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Immunology and Infection

बहुदबा प्रतिरोधी के लिए रोगाणुरोधी ब्लू लाइट थेरेपी के विवो जांच असिनेतोबक्टेर संक्रमण जला bioluminescence इमेजिंग का उपयोग करना

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997

Abstract

जला संक्रमण रुग्णता और मृत्यु दर का एक महत्वपूर्ण कारण बने हुए हैं। बहुऔषध-प्रतिरोधक (एमडीआर) बैक्टीरिया की बढ़ती उद्भव पारंपरिक एंटीबायोटिक उपचार के लगातार विफलता के लिए प्रेरित किया है। वैकल्पिक चिकित्सा विज्ञान तत्काल एमडीआर बैक्टीरिया से निपटने के लिए आवश्यक हैं।

एक अभिनव गैर एंटीबायोटिक दृष्टिकोण, रोगाणुरोधी नीले प्रकाश (ABL), एमडीआर संक्रमण के खिलाफ होनहार प्रभावशीलता दिखाई है। ABL की कार्रवाई के तंत्र अभी तक अच्छी तरह से समझ नहीं है। यह आमतौर पर धारणा है कि स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया में अंतर्जात photosensitizing chromophores होने वाली (जैसे, लोहा मुक्त porphyrins, flavins, आदि) एक प्रकाश रासायनिक प्रक्रिया के माध्यम से ABL, जो बारी में साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन (ROS) से उत्साहित कर रहे हैं।

एक और प्रकाश आधारित रोगाणुरोधी दृष्टिकोण के विपरीत, रोगाणुरोधी प्रकाश गतिक थेरेपी (aPDT), ABL चिकित्सा बहिर्जात photosensitiz की कोई भूमिका नहीं होतीएर। सभी को लागू होने की जरूरत है नीले प्रकाश का विकिरण होता है; इसलिए, यह सरल और सस्ती है। ABL रिसेप्टर्स डीएनए बैक्टीरिया में अंतर्जात सेलुलर photosensitizers के बजाय कर रहे हैं। इस प्रकार, ABL बहुत कम जेनोटोक्सिक से पराबैंगनी-सी (UVC) विकिरण, जो सीधे मेजबान कोशिकाओं में डीएनए की क्षति का कारण बनता है कोशिकाओं की मेजबानी के लिए माना जाता है।

इस पत्र में, हम चोट जला के एक माउस मॉडल में एमडीआर असिनेतोबक्टेर संक्रमण के लिए ABL चिकित्सा की प्रभाविता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक इंजीनियर-जीव तनाव उपयोग करके, हम noninvasively रहने वाले जानवरों में वास्तविक समय में संक्रमण की हद तक निगरानी करने में सक्षम थे। इस तकनीक को भी पशुओं में संक्रमण के स्थानिक वितरण की निगरानी के लिए एक प्रभावी उपकरण है।

Introduction

जला संक्रमण, जो अक्सर क्योंकि त्वचीय थर्मल चोटों की रिपोर्ट कर रहे हैं, रुग्णता और मृत्यु दर 1 का एक महत्वपूर्ण कारण बने हुए हैं। जला संक्रमण के प्रबंधन आगे एंटीबायोटिक दवाओं के बड़े पैमाने पर उपयोग के कारण बहुऔषध-प्रतिरोधक (एमडीआर) जीवाणु उपभेदों 2 की बढ़ती उद्भव से समझौता किया गया है। एक महत्वपूर्ण एमडीआर ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया असिनेतोबक्टेर है, जो हाल ही में लड़ाई घावों के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है और लगभग सभी उपलब्ध एंटीबायोटिक दवाओं 3 के लिए प्रतिरोधी है जाता है। घायल फोकी पर biofilms की उपस्थिति 4, 5 की सूचना दी गई है और एंटीबायोटिक दवाओं और मेजबान रक्षा 6, 7 के लिए सहिष्णुता ख़राब माना जाता है, स्थायी संक्रमण के कारण 8, 9। इसलिए, वहाँ एक pressin हैग्राम वैकल्पिक उपचार के विकास के लिए की जरूरत है। मुकाबला एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए हाल ही में घोषणा राष्ट्रीय रणनीति में, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए वैकल्पिक चिकित्सा विज्ञान के विकास में संयुक्त राज्य अमेरिका में 10 की सरकार द्वारा एक कार्रवाई के रूप में उल्लेख किया गया है।

