Abstract
Brennen Infektionen weiterhin eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das zunehmende Auftreten von mehrfach arzneimittelresistenten (MDR) Bakterien ist das häufige Versagen der traditionellen Antibiotika-Behandlungen geführt. Alternative Therapien sind dringend zu bekämpfen MDR Bakterien benötigt.
Ein innovativer nicht-Antibiotikum Ansatz, antimikrobielle blaues Licht (abl) hat vielversprechende Wirksamkeit gegen MDR-Infektionen gezeigt. Der Wirkmechanismus von Abl ist noch nicht gut verstanden. Es wird allgemein angenommen , dass natürlich endogenes Photosensibilisator Chromophore in Bakterien (beispielsweise eisenfreien Porphyrinen, Flavine, etc.) auftritt durch Abl angeregt werden, die wiederum zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch einen photochemischen Prozeß erzeugt.
Im Gegensatz zu anderen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz, antimikrobiellen Photodynamischen Therapie (aPDT), Abl Therapie erfordert nicht die Beteiligung eines exogenen photosensitizer. Alles was es braucht zu übernehmen ist die Bestrahlung mit blauem Licht; daher ist es einfach und kostengünstig. Die abl-Rezeptoren sind die endogenen zellulären Photosensibilisatoren in Bakterien, anstatt die DNA. Somit wird angenommen, dass viel weniger abl genotoxisch sein, Zellen als ultraviolett-C (UVC) Bestrahlung Host, die DNA-Schäden direkt in Wirtszellen verursacht.
In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll , um die Wirksamkeit der abl - Therapie für MDR Acinetobacter baumannii Infektionen in einem Mausmodell der Brandverletzung zu bewerten. einen angelegten Biolumineszenz-Stammes Durch den Einsatz konnten wir das Ausmaß der Infektion in Echtzeit in lebenden Tieren nicht-invasiv überwachen. Diese Technik ist auch ein wirksames Instrument für die räumliche Verteilung von Infektionen bei Tieren zu überwachen.
Introduction
Brennen Infektionen, die wegen der Haut thermischer Verletzungen häufig gemeldet werden, weiterhin 1 eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das Management von Burn - Infektionen wurde durch die zunehmende Auftreten von multiresistenten (MDR) Bakterienstämmen 2 aufgrund des massiven Einsatz von Antibiotika weiter beeinträchtigt. Ein wichtiger MDR Gram-negative Bakterien ist Acinetobacter baumannii, die bekanntlich mit den jüngsten Kampfwunden in Verbindung gebracht werden und ist beständig gegen fast alle verfügbaren Antibiotika 3. Die Anwesenheit von Biofilmen an dem verletzten Foci wird 4 berichtet, 5 und wird angenommen , dass die Toleranz gegenüber Antibiotika und Wirtsabwehr 6, 7, persistente Infektionen verursacht 8, 9 zu verstärken. Daher ist es eine pressing benötigt für die Entwicklung von alternativen Behandlungen. In der angekündigten Nationalen Strategie vor kurzem für die Bekämpfung von Antibiotika-resistenten Bakterien hat die Entwicklung alternativer Therapeutika gegen Antibiotika als eine Aktion von der Regierung der Vereinigten Staaten 10 zur Kenntnis genommen.
