilution (10).
  7. régler ee suspension d' origine dans du PBS à DO 600 nm = 0,6 (correspondant à une densité cellulaire de 10 8 UFC / mL).

2. Souris modèle d'infection de brûlure causée par bioluminescente A. baumannii

  1. L'utilisation des souris femelles adultes BALB / c âgées de 7-8 semaines et pesant 17-19 g. Permettre aux souris de s'acclimater aux conditions de laboratoire pendant au moins 3 jours avant le début de l'expérience. Maintenir les souris dans un 12 h cycle lumière / obscurité sous une température ambiante de 21 ℃ et leur donner de la nourriture et de l' eau ad libitum.
  2. Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d'un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg / kg - 20 mg / kg). toucher légèrement le palpebra de chaque souris avec un coton-tige; une absence du réflexe palpébral suggère une profondeur d'anesthésie appropriée. Couvrir les yeux de souris avec une pommade vétérinaire pour éviter que les yeux de la sécheresse pendant l'anesthésie.
  3. Rasez les souris sur le dos pour exposer la peau autant que possible en utilisant un 50-lame tondeuse à cheveux.
  4. Placer le couvercle d'une boîte de Petri de 35 mm au-dessous de l'abdomen des souris afin de maintenir le dos dans une position relativement horizontale.
  5. Faire bouillir l'eau dans un bécher de 250 ml (80% complet) en utilisant un 10" x 10" , 220 VAC plaque chauffante. Immerger un bloc de laiton (1 cm x 1 cm de section transversale) dans le bêcher jusqu'à ce que l'équilibre thermique avec l'eau est atteinte. équilibration thermique prend habituellement <5 min et est indiquée par la ré-ébullition de l'eau dans le bêcher.
  6. Avant de créer la blessure de brûlure, d'administrer des analgésiques préventives (une injection sous-cutanée de 0,1 mg / kg) buprénorphine pour soulager la douleur.
  7. Dix minutes après que les analgésiques préventives, appuyer légèrement sur le bloc en laiton chauffé à la zone rasée du dos des souris pendant 7 s à induire des brûlures.
    REMARQUE: Pour éviter les blessures thermiques au personnel de travail, porter des gants résistants thermiques lors de l'exécution de la procédure de gravure.
  8. Administrer 0,5 ml de solution saline stérile à travers subcutaneouinjection s pour prévenir la déshydratation.
  9. Cinq minutes après l'induction de la lésion thermique, inoculer 50 ul de suspension bactérienne contenant 5 x 10 6 UFC dans du PBS sur les brûlures de la souris à l' aide d' une pipette. En déplaçant un coton-tige stérile dans un mouvement en zigzag sur la peau, enduire les aliquotes sur les brûlures de distribuer les cellules bactériennes dans la zone brûlée de manière aussi uniforme que possible.
  10. Immédiatement après l'inoculation bactérienne, effectuer l'imagerie par bioluminescence pour les brûlures infectées, comme décrit à la section 4.
  11. Placer la souris sur un lit chirurgical chauffé de l'eau (37 ° C, zone de récupération) jusqu'à ce que les souris ont complètement récupéré de l'anesthésie. Maison les souris avec un maximum de 5 par cage dans un niveau de biosécurité 2 salle d'animaux.
  12. Administrer des analgésiques (injection sous-cutanée de 0,1 mg / kg de buprénorphine) deux fois par jour pendant les trois premiers jours après la brûlure.

