Abstract
Queman las infecciones continúan siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. La creciente aparición de bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR) ha conducido al fracaso frecuente de los tratamientos tradicionales con antibióticos. Se necesitan urgentemente terapias alternativas para hacer frente a las bacterias resistentes a múltiples fármacos.
Un enfoque no antibiótico innovador, antimicrobiano luz azul (ABL), ha demostrado eficacia prometedora contra las infecciones resistentes a múltiples fármacos. El mecanismo de acción de ABL no está todavía bien entendido. Se plantea la hipótesis comúnmente que ocurre naturalmente cromóforos fotosensibilizadores endógenos en bacterias (por ejemplo, porfirinas libres de hierro, flavinas, etc.) son excitados por Abl, que a su vez produce citotóxicos especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de un proceso fotoquímico.
A diferencia de otro enfoque antimicrobiana basada en la luz, la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDa), terapia de ABL no requiere la participación de un photosensitiz exógenoer. Todo lo que necesita para tener efecto es la irradiación de luz azul; Por lo tanto, es simple y barato. Los receptores ABL son los fotosensibilizadores celulares endógenos en bacterias, en lugar del ADN. Por lo tanto, Abl se cree que es mucho menos genotóxico a las células huésped que la irradiación ultravioleta C (UVC), lo que provoca daños en el ADN directamente en las células huésped.
En este trabajo, se presenta un protocolo para evaluar la eficacia de la terapia de ABL para MDR Acinetobacter baumannii infecciones en un modelo de ratón de lesión por quemadura. Mediante el uso de una cepa bioluminiscente ingeniería, hemos sido capaces de controlar de forma no invasiva el grado de infección en tiempo real en animales vivos. Esta técnica es también una herramienta efectiva para el control de la distribución espacial de las infecciones en animales.
Introduction
Infecciones quemar, que se presentan con frecuencia debido a las lesiones cutáneas térmicas, siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad 1. El tratamiento de las infecciones de quemaduras ha sido comprometida aún más por la creciente aparición de (MDR) cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 2 debido a la utilización masiva de antibióticos. Una bacteria Gram-negativas MDR importantes es Acinetobacter baumannii, que es conocido por estar asociado con heridas de guerra recientes y es resistente a casi todos los antibióticos disponibles 3. La presencia de biofilms en los focos lesionada ha informado 4, 5 y se cree que agravar la tolerancia a los antibióticos y la defensa del huésped 6, 7, causando infecciones persistentes 8, 9. Por lo tanto, existe la vasopresinag necesita para el desarrollo de tratamientos alternativos. En la Estrategia Nacional de Lucha contra la recientemente anunciada bacterias resistentes a antibióticos, el desarrollo de terapias alternativas a los antibióticos ha sido señalado como una acción por parte del gobierno de los Estados Unidos 10.
enfoques antimicrobianos basados en la luz, como se indica por el nombre, requieren irradiación de luz con o sin otros agentes. Estos enfoques incluyen la terapia antimicrobiana fotodinámica (TFDa), ultravioleta C (UVC) la irradiación, y la luz azul antimicrobiano (ABL). En estudios anteriores, que han demostrado eficacia prometedora en matar cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 11, 12, 13. Entre los tres enfoques basados en la luz, abl ha atraído una atención creciente en los últimos años debido a sus propiedades antibacterianas intrínsecas sin el uso de fotosensibilizadores 14. en comparIson a TFDa, Abl sólo implica el uso de la luz, mientras que TFDa requiere una combinación de luz y un fotosensibilizador. Por lo tanto, ABL es simple y barato 14. En comparación con UVC, Abl se cree que es mucho menos citotóxico y genotóxico a las células huésped 15.
El objetivo de este protocolo es investigar la eficacia de ABL para el tratamiento de infecciones de quemaduras causadas por A. baumannii multirresistente en un modelo de ratón. Utilizamos bacterias patógenas bioluminiscentes para desarrollar nuevos modelos de ratón de las infecciones de quemaduras que permiten la monitorización no invasiva de la carga bacteriana en tiempo real. En comparación con el método tradicional de toma de muestras de fluidos corporales / tejidos y la posterior siembra y recuento de colonias 16, esta técnica proporciona resultados precisos. El proceso de muestreo de tejido podría introducir otra fuente de error experimental. Puesto que la intensidad de la luminiscencia bacteriana es linealmente proporcional a la corresponding bacteriana CFU 17, podemos medir directamente la supervivencia de las bacterias después de una cierta dosis de irradiación de luz. Mediante la supervisión de la carga bacteriana en animales vivos recibir el tratamiento con luz en tiempo real, la cinética de la destrucción bacteriana se pueden caracterizar utilizando un número significativamente reducido de ratones.