Licht basierende antimikrobielle Ansätze, wie der Name schon sagt, erfordern Lichtbestrahlung mit oder ohne andere Mittel. Diese Ansätze schließen antimikrobielle Photodynamischen Therapie (aPDT), UV-C (UVC) Bestrahlung und antimikrobielle blaues Licht (abl). In früheren Studien haben sie vielversprechende Wirksamkeit bei der Abtötung von MDR Bakterienstämmen 11, 12, 13 gezeigt. Unter den drei lichtbasierte Ansätze hat abl Aufmerksamkeit auf sich gezogen in den letzten Jahren zunehmend aufgrund ihrer intrinsischen antibakterielle Eigenschaften ohne die Verwendung von Photosensibilisatoren 14. in comparIson zu aPDT beinhaltet abl nur die Verwendung von Licht, während aPDT eine Kombination von Licht und Photosensibilisator erfordert. Daher ist abl einfach und kostengünstig 14. Im Vergleich zu UVC wird abl glaubt viel weniger zytotoxische und genotoxisch seine Wirtszellen 15.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit von Abl zur Behandlung von Verbrennungen Infektionen durch MDR A. baumannii in einem Mausmodell verursacht zu untersuchen. Wir verwenden Biolumineszenz-pathogene Bakterien neue Mausmodelle von Burn-Infektionen zu entwickeln, die der nicht-invasive Überwachung der bakteriellen Belastung in Echtzeit ermöglichen. Im Vergleich zu der traditionellen Methode der Körperflüssigkeit / Gewebe - Probennahme und anschließende Plattieren und Koloniezählung 16, liefert diese Technik eines genauen Ergebnisse. Der Prozess der Gewebeprobenentnahme kann eine andere Quelle von experimentellen Fehler einzuführen. Da die bakterielle ist Lumineszenzintensität zu dem entspre linear proportionalPonding 17 CFU Bakterien, können wir das Überleben der Bakterien nach einer bestimmten Dosis der Bestrahlung mit Licht direkt messen. Durch die Überwachung kann die bakterielle Belastung in lebenden Tieren, das Licht Behandlung in Echtzeit empfängt, die Kinetik der Bakterienabtötung charakterisiert wird eine deutlich reduzierte Anzahl von Mäusen.
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Protocol
1. Herstellung von Bakterienkultur
- 7.5 ml Brain Heart Infusion (BHI) -Medium in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Seed A. baumannii Zellen in dem BHI - Medium und dann Inkubieren der Kultur A. baumannii in einem Orbital - Inkubator (37 ° C) für 18 h.
- Zentrifugieren der Kultur von Zellen bei 3.500 × g für 5 min, um den Überstand entfernen, und wasche die Pellets in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
- Re-suspend der Bakterienpellets in frischem PBS und gründlich die Suspension pipettieren.
- Sammeln Sie 100 ul der Bakteriensuspension und macht eine Verdünnung von 1:10 mit frischem PBS.
- Übertragen der Verdünnung in ein 1,5 ml halb Mikroküvette und Messen der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600 nm).
- Berechnen Sie die OD 600 nm der ursprünglichen (unverdünnt) Suspension in PBS entsprechend den gemessenen OD600 nm Wert der Verdünnung und der Verdünnungsfaktor (10).
- Stellen Sie the ursprüngliche Suspension in PBS 600-nm bis OD = 0,6 (auf eine Zelldichte von 10 8 CFU / ml entspricht).
2. Maus - Modell der Burn - Infektion verursacht durch Biolumineszenz A. baumannii
- Verwenden erwachsene weibliche Balb / c-Mäuse im Alter von 7-8 Wochen und mit einem Gewicht von 17-19 g. Lassen Sie die Mäuse für mindestens 3 Tage vor Beginn des Experiments an die Laborbedingungen akklimatisiert. Pflegen Sie die Mäuse in einem 12 h Licht / Dunkel - Zyklus unter einer Raumtemperatur von 21 ℃ und gibt ihnen Nahrung und Wasser ad libitum.
- Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). leicht berühren die Palpebra jeder Maus mit einem Wattestäbchen; ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe. Deckt die Maus Augen mit VET Salbe auf die Augen vor dem Austrocknen während der Anästhesie zu verhindern.
- Shave die Mäuse auf der Rückseite so viel Haut wie möglich zu belichten durch Verwendung eines 50-Blatt Haarschneider.
- Setzen Sie den Deckel einer 35 mm-Petrischale unter den Bäuchen der Mäuse in einer relativ horizontalen Position mit dem Rücken zu halten.
- Boil Wasser in einem 250 ml Becherglas (80% gefüllt) unter Verwendung einer 10" x 10" , 220 VAC Heizplatte. Tauchen einen Messingblock (1 cm x 1 cm Querschnitt) in den Becher bis zum thermischen Gleichgewicht mit dem Wasser erreicht ist. Thermische Äquilibrierung dauert in der Regel <5 min und wird durch den erneuten Sieden des Wassers im Becherglas angegeben.
- Vor der Brandverletzung zu schaffen, verwalten präemptive Analgetika (eine subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin) zur Schmerzlinderung.