3. Antimicrobial Therapy Light Blue A. & #160; baumannii infection chez la souris

  1. Commencez la thérapie ABL à 24 h après l'inoculation bactérienne.
  2. Utiliser une diode électroluminescente (LED) avec une émission de crête à 415 nm pour l'irradiation Abl. Monter les LED sur un dissipateur de chaleur pour empêcher des effets thermiques sur la zone irradiée chez les souris 18. Fixer le conduit à une tige de support optique avec des connecteurs à pince pour permettre à la DEL de se déplacer vers le haut et vers le bas.
  3. Allumez la puissance / compteur d'énergie et appuyez sur le bouton pour sélectionner la longueur d'onde 415 nm. Réinitialiser le compteur de puissance / énergie pour soustraire l'arrière-plan (lumière ambiante).
  4. Placez le compteur d'alimentation / énergie juste sous la LED. Porter des lunettes bleu-clair de protection. Allumer la lumière LED et régler la distance entre l'ouverture de LED (une lentille qui converge la lumière provenant de la LED) et le capteur de lumière (2 cm de diamètre) de la puissance / compteur d'énergie de telle sorte que le spot lumineux couvre toute la zone de le capteur de lumière.
  5. air soigneusement le conducteur LED et enregistrer la lecture du Power / compteur d'énergie. Calculer l'éclairement énergétique en fonction de la lecture: Irradiance = lecture (W) / Surface (cm 2). Ajuster l'éclairement de la LED à 100 mW / cm2 en réglant la commande de DEL.
  6. Éteignez la LED. Mesurer la distance entre l'ouverture de LED et le détecteur de lumière de l'appareil de mesure de puissance / énergie.
  7. Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d'un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg / kg - 20 mg / kg). Une absence du réflexe palpébral suggère une profondeur d'anesthésie appropriée.
  8. Diviser au hasard les souris dans un groupe traité ABL (n = 10) et un groupe témoin non traité (n = 10).
  9. Pour le groupe traité Abl, couvrir les yeux de souris avec une feuille d'aluminium afin d'éviter une surexposition à la lumière. Placer les brûlures de la souris directement sous la LED, avec le couvercle d'une boîte de Pétri de 35 mm au-dessous de l'abdomen de la souris afin de maintenir le dos dans une position horizontale.
  10. Remplacer l'appareil de mesure de puissance / énergie mentionnée à l'étape 3.5 avec une souris sur un di de Pétri carréesh. Ajuster la hauteur de la souris à une position où la distance entre l'ouverture de LED et la surface de la brûlure de la souris est égale à celle entre l'ouverture de LED et le niveau du capteur de lumière de la puissance / compteur d'énergie (comme décrit dans l'étape 3.5).
  11. Irradier les brûlures infectées à un éclairement énergétique de 100 mW / cm 2. Livrer Abl à la dose de 72 J / cm 2 jusqu'à une dose totale de 360 J / cm 2 est atteinte (par exemple, 0, 72, 144, 216, 288 et 360 J / cm 2). Après chaque dose de lumière, effectuer l'imagerie par bioluminescence pour les souris, comme décrit dans la Section 4.
  12. Pour le groupe témoin non traité, effectuer l'imagerie par bioluminescence des brûlures de la souris, comme décrit dans la Section 4, en utilisant les mêmes intervalles de temps que ceux utilisés pour le groupe traité Abl.
  13. Avant la reprise des souris, placez les souris sur le lit chirurgical chauffé l'eau pour éviter la perte de chaleur et l'hypothermie. Observer l'activité et le réflexe palpébral de la souris jusqu'à ce que la récupération. Après lee récupération des souris, les loger 2-3 par cage.
  14. Après traitement Abl, effectuer l'imagerie par bioluminescence, tel que discuté dans la section 4, tous les jours pendant les 3 premiers jours, puis tous les deux jours pour surveiller la charge bio-temporelle des infections chez la souris.

