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ड्रोसोफिला तैयारी और दिल समारोह विवो में ऑप्टिकल जुटना माइक्रोस्कोपी का उपयोग के अनुदैर्ध्य इमेजिंग (ओसीएम)

Published: December 12, 2016 doi: 10.3791/55002
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2, 3,4, 2,3, 4, 5, 5, 1,2,3
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Introduction

छोटे जानवरों में दिल के अनुदैर्ध्य अध्ययन में इस तरह के जीन से संबंधित जन्मजात हृदय दोष 1,2 के रूप में मानव संबंधित हृदय रोगों की एक किस्म को समझने के लिए योगदान देता है। पिछले दशकों में, इस तरह माउस 3,4, 5,6 Xenopus, zebrafish 7,8, एवियन 9, और ड्रोसोफिला 10-16 के रूप में विभिन्न पशु मॉडल में, मानव हृदय-विकास से संबंधित अनुसंधान का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। माउस मॉडल व्यापक रूप से सामान्य और असामान्य हृदय विकास और मानव हृदय 3,4 के साथ अपनी समानता के कारण हृदय दोष phenotypes अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Xenopus भ्रूण इसकी आसान हैंडलिंग और आंशिक पारदर्शिता 5,6 के कारण दिल के विकास के अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है। भ्रूण और zebrafish मॉडल के शुरुआती लार्वा की पारदर्शिता हृदय विकास 7.8 की आसान ऑप्टिकल अवलोकन के लिए अनुमति देता है। एवियन मॉडल विकासात्मक दिल के अध्ययन का एक आम विषय है becausई दिल आसानी से अनावश्यक कार्य और मनुष्यों से 9 एवियन दिल की रूपात्मक समानता को हटाने के बाद पहुँचा जा सकता है। ड्रोसोफिला मॉडल है जो यह दिल की अनुदैर्ध्य अध्ययन के प्रदर्शन के लिए आदर्श बनाते हैं कुछ अद्वितीय विशेषताएं है। सबसे पहले, ड्रोसोफिला के दिल ट्यूब पृष्ठीय सतह के नीचे ~ 200 माइक्रोन, जो ऑप्टिकल उपयोग और दिल के अवलोकन के लिए सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कई आणविक तंत्र और आनुवंशिक रास्ते ड्रोसोफिला और रीढ़ के बीच संरक्षित कर रहे हैं। मानव रोग जीन का 75% से अधिक की orthologs ड्रोसोफिला, जो यह व्यापक रूप से ट्रांसजेनिक अध्ययनों 11,13 में इस्तेमाल बना दिया है में पाए गए। इसके अलावा, यह एक छोटे से जीवन चक्र और कम रखरखाव लागत है, और आमतौर पर विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान 14-16 के लिए एक नमूना मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