- Zehn Minuten nach der präemptive Analgetika, drücken Sie vorsichtig den beheizten Messingblock auf die rasierte Fläche auf der Rückseite der Mäuse für 7 s Brandwunden zu induzieren.
HINWEIS: Um die thermische Schädigung des Arbeitspersonal, trägt wärmebeständige Handschuhe, wenn die Durchführung den Brennvorganges zu vermeiden. - Administrieren 0,5 ml steriler Kochsalzlösung durch subcutaneous Injektion zu verhindern Austrocknung.
- Fünf Minuten nach der Induktion der thermischen Verletzung, beimpfen 50 & mgr; l der Bakteriensuspension mit 5 x 10 6 CFU in PBS auf die Maus Verbrennungen mit einer Pipette. Durch Bewegen einen sterilen Baumwolltupfer in einer Zick-Zack-Bewegung auf der Haut, schmieren die Aliquote auf den Verbrennungen so gleichmäßig wie möglich um die Bakterienzellen in dem verbrannten Bereich zu verteilen.
- Unmittelbar nach dem bakteriellen Inokulation Biolumineszenz-Bildgebung für die infizierte Verbrennungen zuführen, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Platzieren Sie die Mäuse auf einem wasserbeheizten chirurgisches Bett (37 ° C, Wiederherstellungsbereich), bis die Mäuse vollständig von der Anästhesie erholt haben. Haus der Mäuse mit einer maximalen Anzahl von 5 pro Käfig in einem Biosafety Level-2 Tierraum.
- Verabreichen Analgetika (subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin) zweimal täglich für die ersten drei Tage nach der Brandverletzung.
3. Antimikrobielle Blau - Licht - Therapie für A. & #160; baumannii Infektion bei Mäusen
- Starten Sie abl Therapie bei 24 h nach Bakterieninokulation.
- Verwenden, um eine Leuchtdiode (LED) mit einer Spitzenemission bei 415 nm für die abl-Bestrahlung. Die LED auf einem Kühlkörper Mount in Mäusen 18 thermische Effekte auf dem bestrahlten Bereich zu verhindern. Fix die LED auf eine optische Haltestange mit Clip-Anschlüssen der LED zu ermöglichen, nach oben und unten.
- Schalten Sie die Energie / Energiezähler und drücken Sie die Taste Wellenlänge 415 nm zu wählen. Setzen Sie den Strom- / Energiezähler den Hintergrund (Umgebungslicht) zu subtrahieren.
- Setzen Sie die Strom- / Energiezähler direkt unter der LED. Tragen Sie blaues Licht Schutzbrille. Schalten Sie das LED-Licht und stellen den Abstand zwischen der LED-Öffnung (eine Linse, die das Licht von der LED konvergiert) und dem Lichtsensor (2 cm Durchmesser) der Strom- / Energiezähler, so dass der Lichtfleck bedeckt den gesamten Bereich der der Lichtsensor.
- Sorgfältig Melodie der LED-Treiber und das Lesen des powe aufzeichnenr / Energiezähler. Berechnen der Bestrahlungsstärke nach dem Lesen: Bestrahlungsstärke = Lese (W) / Fläche (cm 2) ist . Stellen Sie die Bestrahlungsstärke der LED bis 100 mW / cm2 durch die LED-Treiber-Tuning.
- Schalten Sie die LED. Den Abstand zwischen der LED-Apertur und dem Lichtsensor der Leistung / Energiezähler.
- Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe.
- Dividieren zufall die Mäuse in eine abl-behandelten Gruppe (n = 10) und eine unbehandelte Kontrollgruppe (n = 10).
- Für die abl-behandelten Gruppe, decken die Augen von Mäusen mit einer Aluminiumfolie übermäßiges Licht zu vermeiden. Platzieren Sie die Maus Verbrennungen direkt unter der LED, mit dem Deckel einer 35-mm-Petrischale unter dem Maus Abdomens ihren Rücken in einer horizontalen Position zu halten.
- Ersetzen die Leistungs- / Energiezähler in Schritt 3.5 erwähnt mit einer Maus auf einem quadratischen di PetriSch. Stellen Sie die Höhe der Maus wieder in eine Position, wo der Abstand zwischen der LED-Öffnung und der Oberfläche der Maus burn ist gleich die zwischen der LED-Öffnung und dem Pegel des Lichtsensors der Strom- / Energiezähler (wie in Schritt diskutiert 3.5).