4. Imagerie bioluminescence des infections chez la souris

  1. L' image des souris en utilisant un système d'imagerie à faible lumière qui comprend une caméra à dispositif à couplage de charge intensifié, un contrôleur de caméra, une chambre à échantillon, et un processeur d'image 19.
  2. Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d'un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg / kg - 20 mg / kg). toucher légèrement le palpébrale des souris avec un coton-tige; une absence du réflexe palpébral suggère une profondeur d'anesthésie appropriée.
  3. Démarrez le logiciel d'imagerie en direct. Dans le panneau de commande qui apparaît, cliquez sur Initialiser. Attendre jusqu'à ce que la couleur de la zone de température devient vert, ce qui indique que la température de l'étapedans la chambre d'échantillon a atteint 37 ° C.
  4. Placer les souris sur la platine (37 ° C) dans la chambre d'échantillon du système d'imagerie, les brûlures infectées directement sous la caméra.
    NOTE: La bioluminescence des bactéries pourrait diminuer lorsque les brûlures deviennent sèches. Par conséquent, il est recommandé d'hydrater les brûlures de la souris avec du PBS avant l'imagerie.
  5. Dans le panneau de commande, mettez une coche à côté de « Luminescence ». Sélectionnez « exposition automatique » de sorte que le temps d'exposition pour l'imagerie sera optimisée par le logiciel d'imagerie en temps réel en fonction de l'intensité de la bioluminescence.
  6. Sélectionnez la liste déroulante « C » du « champ de vision ». Sélectionnez l'option « Scan milieu de gamme » pour laisser le logiciel déterminer la distance focale. Mettez une coche à côté de recouvrement.
  7. Cliquez sur « Acquérir » pour capturer l'image. Dans la zone « Modifier l'image d'étiquette », cliquez sur « OK »; une « fenêtre d'image » et « Toll Palette » apparaît.
  8. Définir les paramètres ROI automatique pour l'auto-sélection.
  9. Quantifier l'intensité de la bioluminescence en unités de luminescence relatives (RLU) et afficher la bioluminescence dans une échelle en fausses couleurs allant du rose (plus intense) au bleu (moins intense) 19, 20.
  10. Calculer la fraction de survie des bactéries dans les brûlures de la souris à divers points de temps sur la base de l'analyse de l'intensité de la bioluminescence. La fraction de survie des bactéries à un point de temps donné = l'intensité de bioluminescence mesurée à ce point dans le temps / l'intensité de bioluminescence mesurée juste avant l' exposition 17 Abl.

5. L'euthanasie des souris

  1. Les paramètres de l'expérience sont les suivants: (a) la résolution de l'infection comme en témoigne la perte de bioluminescence tel que déterminé par imagerie; (B) apparition d'infections systématiques comme indiqué par la propagation de la bioluminescence à l'extérieur du brûlé sontune; (C) la perte de poids corporel ≥15% par rapport à des souris du même âge normaux, ou la douleur de la douleur et de détresse, comme indiqué par le manque de réactivité à la stimulation manuelle, l'immobilité, une incapacité à manger ou à boire. Au cours de l'étude, si nous rencontrons une situation où nous ne savons pas si une souris est complètement atteint l'état de moribond, comme indiqué par notre définition, et / ou nous ne savons pas si nous devons l'euthanasier, nous communiquerons avec un personnel vétérinaire CCM pour un plan d'action; (D) par ailleurs, les souris seront euthanasiés 30 jours après le début de l'étude.
  2. Relocaliser les souris dans des cages fermées spécifiquement pour l' euthanasie et l' euthanasie des souris en fournissant du dioxyde de carbone (CO 2) du gaz comprimé dans les cages.
    1. Ouvrir le réservoir de CO 2 ou d'un régulateur vanne pour initier l'écoulement de gaz. Vérifiez que le régulateur indique la bonne psi (livres par pouce carré) en fonction des instructions affichées par l'unité, et ajuster la regulator à la bonne psi au besoin, généralement pas supérieur à 5 livres par pouce carré.
    2. Remplir lentement. Le débit doit déplacer pas plus de 30% du volume chambre / cage par minute (pour un cage de la souris typique, ~ 2 L / min; pour une cage de rat, ~ 7,5 L / min).
    3. Attendre environ 3-5 min pour l'animal pour arrêter le déplacement ou la respiration; les yeux doivent être fixes et dilatées. Désactiver le réservoir de CO 2 ou de la vanne de régulation pour arrêter l'écoulement de CO 2.
    4. Assurez-vous que le cœur ne bat pas en sentant la poitrine entre le pouce et l'index. Assurez-vous qu'il n'y a pas réflexe de clignement en touchant le globe oculaire.
      1. S'il y a un rythme cardiaque ou réflexe clignement, répétez le processus d'euthanasie ou d'utiliser des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique pour créer un pneumothorax (l'animal doit être non sensible à un pincement de l'orteil avant d'effectuer cette procédure).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La souche de A. baumannii que nous avons utilisé est un isolat clinique MDR, tel que rapporté précédemment 12, 17. La souche bactérienne a été faite bioluminescente par la transfection de l' opéra luxCDABE 11. La figure 1A montre les images de luminescence bactérienne successives à partir d' une souris infectée représentant brûlent avec 5 x 10 6 A. baumannii et exposés à une seule exposition Abl à 24 h après l' inoculation bactérienne. Une coloration de Gram de la coupe histologique d'une peau de souris représentant brûler échantillon (récoltés après l'inoculation à 24 h) ont démontré la présence de A. baumannii biofilms sur la surface de la brûlure infectée (figure 1B). Comme le montre la Figure 1A, la luminescence bactérienne a été presque éradiquée après une exposition de 360 J / cm 2 Abl a été livré (60 min d'irradiation àun éclairement énergétique de 100 mW / cm 2). La figure 1C est la courbe dose-réponse de la luminescence bactérienne moyenne de brûlures de souris infectées avec 5 x 10 6 A. baumannii et traités avec Abl à 24 h après l' inoculation bactérienne (n = 10). Pour obtenir un 3-log inactivation de 10 A. baumannii des brûlures de souris, environ 360 J / cm 2 ABL était nécessaire. La luminescence bactérienne de la souris brûle non exposée à Abl est restée pratiquement inchangée pendant une période de temps équivalente (données non présentées; P <0,001).