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Protocol
1. Preparación de cultivo bacteriano
- Añadir 7,5 ml de infusión cerebro corazón (BHI) medio a un tubo de centrífuga de 50 ml. Seed células A. baumannii en el medio BHI y luego Incubar el cultivo A. baumannii en una incubadora orbital (37 ° C) durante 18 h.
- Centrifugar el cultivo de células a 3.500 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, y se lavan los gránulos en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Vuelva a suspender los pellets de bacterias en PBS fresco y la pipeta a fondo la suspensión.
- Recoger 100 l de la suspensión bacteriana y hacer una dilución 1:10 utilizando fresco PBS.
- La transferencia de la dilución a un 1,5 ml cubeta semi-micro y medir la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 600 nm (OD 600 nm).
- Calcular la OD 600 nm de la suspensión original (sin diluir) en PBS de acuerdo con el valor nm OD 600 medido de la dilución y el factor de dilución (10).
- Ajuste ºe suspensión original en PBS a OD 600 nm = 0,6 (correspondiente a una densidad celular de 10 8 UFC / ml).
2. Modelo de ratón de la infección causada por la quemadura bioluminiscente A. baumannii
- BALB / c ratones Uso de adultos hembra de 7-8 semanas y un peso de 17-19 g. Permitir a los ratones para aclimatarse a las condiciones del laboratorio durante al menos 3 días antes del inicio del experimento. Mantener los ratones en un ciclo de 12 h de luz / oscuridad bajo una temperatura ambiente de 21 ℃ y darles comida y agua ad libitum.
- Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ligeramente tocar el palpebra de cada ratón con un hisopo de algodón; una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada. Cubrir los ojos del ratón con ungüento veterinario para evitar que los ojos de la sequedad durante la anestesia.
- Shave los ratones en la parte posterior para exponer la piel tanto como sea posible mediante el uso de un 50-cuchilla cortadora de cabello.
- Coloque la tapa de un 35 mm placa de Petri debajo de los abdómenes de los ratones para mantener la espalda en una posición relativamente horizontal.
- hervir agua en un vaso de precipitados de 250 ml (80% lleno) utilizando un x 10" , 220 VAC placa de cocción 10" . Sumergir un bloque de latón (1 cm sección transversal x 1 cm) en el vaso de precipitados hasta que se alcanza el equilibrio térmico con el agua. equilibración térmica por lo general toma <5 min y se indica mediante el re-ebullición del agua en el vaso de precipitados.
- Antes de la creación de la lesión por quemadura, administrar analgésicos de anticipación (una inyección subcutánea de 0,1 mg de buprenorfina / kg) para el alivio del dolor.
- Diez minutos después de que los analgésicos de anticipación, presionar suavemente el bloque de latón calentado a la zona afeitada en la parte posterior de los ratones durante 7 s para inducir heridas de quemaduras.
NOTA: Para evitar la lesión térmica al personal de trabajo, el desgaste guantes térmicos resistentes al realizar el procedimiento de grabación. - Administrar 0,5 ml de solución salina estéril a través de subcutaneous inyección para prevenir la deshidratación.
- Cinco minutos después de la inducción de la lesión térmica, inocular 50 l de suspensión bacteriana que contenía 5 x 10 6 CFU en PBS sobre las quemaduras de ratón utilizando una pipeta. Al mover un bastoncillo de algodón estéril en un movimiento en zigzag en la piel, frotis de las alícuotas sobre las quemaduras para distribuir las células bacterianas en la zona quemada lo más uniformemente posible.
- Inmediatamente después de la inoculación bacteriana, realizar imágenes de bioluminiscencia para las quemaduras infectadas, como se describe en la Sección 4.