प्रकाश आधारित रोगाणुरोधी दृष्टिकोण, जैसा कि नाम से संकेत दिया, के साथ या अन्य एजेंटों के बिना प्रकाश विकिरण की आवश्यकता है। इन तरीकों रोगाणुरोधी प्रकाश गतिक थेरेपी (aPDT), पराबैंगनी-सी (UVC) विकिरण, और रोगाणुरोधी नीले प्रकाश (ABL) शामिल हैं। पिछले अध्ययनों में, वे एमडीआर जीवाणु उपभेदों 11, 12, 13 की हत्या करने में होनहार प्रभावशीलता दिखाई है। तीन प्रकाश-आधारित दृष्टिकोण के अलावा, ABL photosensitizers 14 के उपयोग के बिना उसके अंतर्निहित जीवाणुरोधी गुणों के कारण हाल के वर्षों में ध्यान में वृद्धि को आकर्षित किया है। compar मेंison aPDT को, ABL केवल प्रकाश का उपयोग शामिल है, जबकि aPDT प्रकाश और एक photosensitizer का एक संयोजन की आवश्यकता है। इसलिए, ABL सरल और सस्ती 14 है। UVC की तुलना में, ABL बहुत कम साइटोटोक्सिक और कोशिकाओं 15 की मेजबानी के लिए जेनोटोक्सिक होने का विश्वास है।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को एक माउस मॉडल में एमडीआर ए असिनोक्टाबक्टोर की वजह से जला संक्रमण के इलाज के लिए ABL की प्रभावशीलता की जांच के लिए है। हम-जीव रोगजनक बैक्टीरिया का उपयोग जला संक्रमण है कि वास्तविक समय में बैक्टीरियल बोझ की गैर इनवेसिव निगरानी की अनुमति देने के नए माउस मॉडल विकसित करने के लिए। शरीर के तरल पदार्थ / ऊतक के नमूने और बाद में चढ़ाना और कॉलोनी की गिनती 16 की पारंपरिक विधि की तुलना में, इस तकनीक सटीक परिणाम प्रदान करता है। ऊतक के नमूने की प्रक्रिया प्रयोगात्मक त्रुटि का एक अन्य स्रोत परिचय सकता है। के बाद से बैक्टीरियल चमक तीव्रता रैखिक संवाददाता के लिए आनुपातिक हैबैक्टीरियल CFU 17 ponding, हम सीधे प्रकाश विकिरण की एक निश्चित खुराक के बाद बैक्टीरिया के अस्तित्व के माप सकते हैं। जानवरों वास्तविक समय में प्रकाश उपचार प्राप्त कर जीने में बैक्टीरियल बोझ की निगरानी करके, बैक्टीरियल हत्या की गतिकी चूहों के एक काफी कम संख्या का उपयोग कर विशेषता जा सकता है।

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Protocol

1. बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी

  1. ब्रेन हार्ट आसव (भी) एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के माध्यम से 7.5 एमएल जोड़ें। BHI माध्यम में बीज ए असिनोक्टाबक्टोर कोशिकाओं और फिर 18 घंटे के लिए एक कक्षीय इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में ए असिनोक्टाबक्टोर संस्कृति सेते हैं।
  2. 5 मिनट के लिए कम से 3,500 × छ कोशिकाओं की संस्कृति अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में छर्रों धोएं।
  3. ताजा पीबीएस में बैक्टीरिया छर्रों फिर से निरस्त करने और अच्छी तरह से निलंबन विंदुक।
  4. बैक्टीरियल निलंबन के 100 μL एकत्र करें और ताजा पीबीएस का उपयोग कर 1:10 कमजोर पड़ने बनाते हैं।
  5. एक 1.5 एमएल अर्द्ध सूक्ष्म क्युवेट करने के लिए कमजोर पड़ने स्थानांतरण और 600 एनएम (ओवर ड्राफ्ट 600 एनएम) के तरंग दैर्ध्य में ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने।
  6. और कमजोर पड़ने की मापा आयुध डिपो 600 एनएम मूल्य कमजोर पड़ने कारक (10) के अनुसार पीबीएस में मूल (undiluted) निलंबन के आयुध डिपो 600 एनएम की गणना।
  7. वें समायोजित करेंई पीबीएस में मूल निलंबन 600 एनएम = 0.6 (10 8 CFU / एमएल के एक सेल घनत्व के अनुरूप) आयुध डिपो के लिए।