पिछली रिपोर्टों जैसे ड्रोसोफिला हृदय कार्यों की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है वहArtBeat। हालांकि, विच्छेदन प्रक्रियाओं 17,18 आवश्यक थे। ऑप्टिकल इमेजिंग अपने गैर-आक्रामक प्रकृति के कारण पशुओं में हृदय विकास कल्पना करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। अलग ऑप्टिकल इमेजिंग तौर तरीकों में इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी 19, confocal माइक्रोस्कोपी 20,21, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 22, और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) 16,23-26 के रूप में प्रदर्शन पशु हृदय अध्ययन में लागू किया गया है। तुलनात्मक रूप से, अक्टूबर, विपरीत एजेंटों का उपयोग किए बिना छोटे जानवर दिलों में महान इमेजिंग गहराई प्रदान करने के लिए एक उच्च संकल्प और एक ultrahigh इमेजिंग गति है, जो इमेजिंग जीवित पशुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं रखते हुए करने में सक्षम है। इसके अतिरिक्त, एक अक्टूबर प्रणाली विकसित की कम लागत के नमूनों की ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए इस तकनीक को लोकप्रिय बनाया गया है। अक्टूबर सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। का उपयोग अक्टूबर, हृदय रूपात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग दिल संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है, समारोहजीन की राष्ट्रीय भूमिका, और हृदय के विकास के दौरान उत्परिवर्ती मॉडल में हृदय दोष के तंत्र। उदाहरण के लिए, उम्र पर निर्भर हृदय समारोह में गिरावट नीचे विनियमित एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम से संबंधित (ACER) ड्रोसोफिला में अक्टूबर 27 के साथ जीन के साथ की पुष्टि की थी। जीन से संबंधित कार्डियोमायोपैथी के phenotyping अक्टूबर 28-33 का उपयोग कर ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया गया। अनुसंधान OCT का उपयोग भी ड्रोसोफिला 34 के दिल में मानव जीन SOX5 के कार्यात्मक भूमिका का पता चला। अक्टूबर के साथ तुलना में, ओसीएम बेहतर अनुप्रस्थ संकल्प प्रदान करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य उपयोग करता है। अतीत में, दिल एक ortholog मानव circadian जीन dCry / dClock मुंह बंद करने की वजह से रोग एक कस्टम ओसीएम प्रणाली 15,16, साथ ही ड्रोसोफिला में cardiomyopathies पर उच्च वसा वाले आहार के प्रभाव का उपयोग कर मोटापा प्रेरित मानव समझने के लिए अध्ययन किया गया है हृदय रोगों। 15

इधर, वेंई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दूसरे instar (एल 2), तीसरे instar (L3), प्यूपा दिन 1 (PD1), प्यूपा दिन 2 (PD2), प्यूपा दिन 3 पर ड्रोसोफिला में हृदय रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए संक्षेप (PD3) , प्यूपा दिन 4 (PD4), प्यूपा दिन 5 (PD5), और वयस्क (चित्रा 1) ओसीएम का उपयोग करते हुए मानव से संबंधित जन्मजात हृदय रोगों के अध्ययन की सुविधा के लिए। इस तरह के मानव संसाधन और टोपी के रूप में कार्डिएक कार्यात्मक मापदंडों, मात्रात्मक विकास के विभिन्न चरणों में विश्लेषण किया गया हृदय विकास सुविधाओं प्रकट करते हैं।

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Protocol

ड्रोसोफिला 16 के ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए ओसीएम प्रणाली के 1. तैयारी

  1. एक स्पेक्ट्रोमीटर और एक उच्च गति लाइन स्कैन कैमरा है कि कम से कम 80 फ्रेम / सेकंड की एक फ्रेम दर प्रदान करता है ताकि ओसीएम प्रणाली ड्रोसोफिला के दिल की धड़कन को हल करने में सक्षम हो जाएगा का चयन करें।
  2. एक ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत का उपयोग 2 माइक्रोन का अक्षीय संकल्प सुनिश्चित करने के लिए ड्रोसोफिला के दिल संरचना की पहचान करने के लिए।
  3. एक उच्च अनुप्रस्थ संकल्प प्राप्त करने के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. संदर्भ बांह प्रकाश किरण को प्रतिबिंबित करने के लिए और नमूनों में ध्यान की गहराई का विस्तार करने के लिए एक कुंडलाकार नमूना बांह प्रकाश किरण उत्पन्न करने के लिए एक 45 डिग्री रॉड दर्पण का प्रयोग करें।
  5. एक कस्टम कंप्यूटर ओसीएम प्रणाली नियंत्रण और माप प्रदर्शन करने के लिए कार्यक्रम का विकास करना।