- Coloque los ratones en un lecho quirúrgico calentado-agua (37 ° C, zona de recuperación) hasta que los ratones se han recuperado completamente de la anestesia. Casa los ratones con un número máximo de 5 por jaula en un nivel de bioseguridad 2-habitación animal.
- Administrar analgésicos (inyección subcutánea de 0,1 mg de buprenorfina / kg) dos veces al día durante los tres primeros días después de la lesión por quemadura.
3. antimicrobiana terapia de luz azul para A. & #160; La infección baumannii en ratones
- Iniciar la terapia abl a las 24 h después de la inoculación bacteriana.
- Utilice un diodo emisor de luz (LED) con un pico de emisión a 415 nm para la irradiación ABL. Montar el LED en un disipador de calor para evitar efectos térmicos en la zona irradiada en ratones 18. Fijar el LED a una varilla de soporte óptico con conectores de clip para permitir que el LED para moverse hacia arriba y hacia abajo.
- Encienda el medidor de potencia / energía y pulse el botón para seleccionar la longitud de onda de 415 nm. Restablecer el medidor de potencia / energía para restar el fondo (luz ambiente).
- Coloque el medidor de potencia / energía justo debajo del LED. Llevar gafas de luz azul-protectores. Encender la luz LED y ajustar la distancia entre la abertura de LED (una lente que converge la luz del LED) y el sensor de luz (2 cm de diámetro) del medidor de potencia / energía de modo que el punto de luz cubre toda el área de el sensor de luz.
- Con cuidado sintonizar el conductor y el LED se registra la lectura de la Potenciar / metro de energía. Calcular la irradiancia de acuerdo a la lectura: Irradiación = Lectura (W) / Área (cm 2). Ajustar la irradiancia del LED a 100 mW / cm2 sintonizando el controlador de LED.
- Apagar el LED. Medir la distancia entre la abertura de LED y el sensor de luz del medidor de potencia / energía.
- Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada.
- Aleatoriamente dividir a los ratones en un grupo tratado-ABL (n = 10) y un grupo no tratado de control (n = 10).
- Para el grupo tratado-Abl, cubrir los ojos de ratones con papel de aluminio para evitar la sobreexposición a la luz. Colocar las quemaduras de ratón directamente bajo el LED, con la tapa de una placa de Petri de 35 mm por debajo de la abdomen ratón para mantener la espalda en una posición horizontal.
- Cambiar el medidor de potencia / energía mencionado en el paso 3.5 con un ratón en una plaza de Petri dish. Ajustar la altura del ratón de nuevo a una posición donde la distancia entre la abertura de LED y la superficie de la quemadura ratón es igual a la existente entre la abertura de LED y el nivel del sensor de luz del medidor de potencia / energía (como se explica en el paso 3.5).
- Irradiar las quemaduras infectadas con una irradiancia de 100 mW / cm2. Entregar ABL en dosis de 72 J / cm 2 hasta una dosis total de 360 J / cm 2 se alcanza (por ejemplo, 0, 72, 144, 216, 288 y 360 J / cm 2). Después de cada dosis de luz, realizar imágenes de bioluminiscencia para los ratones, como se discute en la Sección 4.
- Para el grupo de control no tratado, realizar imágenes de bioluminiscencia de las quemaduras de ratón, como se discute en la Sección 4, usando los mismos intervalos de tiempo tal como se utiliza para el grupo tratado-ABL.
- Antes de la recuperación de los ratones, colocar los ratones en el lecho quirúrgico calentado agua para evitar la pérdida de calor y la hipotermia. Observar la actividad y el reflejo palpebral de los ratones hasta su recuperación. Despúes THrecuperación e de los ratones, casa de ellos 2-3 por jaula.
- Después de la terapia Abl, realizar imágenes de bioluminiscencia, como se discute en la Sección 4, diariamente durante los 3 primeros días y luego en días alternos para supervisar el temporal bio-carga de las infecciones en ratones.
4. La bioluminiscencia Imaging de infecciones en ratones
- Image los ratones utilizando un sistema de imagen bajo luz que incluye una cámara de intensificación de carga acoplada dispositivo, un controlador de la cámara, una cámara de muestra, y un procesador de imagen 19.
- Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ligeramente tocar el palpebral de los ratones con un hisopo de algodón; una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada.
- Iniciar el software de imágenes en vivo. En el panel de control que aparece, haga clic en Inicializar. Esperar hasta que el color de la caja de la temperatura se vuelve verde, lo que indica que la temperatura de la etapaen la cámara de muestra ha llegado a 37 ° C.
- Coloque los ratones de la etapa (37 ° C) en la cámara de muestra del dispositivo de formación de imágenes, con las quemaduras infectadas directamente debajo de la cámara.
NOTA: La bioluminiscencia de las bacterias podría disminuir cuando las quemaduras se secan. Por lo tanto, se recomienda para hidratar las quemaduras de ratón con PBS antes de la formación de imágenes. - En el panel de control, ponga una marca de verificación junto a "luminiscencia". Seleccione "Exposición automática" para que el tiempo de exposición para la imagen será optimizada por el software de imágenes en vivo basado en la intensidad de la bioluminiscencia.
- Seleccionar "C" de la lista desplegable "Campo de visión". Seleccionar la opción "Búsqueda de rango medio" para permitir que el software determine la distancia focal. Ponga una marca de verificación junto a Overlay.
- Haga clic en "Adquirir" para capturar la imagen. En el cuadro "Editar imagen Etiqueta", haga clic en "OK"; aparecerá una "Ventana de imagen" y "Toll paleta".
- Establecer los parámetros de Auto ROI para auto-selección.
- Cuantificar la intensidad bioluminiscencia como unidades relativas de luminiscencia (RLU) y mostrar la bioluminiscencia en una escala de color falso que van desde rosa (más intensa) a azul (menos intensa) 19, 20.
- Calcular la fracción de supervivencia de las bacterias en quemaduras de ratón en diferentes puntos de tiempo sobre la base de análisis de intensidad bioluminiscencia. La fracción de supervivencia de las bacterias en un punto de tiempo dado = la intensidad de bioluminiscencia medido en ese punto de tiempo / la intensidad de bioluminiscencia medido justo antes de la exposición ABL 17.
5. La eutanasia de los ratones
- Los criterios de valoración del experimento son los siguientes: (a) resolución de la infección como se evidencia por la pérdida de la bioluminiscencia como se determina por formación de imágenes; (B) aparición de infecciones sistemáticas como se indica por la propagación de la bioluminiscencia fuera del quemado sonun; (C) pérdida de peso corporal ≥15% en comparación con los ratones normales emparejados por edad, o el sufrimiento de dolor y angustia, como se indica por la falta de capacidad de respuesta a la estimulación manual, inmovilidad, la incapacidad de comer o beber. Durante el estudio, si nos encontramos con una situación en la que no estamos seguros de si un ratón se ha alcanzado plenamente la condición de moribundo, como se indica por nuestra definición, y / o no estamos seguros si tenemos que practicar la eutanasia, nos pondremos en contacto con un personal veterinario CCM para un plan de acción; (D) de lo contrario los ratones se sacrificaron 30 días después del comienzo del estudio.
- Reubicar los ratones en jaulas cerradas específicamente para la eutanasia y la eutanasia a los ratones mediante la entrega de dióxido de carbono (CO 2) de gas comprimido en las jaulas.
- Abrir el CO 2 tanque o válvula reguladora para iniciar el flujo de gas. Verificar que el regulador lee la psi correcta (libras por pulgada cuadrada) en base a las instrucciones publicadas por la unidad, y ajustar el regulator a la psi correcta según sea necesario, típicamente no más de 5 psi.
- Llenar lentamente. La velocidad de flujo debe desplazar a no más de 30% del volumen de la cámara / jaula por min (para una jaula típica ratón, ~ 2 L / min; para una jaula de ratas, ~ 7,5 L / min).
- Espere aproximadamente 3-5 min para que el animal deje de moverse o respirar; los ojos deben estar fijas y dilatadas. Desactive CO 2 tanque o válvula de regulación para detener el flujo de CO 2.
- Asegúrese de que el corazón no late al sentir el pecho entre el pulgar y el índice. Asegúrese de que no hay un reflejo de parpadeo al tocar el globo ocular.
- Si hay un latido del corazón o reflejo de parpadeo, repetir el proceso de la eutanasia o utilizar tijeras para abrir la cavidad torácica para crear un neumotórax (el animal debe ser no sensible a una pizca dedo del pie antes de realizar este procedimiento).
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Representative Results
La cepa de A. baumannii que usamos es un aislado clínico MDR, como se informó anteriormente 12, 17. La cepa bacteriana se hizo bioluminiscente por la transfección de luxCDABE ópera 11. La Figura 1A muestra las sucesivas imágenes de luminiscencia bacterianas de un ratón representativo queman infectado con 5 x 10 6 A. baumannii y se expusieron a una sola exposición abl a las 24 h después de la inoculación bacteriana. Una tinción de Gram de la sección histológica de una piel representante ratón quemar espécimen (cosechadas a las 24 h post-inoculación) demostró la presencia de biofilms A. baumannii en la superficie de la quemadura infectada (Figura 1B). Como se muestra en la Figura 1A, la luminiscencia bacteriana estaba casi erradicada después de una exposición de 360 J / cm 2 ABL fue entregado (60 min de irradiación auna irradiancia de 100 mW / cm 2). La Figura 1C es la curva de dosis-respuesta de la luminiscencia bacteriana media de las quemaduras de ratón infectadas con 5 x 10 6 A. baumannii y tratados con abl a las 24 h después de la inoculación bacteriana (n = 10). Para lograr un 3-log 10 inactivación de A. baumannii en quemaduras de ratón, aproximadamente 360 J / cm 2 se requería ABL. La luminiscencia bacteriana del ratón quema no expuesta a ABL mantuvo casi sin cambios durante un período equivalente de tiempo (datos no mostrados; P <0.001).
Figura 1: abl La inactivación de bacterias en ratón infectado Burns. (A) Las sucesivas imágenes de luminiscencia bacterianas de un ratón representativo quemadura infectaron con 5 x 10 6 UFC de A. baumannii y se expusieron a 360 J / cm 2 Abl en 24h después de la inoculación bacteriana. Sección histológica de una quemadura de piel de ratón representativo que muestra la presencia de biofilms A. baumannii (flechas) en la quemadura de ratón (B) Gram-manchada. La muestra de piel se recogió a las 24 h después de la inoculación bacteriana. (C) curva dosis-respuesta de la luminiscencia bacteriana media de ratón quemaduras infectadas con 5 x 10 6 A. baumannii y se trató con una exposición de 360 J / cm 2 abl a las 24 h (n = 10) después de la inoculación bacteriana. Bares: desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Abl es un nuevo método para el tratamiento de infecciones. Desde su mecanismo de acción es completamente diferente a la de la quimioterapia, es más de un fisioterapia. El agente que media el efecto antimicrobiano es la irradiación con luz azul (400-470 nm). Con el desarrollo de los LEDs azules, ganamos acceso a un enfoque basado en la luz antimicrobiano eficaz y sencilla para las infecciones resistentes a múltiples fármacos.
En este protocolo, hemos descrito el desarrollo de un modelo de ratón de las infecciones de quemaduras causadas por una cepa bioluminiscente de la MDR, A. baumannii. Con el uso de bacterias bioluminiscentes, la extensión de la infección puede ser no invasiva monitoreado en tiempo real en animales vivos a través de imágenes bioluminiscentes. El uso de cepas bioluminiscentes por ingeniería genética de bacterias y la técnica bajo la luz de formación de imágenes crea una técnica eficiente para el control de infecciones, en tiempo real durante la terapia antimicrobiana. Este método también puede ser utilizado en las investigaciones de infeccionescausado por otras especies microbianas y localizado en otros sitios. Además de la evaluación de la eficacia de los enfoques antimicrobianos, este método también se puede utilizar para rastrear el progreso de la infección.
Mediante el uso de este modelo de ratón, hemos demostrado que ABL (415 nm) bacterias en infecciones establecidas (Figura 1A y C) inactivado con éxito. Antes de la terapia ABL, se observaron grupos de bacterias en las infecciones establecidas (Figura 1B), que es una característica de biofilms. Las biopelículas son más tolerantes de los antibióticos tradicionales y la defensa del huésped en comparación con sus homólogos planctónicas 6, 7 y están asociados frecuentemente con infecciones persistentes 8, 9. Los resultados representativos son prometedores en que ABL 415-nm es biofilm-penetrante. Además, junto con los informes anteriores 29,30, 31, 32, nuestros resultados demuestran que la eficacia de ABL persiste independientemente del perfil de resistencia a fármacos de las bacterias.