2. जला संक्रमण Bioluminescent एक की वजह से की माउस मॉडल। असिनोक्टाबक्टोर

  1. उपयोग वयस्क मादा BALB / ग चूहों आयु वर्ग के 7-8 सप्ताह और 17-19 ग्राम वजन। चूहों प्रयोग के शुरू होने से पहले कम से कम 3 दिनों के लिए प्रयोगशाला परिस्थितियों को ऊंचाई के अनुकूल ढलने की अनुमति दें। 21 ℃ के एक कमरे के तापमान के तहत एक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र में चूहों को बनाए रखने और उन्हें भोजन और पानी यथेच्छ दे।
  2. (- 20 मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा) एक ketamine-xylazine कॉकटेल के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। हल्के से एक कपास पट्टी के साथ एक माउस के palpebra स्पर्श; नेत्रच्छद पलटा का अभाव एक उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई पता चलता है। पशु चिकित्सक मरहम के साथ माउस आँखों कवर संज्ञाहरण के दौरान सूखापन से आंखों को रोकने के लिए।
  3. पीठ पर चूहों दाढ़ी एक 5 का उपयोग करके जितना संभव हो उतना त्वचा का पर्दाफाश करने के0-ब्लेड बाल क्लिपर।
  4. चूहों के पेट के नीचे एक 35 म पेट्रि डिश के ढक्कन जगह एक अपेक्षाकृत क्षैतिज स्थिति में उनकी पीठ रखने के लिए।
  5. एक 250 एमएल बीकर (80% पूर्ण) में उबाल लें पानी एक 10 "x 10", 220 VAC हॉटप्लेट का उपयोग कर। बीकर में एक पीतल ब्लॉक (1 सेमी x 1 सेमी पार अनुभाग) विसर्जित कर जब तक पानी के साथ थर्मल संतुलन तक पहुँच जाता है। थर्मल संतुलन आमतौर पर <5 मिनट लगते हैं और बीकर में पानी की फिर से उबलते से मिलता है।
  6. चोट जला बनाने से पहले, दर्द से राहत के लिए पूर्व रिक्तिपूर्व दर्दनाशक दवाओं 0.1mg / kg (buprenorphine की एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के लिए प्रशासन।
  7. दस मिनट पूर्व रिक्तिपूर्व दर्दनाशक दवाओं के बाद, धीरे जला घाव प्रेरित करने के लिए 7 s के लिए चूहों की पीठ पर मुंडा क्षेत्र पर गरम पीतल ब्लॉक दबाएँ।
    नोट: काम कर रहे कर्मियों को थर्मल चोट से बचने के लिए, जब जल प्रक्रिया प्रदर्शन थर्मल प्रतिरोधी दस्ताने पहनते हैं।
  8. subcutaneou के माध्यम से बाँझ खारा की 0.5 एमएल में व्यवस्थापितरों इंजेक्शन निर्जलीकरण को रोकने के लिए।
  9. पांच मिनट थर्मल चोट के शामिल होने के बाद, माउस एक विंदुक का उपयोग जलता पर जीवाणु युक्त पीबीएस में 5 x 10 6 CFU निलंबन के 50 μL टीका। त्वचा पर एक वक्र गति में एक बाँझ कपास पट्टी जाकर, जलता है पर aliquots स्मियर यथासंभव समान रूप से जला दिया क्षेत्र में बैक्टीरियल कोशिकाओं वितरित करने के लिए।
  10. इसके तत्काल बाद जीवाणु टीका के बाद, संक्रमित जलता के लिए bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन धारा 4 में वर्णित है।
  11. एक पानी गरम किया जाता शल्य बिस्तर (37 डिग्री सेल्सियस, वसूली क्षेत्र) जब तक चूहों पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया पर चूहों रखें। हाउस एक जैव सुरक्षा स्तर -2 पशु कमरे में पिंजरे प्रति 5 की अधिकतम संख्या के साथ चूहों।
  12. चोट जला के बाद पहले तीन दिनों के लिए व्यवस्थापित और दर्दनाशक दवाओं (0.1 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine के चमड़े के नीचे इंजेक्शन) दिन में दो बार।

के लिए एक। & # 3. रोगाणुरोधी ब्लू लाइट थेरेपी160; चूहों में असिनोक्टाबक्टोर संक्रमण

  1. 24 घंटे के जीवाणु टीका के बाद कम से ABL चिकित्सा शुरू करो।
  2. ABL विकिरण के लिए 415 एनएम पर एक चोटी उत्सर्जन के साथ एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) का प्रयोग करें। चूहों 18 में विकिरणित क्षेत्र पर थर्मल प्रभाव को रोकने के लिए एक हीट सिंक पर एलईडी माउंट। क्लिप कनेक्टर के साथ एक ऑप्टिकल समर्थन रॉड से एलईडी एलईडी नीचे ऊपर ले जाएँ और करने के लिए अनुमति देने के लिए ठीक करें।
  3. शक्ति / ऊर्जा मीटर चालू करें और 415 एनएम का चयन करने के तरंगदैर्ध्य बटन दबाएँ। पृष्ठभूमि (व्यापक प्रकाश) घटाना शक्ति / ऊर्जा मीटर रीसेट करें।
  4. शक्ति / ऊर्जा मीटर सही एलईडी के तहत रखें। नीली प्रकाश सुरक्षात्मक काले चश्मे पहनें। एलईडी प्रकाश को चालू करें और एलईडी एपर्चर (एक लेंस है कि एलईडी से प्रकाश अभिसरण) और शक्ति / ऊर्जा मीटर की प्रकाश संवेदक (व्यास में 2 सेमी) के बीच की दूरी को समायोजित इतना है कि प्रकाश स्थान के पूरे क्षेत्र को शामिल किया प्रकाश संवेदक।
  5. ध्यान से धुन एलईडी ड्राइवर और powe के पढ़ने रिकॉर्डआर / ऊर्जा मीटर। पढ़ने के अनुसार विकिरण की गणना करें: विकिरण = पढ़ना (डब्ल्यू) / क्षेत्र (सेमी 2)। एलईडी चालक ट्यूनिंग द्वारा 100 मेगावाट / सेमी 2 के लिए एलईडी के विकिरण को समायोजित करें।
  6. एलईडी बंद कर दें। एलईडी एपर्चर और शक्ति / ऊर्जा मीटर की प्रकाश संवेदक बीच की दूरी मापें।
  7. (- 20 मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा) एक ketamine-xylazine कॉकटेल के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। नेत्रच्छद पलटा का अभाव एक उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई पता चलता है।
  8. बेतरतीब ढंग से एक ABL का इलाज समूह (n = 10) और एक अनुपचारित नियंत्रण समूह (n = 10) में चूहों विभाजित करते हैं।
  9. ABL का इलाज समूह के लिए, प्रकाश को overexposure से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ चूहों की आंखों को कवर किया। माउस जलता सीधे एलईडी के तहत रखें, माउस पेट के नीचे एक 35 म पेट्रि डिश के ढक्कन के साथ एक क्षैतिज स्थिति में उनकी पीठ रखने के लिए।
  10. एक वर्ग पेट्री di पर शक्ति / ऊर्जा मीटर एक माउस के साथ कदम 3.5 में वर्णित बदलेंश। माउस वापस एक स्थिति के लिए जहां एलईडी एपर्चर और माउस जला की सतह के बीच की दूरी है कि एलईडी एपर्चर और शक्ति / ऊर्जा मीटर की प्रकाश संवेदक (के स्तर के बीच के बराबर के रूप में कदम से चर्चा की है की ऊंचाई को समायोजित 3.5)।
  11. 100 मेगावाट / सेमी 2 के विकिरण पर संक्रमित जलता चमकाना। 72 जे / 2 सेमी की खुराक में ABL उद्धार के 360 जम्मू / सेमी 2 तक पहुँच जाता है एक कुल खुराक तक (जैसे, 0, 72, 144, 216, 288 और 360 जम्मू / सेमी 2)। प्रत्येक प्रकाश खुराक के बाद, चूहों के लिए bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन के रूप में धारा 4 में चर्चा की।
  12. अनुपचारित नियंत्रण समूह के लिए, माउस जलने से bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन के रूप में धारा 4 में चर्चा की, एक ही समय के अंतराल ABL का इलाज समूह के लिए इस्तेमाल के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
  13. चूहों की वसूली से पहले, गर्मी हानि और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए पानी गर्म शल्य बिस्तर पर चूहों रखें। गतिविधि और वसूली जब तक चूहों के नेत्रच्छद पलटा का निरीक्षण करें। वें के बादचूहों के ई वसूली, उन्हें पिंजरे में 2-3 घर।
  14. ABL चिकित्सा के बाद, bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन, के रूप में वैकल्पिक दिनों पर पहले 3 दिनों के लिए धारा 4 में चर्चा की और दैनिक, तो चूहों में संक्रमण के अस्थायी जैव बोझ नजर रखने के लिए।

चूहों में संक्रमण की 4. bioluminescence इमेजिंग

  1. छवि एक कम प्रकाश इमेजिंग प्रणाली है कि एक तेज प्रभारी युग्मित डिवाइस कैमरा, एक कैमरा नियंत्रक, एक नमूना कक्ष, और एक छवि प्रोसेसर 19 शामिल का उपयोग कर चूहों।
  2. (- 20 मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा) एक ketamine-xylazine कॉकटेल के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। हल्के से एक कपास पट्टी के साथ चूहों के नेत्रच्छद स्पर्श; नेत्रच्छद पलटा का अभाव एक उपयुक्त संवेदनाहारी गहराई पता चलता है।
  3. लाइव इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो। नियंत्रण कक्ष प्रकट होती है, प्रारंभ क्लिक करें। तक प्रतीक्षा तापमान बॉक्स का रंग हरा हो जाता है, यह दर्शाता है कि मंच के तापमाननमूना कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है।
  4. मंच (37 डिग्री सेल्सियस) इमेजिंग प्रणाली का नमूना कक्ष में पर चूहों रखें, सीधे कैमरे के तहत संक्रमित जलता साथ।
    नोट: बैक्टीरिया के bioluminescence कम हो सकता है जब जलता शुष्क हो जाते हैं। इसलिए, यह इमेजिंग से पहले पीबीएस के साथ माउस जलता moisturize करने के लिए सिफारिश की है।
  5. नियंत्रण कक्ष में, अगले करने के लिए एक जाँच चिह्न डाल "Luminescence।" "ऑटो जोखिम" का चयन करें ताकि इमेजिंग के लिए जोखिम समय bioluminescence तीव्रता के आधार पर लाइव इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा अनुकूलित किया जाएगा।
  6. "दृश्य के फ़ील्ड" ड्रॉप-डाउन सूची से 'सी' का चयन करें। सॉफ्टवेयर फोकल दूरी निर्धारित करने देना "स्कैन मध्य रेंज" विकल्प चुनें। एक जाँच चिह्न अगले ओवरले के लिए रखो।
  7. "प्राप्त" पर क्लिक करें छवि पर कब्जा करने की। "संपादन छवि लेबल" बॉक्स में, क्लिक करें "ठीक है," एक "छवि खिड़की" और "टोल पैलेट" दिखाई देगा।
  8. स्वत: चयन के लिए ऑटो आरओआई पैरामीटर सेट।
  9. रिश्तेदार चमक इकाइयों (RLUs) के रूप में bioluminescence तीव्रता यों और एक झूठी रंग गुलाबी (सबसे तीव्र) से नीला (कम से कम तीव्र) 19, 20 से लेकर पैमाने में जैव-प्रकाश प्रदर्शित करते हैं।
  10. bioluminescence तीव्रता विश्लेषण पर आधारित समय अंक अलग माउस जलता में बैक्टीरिया के अस्तित्व के अंश की गणना। एक निश्चित समय बिंदु पर बैक्टीरिया के अस्तित्व के अंश = bioluminescence उस समय बिंदु पर मापा जाता तीव्रता / bioluminescence तीव्रता सही ABL जोखिम 17 से पहले मापा जाता।

5. चूहे की इच्छामृत्यु

  1. प्रयोग के अंतिम बिंदुओं इस प्रकार हैं: (क) संक्रमण के रूप में इमेजिंग द्वारा निर्धारित रूप में जैव-प्रकाश का नुकसान इसका सबूत के संकल्प; (ख) व्यवस्थित संक्रमण की घटना के रूप में जलाया के बाहर हैं जैव-प्रकाश का प्रसार ने संकेत दियाए; (ग) सामान्य उम्र से मिलान चूहों की तुलना में ≥15% शरीर के वजन की हानि, या के रूप में मैनुअल उत्तेजना, गतिहीनता, खाने या पीने की असमर्थता के लिए प्रतिक्रिया की कमी ने संकेत दिया दर्द और संकट से पीड़ित हैं। अध्ययन के दौरान, अगर हम एक स्थिति है जहाँ हम अनिश्चित हैं कि एक माउस पूरी तरह से, मरणासन्न की स्थिति तक पहुँच गया है के रूप में हमारे परिभाषा द्वारा उल्लिखित, और / या हम अनिश्चित अगर हम इसे euthanize करने की जरूरत है कर रहे हैं सामना करते हैं, हम एक सीसीएम पशु चिकित्सा स्टाफ से संपर्क करेंगे कार्रवाई की एक योजना के लिए; (घ) अन्यथा चूहों 30 दिनों के अध्ययन के प्रारंभ के बाद euthanized किया जाएगा।
  2. पिंजरों में विशेष रूप से इच्छामृत्यु के लिए बंद कर पिंजरों में चूहों को स्थानांतरित और कार्बन डाइऑक्साइड पहुंचाने द्वारा चूहों euthanize (सीओ 2) संकुचित गैस।
    1. गैस के प्रवाह को आरंभ करने के लिए सीओ 2 टैंक या वाल्व नियामक खोलें। सत्यापित करें कि नियामक सही साई (पाउंड प्रति वर्ग इंच) निर्देश इकाई द्वारा पोस्ट की के आधार पर लिखा है, और फिर से समायोजितआवश्यकतानुसार सही साई को gulator, आमतौर पर 5 से अधिक नहीं साई।
    2. धीरे-धीरे भरें। प्रवाह की दर प्रति मिनट कक्ष / पिंजरे मात्रा का कोई 30% से अधिक (; एक चूहे के पिंजरे के लिए, ~ 7.5 एल / मिनट एक ठेठ माउस पिंजरे के लिए, ~ 2 एल / मिनट) विस्थापित करना चाहिए।
    3. जाने या साँस लेने को रोकने के लिए पशु के लिए लगभग 3-5 मिनट रुको; आँखों तय की और फैली हुई किया जाना चाहिए। सीओ 2 के प्रवाह को रोकने के लिए सीओ 2 टैंक या नियामक वाल्व बंद कर दें।
    4. सुनिश्चित करें कि दिल अंगूठे और तर्जनी के बीच सीने महसूस कर रही द्वारा की धड़कन नहीं है। सुनिश्चित करें नेत्रगोलक को छूकर नहीं झपकी पलटा नहीं है।
      1. अगर वहाँ एक दिल की धड़कन या झपकी पलटा है, इच्छामृत्यु प्रक्रिया को दोहराने या कैंची का उपयोग एक वातिलवक्ष (जानवर एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए इस प्रक्रिया के प्रदर्शन से पहले गैर संवेदनशील होना चाहिए) बनाने के लिए सीने की गुहा को खोलने के लिए।