2. ड्रोसोफिला संस्कृति

  1. स्टैंडर्ड मक्खी भोजन तैयारी
    1. एक polystyrene शीशी में ~ 5 मिलीलीटर तत्काल ड्रोसोफिला सूत्र रखोएक कागज ढलान की सहायता के साथ ट्यूब।
    2. ठीक से खाना तर करने के लिए सूत्र में ~ 8 मिलीलीटर पानी डालो।
    3. विभिन्न प्रयोगों के लिए मानक मक्खी भोजन करने के लिए अलग अलग की खुराक जोड़ें। जब optogenetic के लिए सब ट्रांस -retinal (एटीआर) भोजन के लिए तैयारी प्रयोग 35 पेसिंग, एक पिपेट 100 मिमी एटीआर निकालने और मिलीलीटर ~ में 8 पानी भंग भोजन में 1 मिमी की एटीआर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल करते हैं। समान रूप से समाधान मिश्रण के बाद, सूत्र में समाधान डालना और यह पर्याप्त रूप से हलचल।
    4. एक उच्च वसा आहार ड्रोसोफिला में मोटापे से संबंधित हृदय रोग के अध्ययन के लिए एक माइक्रोवेव ओवन में 30 सेकंड के लिए एक कप और गर्मी में 15 मिलीलीटर पानी के साथ 10 मिलीलीटर फार्मूला तैयार करते हैं, 10,15 मिश्रण ~। एक और कप में कुछ कार्बनिक अतिरिक्त कुंवारी नारियल तेल डाल माइक्रोवेव ओवन में 90 सेकंड के लिए यह गर्मी।
    5. 7.5 मिलीलीटर नारियल तेल निकालने और तैयार फार्मूले के साथ मिश्रण पर्याप्त भोजन ~ 30/100, और वें के लिए वजन / नारियल तेल की मात्रा के अनुपात बनाने के लिएएन निकालने ~ 2 मिलीलीटर मिश्रित भोजन और यह एक ट्यूब के नीचे डाल दिया।
    6. 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक मध्यम अच्छी तरह से संतृप्त है। एक सपाट सतह के साथ सावधानी से भोजन संकुचित ड्रोसोफिला के लिए रहने की स्थिति अनुकूलन करने के लिए। खमीर के 8 अनाज से तैयार करने के लिए सूत्र, और कपास के एक समूह के साथ ट्यूब प्लग - 6 जोड़े।
  2. फल मक्खी पार और संस्कृति
    1. तैयार मानक मक्खी भोजन के साथ एक ट्यूब ले लो, और खामियों को दूर कपास को हटा दें। ध्यान से वयस्क मक्खियों ट्यूब के लिए (पुरुष और महिला) हस्तांतरण, और तुरंत कपास के साथ ट्यूब प्लग। यकीन है कि कपास और ट्यूब से भागने से रोकने के लिए मक्खियों ट्यूब दीवार के बीच कोई अंतर नहीं है कि बनाने के लिए कपास की जाँच करें।
    2. क्रॉस प्रजनन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में फल मक्खियों रखें। जीन की सबसे अधिक सक्रिय हैं और सेलुलर प्रोटीन 25 डिग्री सेल्सियस 36-39 में संश्लेषित कर रहे हैं।
    3. ट्यूब 8 हाथ हस्तांतरण एक के बाद इनक्यूबेटर से बाहर ले जाओdult ट्यूब के बाहर मक्खियों प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए समान उम्र में अंडे प्राप्त करने के लिए।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस है, जो 8.5 दिनों 40,41 के विकास की अवधि के साथ ड्रोसोफिला विकास के लिए मानक तापमान इनक्यूबेटर में अंडे संवर्धन जारी रखें।
      नोट: तापमान विकासात्मक अवधि (वयस्क के लिए अंडे) और विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित करती है।