Figure 1
Figure 1: ABL Inactivation des bactéries dans l' Infected Souris Burns. (A) des images de luminescence bactérienne successives à partir d' une souris représentative brûlent infectées avec 5 x 10 6 UFC de A. baumannii et exposés à 360 J / cm 2 à 24 ABLh après l'inoculation bactérienne. (B) coupe histologique coloration de Gram d'une brûlure de la peau de souris représentatif montrant la présence de A. baumannii biofilms (flèches) dans la brûlure de la souris. L'échantillon de peau a été récolté à 24 h après l'inoculation bactérienne. (C) Courbe dose-réponse de luminescence bactérienne moyenne des souris brûlures infectées avec 5 x 10 6 A. baumannii et traité avec une exposition de 360 J / cm 2 Abl à 24 h (n = 10) après l' inoculation bactérienne. Bars: écart-type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abl est un nouveau procédé pour traiter les infections. Depuis son mécanisme d'action est complètement différent de celui de la chimiothérapie, il est plus d'une physiothérapie. L'agent qui médie l'effet antimicrobien est l'irradiation de la lumière bleue (400-470 nm). Avec le développement de LED bleues, nous avons eu accès à une approche antimicrobienne à base de lumière simple et efficace pour les infections MDR.

Dans ce protocole, nous avons décrit le développement d'un modèle de souris d'infections de brûlures causées par une souche bioluminescente de MDR, A. baumannii. Avec l'utilisation de bactéries bioluminescentes, l'étendue de l'infection peut être non invasive surveillée en temps réel sur des animaux vivants par imagerie bioluminescente. L'utilisation de la technique des souches de bactéries bioluminescentes et l'imagerie à faible lumière d'ingénierie crée une technique efficace pour les infections de surveillance en temps réel au cours du traitement antimicrobien. Cette méthode peut également être utilisé dans les enquêtes sur les infectionscausées par d'autres espèces microbiennes et situées sur d'autres sites. Outre l'évaluation de l'efficacité des approches antimicrobiens, cette méthode peut également être utilisé pour suivre la progression de l'infection.

En utilisant ce modèle de souris, nous avons démontré que ABL (415 nm) des bactéries inactivées avec succès dans les infections établies (Figure 1A et C). Avant la thérapie Abl, des groupes de bactéries ont été observées dans les infections établies (Figure 1B), ce qui est une caractéristique de biofilms. Les biofilms sont plus tolérants aux antibiotiques traditionnels et défense de l' hôte par rapport à leurs homologues planctoniques 6, 7 et sont souvent associées à des infections persistantes 8, 9. Les résultats représentatifs sont prometteurs en ce que ABL 415 nm est biofilm pénétrant. De plus, ainsi que des rapports précédents 29,30, 31, 32, nos résultats démontrent que l'efficacité de ABL persiste quel que soit le profil de résistance aux médicaments des bactéries.