El protocolo descrito aquí implica tres procedimientos principales: (1) el desarrollo de un modelo de ratón de las infecciones de quemaduras, (2) terapia Abl, y (3) de formación de imágenes de bioluminiscencia. Durante el desarrollo de un modelo de ratón de las infecciones de quemaduras, hemos observado que hay varios factores que afectan a la extensión de la infección y la posterior eficacia de ABL: (1) El tiempo de combustión afecta a la profundidad de la herida y la proliferación de bacterias. Cuando el tiempo de combustión se incrementó de 3 a 7 s, la luminiscencia bacteriana era mucho más fuerte (lo que indica un grado mayor de infección) a las 24 h después de la inoculación, y la erradicación de la infección requiere mucho más altas exposiciones ABL (> 360 J / cm 2 ). (2) El inóculo de la bacteria es un parámetro clave para el desarrollo oinfecciones f. Un inóculo bacteriano más alto por lo general resulta en un grado más elevado de infección, mientras que un inóculo suficientemente baja frecuencia no a desarrollar infecciones estables en ratones. En esta última condición, la luminiscencia bacteriana por lo general se convierte en indetectable poco después de la inoculación bacteriana. (3) La interacción entre bacterias y huéspedes depende de las especies bacterianas. También utilizamos P. aeruginosa para desarrollar un modelo de infección. Hemos encontrado que, en las mismas condiciones (es decir, el tiempo y la quema de inóculo bacteriano), las infecciones causadas por P. aeruginosa progresaron mucho más rápidamente que las infecciones de A. baumannii, y sepsis siempre se observó en los ratones dentro de 48 h después de la inoculación 25.
Para la ejecución de la terapia ABL, hay varios puntos importantes que se deben abordar: se requiere (1) adecuada irradiación de luz para maximizar la eficacia de la terapia de ABL. (2) La superficie de la quemadura en los ratones should ser colocado lo más horizontalmente posible. Un fallo para posicionar apropiadamente la superficie quemadura puede comprometer la eficacia de la terapia ABL. (3) Durante la exposición a la luz, se sugiere que los ojos de los ratones protegidos con papel de aluminio, especialmente cuando se utiliza un láser como fuente de luz. (4) Durante la exposición a la luz, se debe tener cuidado para controlar los ratones en caso de que despiertan de la anestesia. En este caso, una pequeña dosis adicional de anestésicos debe ser administrado para mantener a los animales anestesiados. (5) Ambos ratones ABL-tratada y los ratones no tratados deben ser colocados en una cama de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo cuando está bajo anestesia. Durante el proceso de imágenes de bioluminiscencia, la bioluminiscencia de las bacterias podría disminuir cuando las quemaduras se secan. Por lo tanto, se recomienda para hidratar las quemaduras de ratón con PBS antes de la formación de imágenes.
Hay también algunas limitaciones de las técnicas discutidas en este protocolo: (1) Para el propósito de seguimiento de la extent de la infección en tiempo real, debe ser utilizado cepas de bacterias bioluminiscentes. Por lo tanto, antes de una cepa clínica puede ser probado en el modelo animal, se debe genéticamente modificado por la transfección de la lux CDABE operón 11. (2) La eficacia de ABL está relacionada con las longitudes de onda 33 y especies bacterianas / cepas 34 utilizado. Las longitudes de onda azules, junto con otros parámetros, deberían optimizarse aún más para la inactivación de diferentes especies / cepas bacterianas. (3) Sólo investigó infecciones superficiales en ratones. Para las infecciones profundas, la administración tópica de ABL no puede ser capaz de llegar a las infecciones, por lo que el suministro de luz intersticial puede ser necesario 35. (4) Hay una limitación sensibilidad del sistema de imágenes, especialmente cuando la formación de imágenes infecciones profundas 19. Como resultado, incluso cuando se eliminan por completo los píxeles de bioluminiscencia, es posible que todavía ser vicélulas bacterianas capaces restante, lo que permite el recrecimiento bacteriano que se produzca. Una exposición prolongada a ABL se recomienda después de la eliminación de la luminiscencia bacteriana con el fin de prevenir el recrecimiento bacteriano.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
References
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