- Bestrahlen der infizierten Verbrennungen bei einer Strahlungsintensität von 100 mW / cm 2. Liefern abl in Dosen von 72 J / cm 2 bis zu einer Gesamtdosis von 360 J / cm 2 erreicht ist (beispielsweise 0, 72, 144, 216, 288 und 360 J / cm 2). Nach jeder Lichtdosis, führen Biolumineszenz-Bildgebung für die Mäuse, wie in Abschnitt 4 besprochen.
- Für die unbehandelte Kontrollgruppe, Biolumineszenz-Bildgebung der Maus Verbrennungen zuführen, wie in Abschnitt 4 beschrieben, wobei die gleichen Zeitintervalle, wie für die abl-behandelten Gruppe verwendet.
- Vor der Wiederherstellung der Mäuse, legen Sie die Mäuse auf dem Wasser heizt chirurgische Bett Wärmeverlust und Unterkühlung zu verhindern. Beachten Sie die Aktivität und die Augenlidreflexe der Mäuse bis zur Genesung. Nach The Erholung der Mäuse, beherbergen sie 2-3 pro Käfig.
- Nach Abl-Therapie, Biolumineszenz-Bildgebung durchführt, wie in Abschnitt 4, täglich für die ersten 3 Tage und dann an wechselnden Tagen diskutierten die zeitliche bio-Belastung von Infektionen in Mäusen zu überwachen.
4. Biolumineszenz-Bildgebung von Infektionen bei Mäusen
- Bild der Mäuse ein Schwachlichtabbildungssystem , das eine verstärkte ladungsgekoppeltes Bauelement - Kamera 19, eine Kamerasteuereinrichtung, eine Probenkammer, und einen Bildprozessor umfasst.
- Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). leicht berühren die Augenlid der Mäuse mit einem Wattestäbchen; ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe.
- Starten Sie die Live-Imaging-Software. In der Systemsteuerung, das angezeigt wird, klicken Sie auf Initialisieren. Warten, bis sich die Farbe des Temperatur-Box grün wird, das anzeigt, dass die Temperatur der Stufein der Probenkammer hat 37 ° C erreicht.
- Platzieren Sie die Mäuse auf der Bühne (37 ° C) in der Probenkammer des Bildgebungssystems, mit den infizierten Verbrennungen direkt unter der Kamera.
HINWEIS: Die Biolumineszenz der Bakterien könnte verringern, wenn die Verbrennungen trocken werden. Daher ist es empfehlenswert, bevor die Abbildung der Maus brennt mit PBS zu befeuchten. - In der Systemsteuerung, setzen Sie ein Häkchen neben „Lumineszenz“. Wählen Sie „Automatische Belichtung“, so dass die Belichtungszeit für die Bildgebung wird durch die Live-Imaging-Software auf der Biolumineszenz Intensität optimal angepasst werden.
- Wählen Sie "C" aus der "Field of View" Drop-Down-Liste. Wählen Sie die „Scan im mittleren Bereich“ Option die Software bestimmt die Brennweite zu lassen. Setzen Sie ein Häkchen neben Overlay.
- Klicken Sie auf „Erfassen“, um das Bild zu erfassen. In der „Bild bearbeiten Etikett“ -Box, klicken Sie auf „OK“; ein „Bildfenster“ und „Toll Palette“ erscheinen.
- Set Auto ROI Parameter für die automatische Auswahl.
- Quantifizierung der Biolumineszenz - Intensität als relative Lumineszenz - Einheiten (RLU) und zeigt die Biolumineszenz in einer Falschfarbenskala von rosa Bereich (intensivsten) bis blau ( am wenigsten intensiv) 19, 20.
- Berechnen der Überlebensfraktion der Bakterien in Maus Verbrennungen an Stellen unterschiedlicher Zeit basierend auf Biolumineszenz Intensitätsanalyse. Der Überlebensanteil von Bakterien zu einem gegebenen Zeitpunkt der Biolumineszenz = Intensität zu diesem Zeitpunkt / die Biolumineszenz gemessene Intensität gemessen unmittelbar vor abl Belichtungs 17.
5. Euthanasie der Mäuse
- Die Endpunkte des Experiments sind wie folgt: (a) Auflösung der Infektion, wie durch den Verlust der Biolumineszenz nachgewiesen, wie durch Bildgebung bestimmt; (B) Auftreten von systematische Infektionen, wie durch die Verbreitung von Biolumineszenz außerhalb des verbrannten angegeben sindein; (C) Verlust von ≥15% des Körpergewicht im Vergleich zu normalen altersangepassten Mäusen oder das Leid von Schmerzen und Leiden, wie durch das Fehlen einer Reaktion auf manuelle Stimulation angegeben, Immobilität, die Unfähigkeit, zu essen oder zu trinken. Während der Studie, wenn wir in eine Situation kommen, wo wir nicht sicher sind, ob eine Maus vollständig den Status der moribund erreicht hat, wie nach unserer Definition umrissen, und / oder sind wir nicht sicher, ob wir es einschläfern müssen, werden wir einen CCM Veterinärpersonal kontaktieren für einen Aktionsplan; (D) sonst die Mäuse werden 30 Tage nach dem Beginn der Studie eingeschläfert.
- Verlagern die Mäuse in geschlossenen Käfigen speziell für Euthanasie und die Mäuse euthanize von Kohlendioxid (CO 2) komprimiertes Gas in den Käfigen zu liefern.
- Öffnen des CO 2 -Tank oder Ventilregler den Gasstrom einzuleiten. Stellen Sie sicher, dass der Regler den richtigen psi liest (Pfund pro Quadratzoll), basierend auf Anweisungen von der Einheit geschrieben, und stellen Sie die Wiedergulator auf den richtigen psi je nach Bedarf, in der Regel nicht höher als 5 psi.
- Füllen Sie langsam. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht mehr als 30% der Kammer / Käfig Volumen pro min (, für eine Rattenkäfig, ~ 7,5 L / min für eine typische Maus Käfig, ~ 2 L / min) verdrängen.
- Wartezeit von ca. 3-5 min für das Tier zu stoppen, zu bewegen oder zu atmen; Die Augen sollten festgelegt und erweitert werden. Ausschalten CO 2 -Tank oder Regulierventil die Strömung von CO 2 zu stoppen.
- Stellen Sie sicher, dass das Herz durch das Gefühl der Brust zwischen Daumen und Zeigefinger nicht zu schlagen ist. Stellen Sie sicher, dass es keine Blinkreflex ist der Augapfel durch Berühren.
- Wenn es ein Herzschlag oder Lidschlussreflexes ist, wiederholen Sie die Euthanasie Prozess oder eine Schere verwenden, um die Brusthöhle zu öffnen, einen Pneumothorax zu schaffen (das Tier muss vor der Durchführung dieses Verfahrens zu einem toe pinch nicht reagieren).
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Representative Results
Die A. baumannii Belastung , die wir verwenden , ist ein klinisches Isolat MDR, wie zuvor berichtete , 12, 17. Der Bakterienstamm wurde Biolumineszenz durch die Transfektion von luxCDABE Opera 11 hergestellt. 1A zeigt die aufeinanderfolgenden Bilder bakterielle Lumineszenz aus einer repräsentativen Maus infizierten brennen mit 5 x 10 6 A. baumannii und ausgesetzt an eine einzelne abl Exposition bei 24 h nach der Inokulation Bakterien. Ein Gram-Fleck des histologischen Schnitts eines repräsentativen Mäusehaut verbrennen Probe (bei 24 h nach der Beimpfung geerntet) zeigte die Anwesenheit von A. baumannii Biofilm auf der Oberfläche der infizierten Verbrennungen (1B). Wie in 1A gezeigt, wurde die bakterielle Lumineszenz fast nach einer Belichtung von 360 J / cm 2 ausgemerzt abl geliefert wurde (60 min bei der Bestrahlungeine Bestrahlungsstärke von 100 mW / cm 2). 1C ist die Dosis-Wirkungs-Kurve der mittleren bakteriellen Lumineszenz von Verbrennungen Maus infizierten mit 5 x 10 6 A. baumannii und mit Abl bei 24 h nach der Inokulation bakterieller (n = 10). In einen 3-log 10 Inaktivierung von A. baumannii in Maus Verbrennungen zu erreichen, etwa 360 J / cm 2 abl erforderlich war. Die bakterielle Lumineszenz der Maus brennt nicht belichtet abl während einer äquivalenten Zeitraum nahezu unverändert blieb (Daten nicht gezeigt; P <0,001).
Abbildung 1: abl Inaktivierung von Bakterien in infizierten Maus Verbrennungen. (A) Aufeinanderfolgende bakterielle Lumineszenz von Bildern von einem repräsentativen Maus mit 5 x 10 6 CFU von A. baumannii infizierten Verbrennungen und exponierten bis 360 J / cm 2 bei 24 ablh nach Bakterieninokulation. (B) Gram-gefärbten histologischen Schnitt einer repräsentativen Mäusehaut verbrennen die Anwesenheit von A. baumannii Biofilmen (Pfeile) in der Maus - burn zeigt. Die Hautprobe wurde bei 24 h nach der Beimpfung geerntet Bakterien. (C) Dosis-Wirkungs-Kurve der mittleren bakterielle Lumineszenz von Maus brennt mit 5 x 10 6 A. baumannii infiziert und behandelt mit einer Belichtung von 360 J / cm 2 Abl bei 24 h (n = 10) nach bakterieller Inokulation. Bars: Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Abl ist ein neues Verfahren zur Behandlung von Infektionen. Seit seinem Wirkungsmechanismus von der Chemotherapie völlig anders ist, ist es eher eine Physiotherapie. Das Mittel, das die antimikrobielle Wirkung vermittelt ist blaue Licht-Bestrahlung (400-470 nm). Mit der Entwicklung von blauen LEDs, gewannen wir den Zugang zu einem effektiven und einfachen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz für MDR-Infektionen.
In diesem Protokoll haben wir die Entwicklung eines Mausmodell von burn - Infektionen durch einen Biolumineszenz - Stamm von MDR, A. baumannii verursacht beschrieben. Mit der Verwendung von Biolumineszenz Bakterien, kann das Ausmaß der Infektion nicht-invasiv in Echtzeit überwacht Tiere über Biolumineszenz-Bildgebung in lebenden. Die Verwendung von technisch biolumineszierenden Bakterienstämmen und der Niederlichtabbildungstechnik schafft eine effiziente Technik für die Infektion in Echtzeit während der antimikrobiellen Therapie zu überwachen. Dieses Verfahren kann auch in den Untersuchungen von Infektionen verwendet werdenverursacht durch andere mikrobielle Spezies und an anderen Standorten. Neben der Wirksamkeitsbewertung von antimikrobiellen Ansätzen, kann dieses Verfahren auch den Fortschritt der Infektion verfolgen verwendet werden.
Durch die Verwendung dieses Maus - Modell konnte gezeigt werden , dass abl (415 nm) erfolgreich Bakterien in etablierten Infektionen (1A und C) inaktiviert. Vor der ABL- Therapie Cluster von Bakterien wurden in den etablierten Infektionen (1B) beobachtet, was ein Merkmal von Biofilmen ist. Biofilme sind toleranter traditionellen Antibiotika und der Wirtsabwehr im Vergleich zu ihren Pendants Plankton 6, 7 und sind häufig mit persistierenden Infektionen 8, 9 verbunden. Die repräsentativen Ergebnisse sind vielversprechend, dass 415-nm-abl ist Biofilm-eindringt. Darüber hinaus zusammen mit früheren Berichten 29,30, 31, 32, unsere Ergebnisse zeigen , dass die Wirksamkeit von Abl , unabhängig von dem Arzneimittelresistenzprofil der Bakterien erhalten bleibt.
Das hier beschriebene Protokoll umfasst drei Hauptverfahren: (1) die Entwicklung eines Mausmodell von Brandinfektionen, (2) abl-Therapie, und (3) Biolumineszenz-Bildgebung. Während ein Mausmodell von burn-Infektionen zu entwickeln, haben wir festgestellt, dass es mehrere Faktoren, die das Ausmaß der Infektion und die anschließende Wirksamkeit von abl beeinflussen: (1) Die Brennzeit wirkt sich auf die Wundtiefe und die Vermehrung von Bakterien. Wenn die Brenndauer von 3 bis 7 s erhöht wurde, war die bakterielle Lumineszenz viel stärker (ein höheres Ausmaß der Infektion anzeigt) bei 24 h nach der Inokulation, und die Beseitigung der Infektion viel höhere abl Belichtungen erforderlich (> 360 J / cm 2 ). (2) Das Inokulum der Bakterien ist ein Schlüsselparameter für die Entwicklung of-Infektionen. Eine höhere Bakterieninokulum führt in der Regel zu einem höheren Ausmaß der Infektion, während eine ausreichend niedrige Inokulum häufig stabile Infektionen bei Mäusen zu entwickeln, schlägt fehl. Im letzteren Zustand wird bakterielle Lumineszenz in der Regel nicht nachweisbar bald nach Bakterieninokulation. (3) Die Wechselwirkung zwischen Bakterien und Wirten ist abhängig von den Bakterienart. Wir haben auch P. aeruginosa ein Infektionsmodell zu entwickeln. Wir fanden heraus , dass unter den gleichen Bedingungen (dh Zeit und Bakterieninokulum Brennen), die durch P. aeruginosa verursachten Infektionen fortgeschritten viel schneller als A. baumannii Infektionen und Sepsis wurde immer bei Mäusen innerhalb von 48 Stunden nach der Impfung 25 beobachtet.
Für die Ausführung von Abl-Therapie, gibt es einige wichtige Punkte, die angesprochen werden müssen: (1) Die richtige Lichtbestrahlungsstärke für die maximierte Wirksamkeit von abl-Therapie erforderlich ist. (2) Die Oberfläche der Verbrennung in den Mäuse should werden möglichst horizontal platziert. Ein Fehler in geeigneter Weise die Brennoberfläche positionieren kann die Wirksamkeit von abl-Therapie beeinträchtigt. (3) Während der Belichtung wird vorgeschlagen, dass die Augen der Mäuse mit Aluminiumfolie geschützt werden, insbesondere, wenn ein Laser als Lichtquelle verwendet wird. (4) Während der Belichtung sollte darauf die Mäuse bei überwachen genommen werden, die sie aus der Narkose erwachen. In diesem Fall sollte eine kleine zusätzliche Dosis von Anästhetika verabreicht werden, um die Tiere zu halten anästhesiert. (5) Beide abl-behandelten Mäusen und unbehandelten Mäusen sollten auf einem Aufheizschüttung platziert werden, um die Körpertemperatur zu halten, wenn sie unter Anästhesie. Während des Prozesses der Biolumineszenz-Bildgebung konnte die Biolumineszenz von Bakterien verringern, wenn die Verbrennungs trocken werden. Daher ist es empfehlenswert, bevor die Abbildung der Maus brennt mit PBS zu befeuchten.
Darüber hinaus gibt es einige Einschränkungen der Techniken in diesem Protokoll diskutiert: (1) Zum Zweck der Überwachung der extent der Infektion in Echtzeit, Biolumineszenz-Bakterienstämme verwendet werden. Daher muss vor einer klinischen Stamm kann im Tiermodell getestet werden, muß es genetisch durch die Transfektion des lux - Operons CDABE 11 modifiziert werden. (2) Die Wirksamkeit von abl auf die Wellenlängen bezogen ist 33 und Bakterienarten / Stämme , 34 verwendet. Die blauen Wellenlängen, zusammen mit anderen Parametern, sollte weiter zur Inaktivierung von verschiedenen Bakterienarten / Stämme optimiert werden. (3) Wir untersuchten nur oberflächliche Infektionen bei Mäusen. Für tiefliegende Infektionen kann die topische Verabreichung von abl nicht in der Lage sein , um die Infektion zu erreichen, so kann interstitielle Lichtabgabe 35 benötigt werden. (4) Es gibt eine Begrenzung Empfindlichkeit des Abbildungssystems, besonders bei 19 tiefen Infektionen Bildgebung. Als Ergebnis kann, selbst wenn die Pixel der Biolumineszenz werden könnten vollständig eliminiert, da noch sein viBakterienzellen in der Lage bleiben, so dass bakterielle Nachwachsen auftreten. Eine verlängerte Exposition gegenüber abl wird nach der Eliminierung von bakterieller Lumineszenz empfohlen, um bakterielle Nachwachsen zu verhindern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
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