Le protocole décrit ici comporte trois procédures principales: (1) le développement d'un modèle de souris d'infections de brûlures, (2) Thérapie ABL, et (3) l'imagerie par bioluminescence. Tout en développant un modèle de souris d'infections de brûlure, nous avons constaté qu'il y avait plusieurs facteurs qui influent sur l'ampleur de l'infection et l'efficacité ultérieure de ABL: (1) Le temps de combustion affecte la profondeur de la plaie et la prolifération des bactéries. Lorsque la durée de combustion est augmentée de 3 à 7 s, la luminescence bactérienne était beaucoup plus forte ( ce qui indique un degré plus élevé d'infection) à 24 h après l'inoculation, et l'élimination de l' infection demandait beaucoup des expositions plus élevées ABL (> 360 J / cm 2 ). (2) L'inoculum des bactéries est un paramètre clé pour le développement oinfections f. Un inoculum bactérien plus élevé entraîne habituellement un degré plus élevé d'infection, tandis qu'un inoculum suffisamment faible ne fréquemment des infections stables chez les souris. Dans cette dernière condition, bactérienne luminescence devient habituellement indétectable peu après l'inoculation bactérienne. (3) L'interaction entre les bactéries et les hôtes dépend des espèces bactériennes. Nous avons également utilisé P. aeruginosa pour développer un modèle d'infection. Nous avons constaté que, dans les mêmes conditions (c. -à- temps de combustion et inoculum bactérien), les infections causées par P. aeruginosa ont progressé beaucoup plus rapidement que les infections A. baumannii, et la septicémie était toujours observée chez les souris dans les 48 h 25 après l'inoculation.

Pour l'exécution de la thérapie ABL, il y a plusieurs points importants qui doivent être abordées: (1) irradiance de lumière adéquate est nécessaire pour l'efficacité de la thérapie maximisée ABL. (2) La surface de la brûlure chez les souris should être placé le plus horizontalement possible. Un défaut de positionner correctement la surface de brûlure peut compromettre l'efficacité du traitement ABL. (3) Au cours de l'exposition de lumière, il est suggéré que les yeux de souris être protégées par une feuille d'aluminium, en particulier quand on utilise un laser comme source de lumière. (4) Lors exposition à la lumière, il faut prendre soin de surveiller les souris au cas où ils éveillent de l'anesthésie. Dans ce cas, une petite dose supplémentaire d'anesthésiques doit être administré pour garder les animaux anesthésiés. (5) Les deux ABL-souris traitées et les souris non traitées doivent être placées sur un lit de chauffage pour maintenir la température du corps lorsque sous anesthésie. Au cours du processus d'imagerie par bioluminescence, la bioluminescence des bactéries pourrait diminuer lorsque les brûlures deviennent sèches. Par conséquent, il est recommandé d'hydrater les brûlures de la souris avec du PBS avant l'imagerie.

Il y a aussi quelques limites des techniques décrites dans ce protocole: (1) Aux fins de la surveillance de l'extent d'infection en temps réel, les souches bactériennes bioluminescentes doit être utilisé. Par conséquent, avant une souche clinique peut être testé dans le modèle animal, il doit être modifié génétiquement par la transfection du lux opéron CDABE 11. (2) L'efficacité de l' ABL est en relation avec les longueurs d' onde 33 et les espèces bactériennes / 34 souches utilisées. Les longueurs d'onde bleues, ainsi que d'autres paramètres doivent être optimisées pour inactiver des différentes espèces bactériennes / souches. (3) Nous avons étudié que les infections superficielles chez les souris. Pour les infections profondes, l'administration topique de ABL peut ne pas être en mesure d'atteindre les infections, de sorte que la livraison de la lumière interstitielle peut être nécessaire 35. (4) Il y a une limite de sensibilité du système d'imagerie, en particulier lors de l' imagerie des infections profondes 19. Par conséquent, même lorsque les pixels de bioluminescence sont complètement éliminés, il pourrait y avoir encore vicapables cellules bactériennes restantes, ce qui permet la repousse des bactéries de se produire. Une exposition prolongée à ABL est recommandé après l'élimination de la luminescence bactérienne afin d'éviter la repousse bactérienne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

Immunology numéro 122 bleu clair antimicrobiens la résistance à des médicaments multiples, Brûlure modèle de la souris l'infection l'imagerie par bioluminescence
<em>In vivo</em> Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante <em>Acinetobacter baumannii</em> Gravez Infections En utilisant l&#39; imagerie par bioluminescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter