Summary
يوضح هذا الأسلوب وسيلة فعالة لإعداد النسخ المتماثل أو المعيبة مخزونات فيروس ترميز الجين الورمي الإنسان ، واستخدمت لاحقا لتحريض مرض التكاثر النقيي في نموذج الفأر.
Abstract
لدينا مختبر دراسات الأمراض التي يسببها الإنسان من خلال التكاثر النقيي المسرطنة مثل BCR - ABL أو مستقبلات عامل النمو المشتق المسرطنة (ZNF198 - FGFR1 ، BCR - PDGFRα ، الخ). ونحن قادرون على نموذج ودراسة الأمراض التي تصيب البشر ، كما هو الحال في نموذج الفأر لدينا ، عن طريق زرع خلايا نخاع العظم المصاب سابقا مع الارتجاعي التعبير عن الجين الورمي في المصالح. النسخ المتماثل أو المعيبة الارتجاعي ترميز الجين الورمي الإنسان وتنتج علامة (GFP ، RFP ، والمضادات الحيوية الجينات المقاومة ، الخ) عن طريق بروتوكول ترنسفكأيشن عابرة باستخدام الخلايا 293T ، من حقوق الإنسان الكلوي خط الخلايا الظهارية تحويلها من قبل الجين المنتج E1A اتش. 293 الخلايا لديها خاصية غير معتادة للغاية التي يجري transfectable فوسفات الكالسيوم (كابو 4) ، مع ما يصل الى 50-80 ٪ كفاءة ترنسفكأيشن يمكن بلوغه بسهولة. هنا ، وشارك في 293 transfect نحن مع الخلايا ناقلات فيروسات التعبير عن الجين الورمي من الفائدة والبلازميد التي تعبر عن وظائف التغليف هفوة ، بول الحياة الفطرية ، مثل الجينوم واحدة والتغليف يبني القات أو PCL ، في هذه الحالة EcoPak البلازميد. كذلك تم تحسين ترنسفكأيشن الأولية باستخدام الكلوروكين. مخزونات فيروس ecotropic ، التي جمعت في 48 ساعة الثقافة طاف. بعد ترنسفكأيشن ، يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية وتستخدم للعدوى من خطوط الخلوي في ضوء التحول والدراسات في المختبر ، أو الخلايا الأولية مثل خلايا فأر نخاع العظام ، التي يمكن استخدامها للزراعة في نموذج الفأر لدينا .
Protocol
- في المساء قبل أن تحول الخلايا لوحة ، 293T في الخلايا 6 3 - 5x10 / 6 cultureplate الأنسجة سم.
ملاحظة : نحن نستخدم 293T الخلايا الخاصة بهم من أجل سهولة ترنسفكأيشن وخلايا الفيروس efficacyas المنتجة. هذه الخلايا هي نقص في التعبئة والتغليف للفيروس ما لم يتم إدخال المساعد البلازميد.
- في صباح اليوم الأول ، وإزالة بلطف المتوسطة واستبدالها مع 4 293T الخلية التي تحتوي على 25 مل بفندق الكلوروكين ملم. وضعت في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة : لوحة يجب أن حوالي 80 ٪ متموجة.
- وفي الوقت نفسه ، يعد فيروس صنع الخليط لمدة 2 لوحات في كل مرة ، في أنابيب 5 مل :
- 2 × 10 ملغ بناء البلازميد فيروسات
- 2 × 5 ملغ التعبئة والتغليف بناء (EcoPak)
- 2 × 62 مل CaCl
- كاملة إلى 1 مل العقيمة مع O 2 DDH
ملاحظة : على الرغم من أن فيروسات البلازميد بترميز الجين الورمي المصالح وعلامة أ ، EcoPak بترميز هفوة بول - ENV. جنبا إلى جنب مع خلايا 293T ، فإنها تنتج الارتجاعي ecotropic (RV) محددة للخلايا فأر ، ولكن ليس معديا للخلايا البشرية. وقد تبين أن كلا الكلوروكين و 2 CaCl لزيادة الكفاءة ترنسفكأيشن.
- إضافة 1ml من sterileHBS 2X إلى مزيج من الحكمة انخفاض ، بينما vortexing بلطف الأنبوب.
- إضافة إلى هذا الحل فورا لوحات 2 ، 1 مل لكل منهما ، بلطف ، قطرة قطرة.
- وضع في حاضنة لل7-11 ساعات.
- في المساء (7-11 ساعات. في وقت لاحق) ، وإزالة بلطف المتوسط ، وبلطف جدا استبدال مع 5 مل المتوسطة 293T الطازجة. وضعت في الحاضنة حتى الظهر ، في اليوم التالي.
ملاحظة : هذه الخطوة الهامة ، كما تحتاج إلى خلع الكلوروكين من الخلايا. إذا كان يحتفظ بها لفترات طويلة من الزمن ، الكلوروكين هي سامة. الحل في لوحات تبدو غامضة ، وذلك بسبب هطول الأمطار ناعم جدا مثل الغبار ، من خليط ترنسفكأيشن.
ملاحظة : من المهم القيام بكل التغييرات وسائل الاعلام مع الرفق المدقع ، كما تم توعية الخلايا التي الكلوروكين ، ويمكن فصل بسهولة من لوحة.
- في اليوم التالي ، 18 إلى 24 ساعة. قبل استرداد فيروس (حوالي الظهر) ، وإزالة بلطف المتوسط ، وبلطف جدا استبدال مع 3 مل المتوسطة 293T الطازجة. استبدال في حاضنة O / N.
- في صباح اليوم الثالث (18-24 ساعة. احقا) ، وتمتص برفق على شكل لوحات متوسطة مع حقنة 10 مل مزودة بإبرة G 18. هذا طاف يحتوي على الفيروس الارتجاعي.
- تغيير الإبرة إلى حقنة تصفية 45 ملم ، وعكس عدة مرات حقنة لخلط الحل أيضا ، من خلال تمرير طاف التصفية ، وقسامة في cryotubes
ملاحظة : بدلا من ذلك ، إذا كنت ترغب بجعل + 3 لوحات من الفيروس ، وتجمع كل supernatants من الفيروس نفسه في أنبوب 5 مل 0 المخروطية. المزيج جيدا ، ثم supernatants قسامة التي تحتوي على الفيروس الارتجاعي في cryotubes بواسطة التصفية.
- يتم الاحتفاظ الأنابيب التي تحتوي على الفيروسات supernatants الكاملة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأربع نقاط حاسمة ضمان نجاح الأسهم الجيدة فيروسية :
- الخلايا المنتجة 293T أن يكونوا أصحاء للغاية ، وهذا يعني أنهم قد انقسم على جدول منتظم للغاية ، لم تكن متضخمة ، ومطلية في كثافة الأمثل من 3،5-5٬000٬000 في 6 سم نسيج لوحة الثقافة ، بحيث تصل الكثافة 80 ٪ من لوحة في صباح يوم من ترنسفكأيشن.
- إضافة الكلوروكين يحسن كفاءة ترنسفكأيشن واللاحقة عيار الفيروس ، وحوالي 3 -- لأضعاف - 5 ، عن طريق تثبيت lysozomes الخلية وزيادة نسبة ضئيلة من الحمض النووي الذي يصل إلى النواة. كما تم الزبدات الصوديوم (آخر استقرار يحلول) المستخدمة لهذا الغرض. ويمكن حذف الكلوروكين ، وفي هذه الحالة تغيير المتوسطة 7-11 ساعات. ليس مطلوبا بعد ترنسفكأيشن عند هذه النقطة.
- نوعية الحمض النووي مهم جدا. تتم تنقيته مرتين الأسلوب المفضل لتنقية كل من ناقلات التعبئة والتغليف والسلطات الوطنية المعينة من قبل البلازميد CSCL - إيثيديوم الطرد المركزي بروميد كثافة مرتفعة. نود تركيز الحمض النووي ليكون على الأقل 1 ملغم / لتر ، ونسبة 260/280 OD يجب أن تكون بين 1،75-1،90. سوف Qiagen DNA - تنقية العمل أيضا ، على الرغم من ، في أيدي الكتاب ، فإن النتائج ليست جيدة. من المهم أن حجم الحمض النووي من الحلول مجتمعة أن تكون صغيرة (<50 في مجموع المجاهدين مل النهائي) لتجنب الآثار السلبية للتريس وEDTA (TE) على الكالسيوم تترسب الفوسفات.
- اختيار مجموعة النواقل والمضيفة للفيروسات بناء التغليف مهمة. للتعبير مستقرة في الفئران الخلايا الجذعية المكونة للدم ، ويفضل على أساس ناقل فيروس ساركومة التكاثر النقيي. والعمود الفقري شيوعا هو متجه RI MIG ، التي تحتوي على تكرار MPSV محطة الطويلة التسلسل ، وهو موقع استنساخ متعددة لإدخال من الجين الورمي ، والمتلقين للدخول الريبوسوم الداخلية موقع مرتبط الجين للبروتين الفلورية الخضراء المعززة (eGFP). لتنبيغ HSC من الماوس ، وفيروس مع مجموعة استضافة ecotropic هو الأمثل ، ولكن هذه الأرصدة غير مستقرة في درجات الحرارة وفيزيولوجية لا يمكن أن تتركز بواسطة الطرد المركزي.
بعض نقاط التفتيش : إذا كان المطلوب ، تحصد مرة واحدة ، ويمكن استخدام الخلايا من 293 إلى البروتين لجعل lysates immunoblotting للتحقق من التعبير عن البروتينات المشفرة بواسطة ناقلات فيروسات (مثل المعارف التقليدية). ونحن أيضا استخدام التحكم ترميز LacZ البلازميد في طبق منفصل في وقت ترنسفكأيشن (لا توجد ناقلات التعبئة والتغليف اللازمة) للتحقق من efficinecy ترنسفكأيشن بواسطة بيتا غال مقايسة عندما نجمعها وطاف في لوحات أخرى. ملاحظة : هذه ستكون اختبارا للخلايا والكواشف ، ولكن ليس على نوعية البلازميدات تستخدم لصنع الفيروس.
قبل استخدام أي فيروس ، وعيار يتعين تحديدها. هذا أمر بالغ الأهمية من أجل مباراة التتر مخزونات فيروس مختلفة في التجربة نفسها ، وضمان كفاءة تنبيغ من الخلايا الجذعية المكونة للدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A.
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