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Representative Results

जैसा कि पहले 12, 17 की सूचना दी ए असिनोक्टाबक्टोर तनाव है कि हम इस्तेमाल किया, एक एमडीआर नैदानिक अलग है। बैक्टीरियल तनाव luxCDABE ओपेरा 11 के अभिकर्मक द्वारा-जीव बनाया गया था। चित्रा 1 ए से पता चलता एक प्रतिनिधि माउस से लगातार जीवाणु चमक छवियों 5 x 10 6 ए असिनोक्टाबक्टोर से संक्रमित जलाने और 24 घंटे के जीवाणु टीका के बाद में एक ही ABL जोखिम से अवगत कराया। एक प्रतिनिधि माउस त्वचा की ऊतकीय खंड के एक ग्राम दाग नमूना (24 घंटे के बाद टीका पर काटा) जला संक्रमित जला (चित्रा 1 बी) की सतह पर ए असिनोक्टाबक्टोर biofilms की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है, बैक्टीरियल चमक लगभग 360 जम्मू / 2 सेमी की एक जोखिम ABL दिया गया था (कम से विकिरण के 60 मिनट के बाद खत्म हो गया था100 मेगावाट / सेमी 2) के विकिरण। चित्रा 1C 5 x 10 6 ए असिनोक्टाबक्टोर से संक्रमित और 24 घंटे के जीवाणु टीका के बाद (n = 10) पर ABL के साथ इलाज माउस जलने से मतलब बैक्टीरियल चमक की खुराक-प्रतिक्रिया वक्र है। प्राप्त करने के लिए एक 3 लोग इन माउस जलता में ए असिनोक्टाबक्टोर के 10 निष्क्रियता, लगभग 360 जम्मू / सेमी 2 ABL आवश्यक था। माउस के जीवाणु चमक जलता ABL के लिए unexposed समय के किसी समान अवधि के दौरान लगभग कोई परिवर्तन नहीं हुआ (नहीं दिखाया डेटा; पी <0.001)।

आकृति 1
चित्र 1: संक्रमित माउस बर्न्स में जीवाणुओं की ABL निष्क्रियता। (ए) एक प्रतिनिधि माउस से लगातार जीवाणु चमक छवियों 5 x 10 6 ए असिनोक्टाबक्टोर की CFU से संक्रमित हैं और 24 पर 360 जम्मू / सेमी 2 ABL के संपर्क में जलाजीवाणु टीका के बाद एच। (बी) ग्राम से सना हुआ एक प्रतिनिधि माउस त्वचा माउस जला में ए असिनोक्टाबक्टोर biofilms (तीर) की उपस्थिति दिखा जला के ऊतकीय अनुभाग। त्वचा नमूना 24 घंटे के जीवाणु टीका के बाद कम से काटा गया था। (सी) माउस की संकरी बैक्टीरियल चमक की खुराक-प्रतिक्रिया वक्र 5 x 10 6 ए असिनोक्टाबक्टोर से संक्रमित और 24 घंटे (n = 10) जीवाणु टीका के बाद कम से 360 जम्मू / सेमी 2 ABL के एक जोखिम के साथ इलाज जलता है। बार्स: मानक विचलन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ABL संक्रमण के उपचार के लिए एक उपन्यास विधि है। के बाद से कार्रवाई के अपने तंत्र कीमोथेरेपी के कि से पूरी तरह से अलग है, यह एक भौतिक चिकित्सा के अधिक है। एजेंट है कि रोगाणुरोधी प्रभाव मध्यस्थता करता है नीले प्रकाश विकिरण (400-470 एनएम) है। नीले एल ई डी के विकास के साथ, हम एमडीआर संक्रमण के लिए एक प्रभावी और सरल प्रकाश आधारित रोगाणुरोधी दृष्टिकोण के लिए एक्सेस प्राप्त की।

इस प्रोटोकॉल में, हम एमडीआर, ए असिनोक्टाबक्टोर की एक-जीव तनाव की वजह से जला संक्रमण के एक माउस मॉडल के विकास का वर्णन किया है। -Invasively गैर-जीव इमेजिंग के माध्यम से जानवरों में रहने वाले वास्तविक समय में नजर रखी-जीव बैक्टीरिया के उपयोग के साथ, संक्रमण की हद तक जा सकता है। बैक्टीरिया के इंजीनियर-जीव उपभेदों और कम प्रकाश इमेजिंग तकनीक के उपयोग रोगाणुरोधी चिकित्सा के दौरान वास्तविक समय में संक्रमण की निगरानी के लिए एक कुशल तकनीक पैदा करता है। इस विधि भी संक्रमण की जांच में इस्तेमाल किया जा सकताअन्य माइक्रोबियल प्रजातियों की वजह से और अन्य साइटों पर स्थित है। रोगाणुरोधी दृष्टिकोण की प्रभावकारिता मूल्यांकन इसके अलावा, इस विधि भी संक्रमण की प्रगति को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

इस माउस मॉडल का उपयोग करके, हम प्रदर्शन किया है कि ABL (415 एनएम) सफलतापूर्वक स्थापित संक्रमण (चित्रा 1 ए और सी) में बैक्टीरिया निष्क्रिय। ABL चिकित्सा करने से पहले, बैक्टीरिया के समूहों की स्थापना के संक्रमण (चित्रा 1 बी) है, जो biofilms की एक विशेषता है में मनाया गया था। Biofilms पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं और मेजबान रक्षा उनके planktonic समकक्षों 6, 7 की तुलना में अधिक सहिष्णु हैं और अक्सर स्थायी संक्रमण 8, 9 के साथ जुड़े रहे हैं। प्रतिनिधि परिणाम है कि 415 एनएम ABL में बेहतर संभावनाएं हैं biofilm-मर्मज्ञ है। इसके अलावा, एक साथ पिछली रिपोर्टों 29 के साथ,30, 31, 32, हमारे परिणाम है कि ABL की प्रभावशीलता बैक्टीरिया की दवा प्रतिरोध प्रोफाइल की परवाह किए बिना बनी रहती है का प्रदर्शन।

(1) जला संक्रमण के एक माउस मॉडल के विकास, (2) ABL चिकित्सा, और (3) bioluminescence इमेजिंग: प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित तीन मुख्य प्रक्रियाओं शामिल है। जला संक्रमण के एक माउस मॉडल डेवलप करते समय, हमने देखा वहाँ कई कारकों है कि संक्रमण की हद और ABL के बाद के प्रभाव को प्रभावित करते थे कि: (1) जल समय घाव गहराई और बैक्टीरिया के प्रसार को प्रभावित करता है। जल समय 3 से 7 s से बढ़ा दिया गया था जब, बैक्टीरियल चमक बहुत मजबूत 24 घंटे के बाद टीका पर (संक्रमण के एक उच्च सीमा तक यह दर्शाता है) था, और संक्रमण के उन्मूलन की आवश्यकता बहुत अधिक ABL जोखिम (> 360 जम्मू / सेमी 2 )। (2) बैक्टीरिया के inoculum विकास ओ के लिए एक प्रमुख पैमाना हैच संक्रमण। एक उच्च बैक्टीरियल inoculum आमतौर पर, संक्रमण के एक उच्च सीमा तक में जो परिणाम, जबकि एक पर्याप्त रूप से कम inoculum अक्सर चूहों में स्थिर संक्रमण विकसित करने के लिए विफल रहता है। उत्तरार्द्ध हालत में, बैक्टीरियल चमक आमतौर पर जल्द ही undetectable जीवाणु टीका के बाद हो जाता है। (3) बैक्टीरिया और मेजबान के बीच बातचीत बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर है। हम यह भी पी aeruginosa इस्तेमाल किया एक संक्रमण मॉडल विकसित करने के लिए। हमने पाया है कि, एक ही परिस्थितियों में (यानी, जल समय और बैक्टीरियल inoculum), पी aeruginosa की वजह से संक्रमण और अधिक तेजी से ए असिनोक्टाबक्टोर संक्रमण से आगे बढ़ता गया, और पूति हमेशा 48 घंटे के बाद टीका 25 के भीतर चूहों में मनाया गया।

(1) उचित प्रकाश विकिरण ABL चिकित्सा के अधिकतम प्रभावकारिता के लिए आवश्यक है: ABL चिकित्सा के निष्पादन के लिए, वहाँ कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को संबोधित करने की आवश्यकता है है। (2) में जला की सतह चूहों रोंhould संभव के रूप में क्षैतिज रखा जा। एक विफलता उचित रूप से सतह जला स्थिति ABL चिकित्सा की प्रभावकारिता समझौता कर सकते हैं। (3) प्रकाश जोखिम के दौरान, यह सुझाव दिया है कि चूहों की आंखों एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संरक्षित किया जाना है, खासकर जब एक लेजर प्रकाश स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है। (4) प्रकाश जोखिम के दौरान देखभाल के मामले में चूहों वे संज्ञाहरण से जगाने की निगरानी के लिए लिया जाना चाहिए। इस मामले में, निश्चेतक का एक छोटा सा अतिरिक्त खुराक संज्ञाहरण जानवरों को रखने के लिए प्रशासित किया जाना चाहिए। (5) दोनों ABL का इलाज चूहों और अनुपचारित चूहों एक हीटिंग बिस्तर पर रखा जाना चाहिए जब संज्ञाहरण के तहत शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए। bioluminescence इमेजिंग की प्रक्रिया के दौरान, जीवाणुओं की bioluminescence कम हो सकता है जब जलता शुष्क हो जाते हैं। इसलिए, यह इमेजिंग से पहले पीबीएस के साथ माउस जलता moisturize करने के लिए सिफारिश की है।

वहाँ भी तकनीक इस प्रोटोकॉल में चर्चा की कुछ सीमाएं: (1) exte की निगरानी के प्रयोजन के लिएवास्तविक समय में संक्रमण के NT,-जीव जीवाणु उपभेदों इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसलिए, पहले एक नैदानिक तनाव पशु मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है, यह आनुवंशिक रूप से लक्स CDABE ओपेरोन 11 के अभिकर्मक द्वारा संशोधित किया जाना चाहिए। (2) ABL की प्रभावशीलता तरंग दैर्ध्य 33 और बैक्टीरियल प्रजातियों से संबंधित है / 34 का इस्तेमाल किया उपभेदों। नीले तरंग दैर्ध्य, एक साथ अन्य मानकों के साथ, आगे अलग बैक्टीरियल प्रजातियों / उपभेदों निष्क्रिय के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। (3) हम केवल चूहों में सतही संक्रमण की जांच की। गहरे बैठा संक्रमण के लिए, ABL के सामयिक वितरण संक्रमण तक पहुँचने में सक्षम नहीं हो सकता है, इसलिए बीचवाला प्रकाश वितरण 35 की जरूरत हो सकती। (4) वहाँ इमेजिंग सिस्टम की संवेदनशीलता सीमा, गहरी संक्रमण 19 इमेजिंग खासकर जब है। नतीजतन, यहां तक ​​कि जब जैव-प्रकाश का पिक्सल पूरी तरह से समाप्त कर रहे हैं, वहाँ अभी भी vi हो सकता हैशेष में सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं, बैक्टीरियल regrowth होने की अनुमति देता है। ABL के लिए एक विस्तृत जोखिम आदेश बैक्टीरियल regrowth को रोकने के लिए जीवाणु चमक के उन्मूलन के बाद सिफारिश की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 122 रोगाणुरोधी नीले प्रकाश मुल्तिदृग प्रतिरोध, जला माउस मॉडल संक्रमण bioluminescence इमेजिंग
बहुदबा प्रतिरोधी के लिए रोगाणुरोधी ब्लू लाइट थेरेपी के <em>विवो</em> जांच <em><em>असिनेतोबक्टेर</em></em> संक्रमण जला bioluminescence इमेजिंग का उपयोग करना
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Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

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