3. ओसीएम के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदर्शन

  1. ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए माउंट फ्लाई लार्वा
    नोट: 22 में ड्रोसोफिला hatches के अंडे - पहली instar लार्वा (एल 1) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा। दूसरी instar लार्वा एक और 24 घंटे के बाद उभर रहे हैं। सबसे बड़ा लार्वा प्रपत्र तीसरे instar लार्वा, जो के बारे में 24 घंटे के बाद molts है। लार्वा में संरचनात्मक विशेषताओं को अपने विकास के विभिन्न चरणों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पहली और दूसरी instar instar के बीच mouthparts का आकार अलग है। मुहपहले instar लार्वा के हुक बहुत छोटे हैं और छोटे काले धब्बे के दो जोड़े की तरह लग रही है, जबकि दूसरी instar लार्वा के मुंह हुक बड़े होते हैं और संरचना स्पष्ट है। spiracles आम तौर पर दूसरी instar और तीसरे instar की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। दूसरी instar लार्वा, पूर्वकाल spiracles व उनसे गया है, जबकि तीसरे instar के लिए, पूर्वकाल spiracles branched रहे हैं। एक गहरे नारंगी अंगूठी तीसरे instar लार्वा में पीछे spiracles की नोक पर प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा।
    1. एक साफ खुर्दबीन गिलास स्लाइड के लिए दो तरफा टेप का एक टुकड़ा लागू करें। टेप के तहत हवाई बुलबुले निष्कासित इमेजिंग के दौरान हवा के बुलबुले की वजह से विचार से बचने के लिए।
    2. लार्वा चरण में इनक्यूबेटर से बाहर सुसंस्कृत मक्खियों के साथ ट्यूब की एक लो।
    3. मीडिया में लार्वा को पहचानें एक नरम ब्रश और एक साफ ऊतक पर जगह के साथ मीडिया से हटा दें। एक गीला नरम ब्रश के साथ किसी भी भोजन लार्वा के लिए अटक गया निकालें और ऊतक पर सूखी।
    4. cleane ले जाएँएक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के तहत एक ऊतक के लिए उड़ान भरने घ।
    5. मक्खी की एक स्पष्ट दृष्टिकोण लगाने के लिए माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित को समायोजित करें। माइक्रोस्कोप के साथ अपनी संरचनात्मक विशेषताओं से लार्वा के सही विकास के चरण को पहचानें।
    6. मुलायम ब्रश का उपयोग कर मक्खी की स्थिति। सुनिश्चित शरीर को सीधा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पृष्ठीय पक्ष द्वारा गिलास स्लाइड पर बढ़ते के लिए तैयार करने के लिए पृष्ठीय पक्ष के साथ है। माइक्रोस्कोप के तहत यह कदम प्रदर्शन करना।
    7. सुनिश्चित करें लार्वा टेप पर बढ़ते से पहले पूरी तरह से सूखा है। अन्यथा, लार्वा टेप का पालन नहीं करेंगे।
    8. मध्यम दबाव के साथ कांच स्लाइड पर डबल साइड टेप करने के लिए तैनात मक्खी के पृष्ठीय पक्ष चिपके रहते हैं। ध्यान दें कि बहुत अधिक दबाव इमेजिंग के दौरान आंदोलन के लिए उड़ान भरने के लिए ले जाएगा मक्खी और बहुत कम बल को मार सकता है।
  2. ओसीएम साथ लार्वा चरणों (एल 2 और L3) में ड्रोसोफिला के ऑप्टिकल इमेजिंग
    नोट: दिल ट्यूब के एक व्यापक लुमेन के लिए हो सकता हैअंड (चित्रा 1) लार्वा चरणों में ए 8 को A5 के बीच खंडों में स्थित है। अनुप्रस्थ ओसीएम एम मोड छवियों (2 डी + समय) प्रत्येक लार्वा सिस्टोलिक और डायस्टोलिक विश्लेषण की सुविधा के लिए दिल ट्यूब के उ 7 खंड पर हासिल किया गया।
    1. उद्देश्य लेंस नीचे से ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पृष्ठीय पक्ष के साथ वाई-अनुप्रस्थ दिशा साथ ओसीएम प्रणाली के समायोज्य नमूना मंच पर मुहिम शुरू की लार्वा रखें। नमूना चरण में एक छोटा सा छेद लार्वा रखने चरण विमान के साथ अपने संपर्क से बचने के लिए आवश्यक है।
    2. फल का दिल ट्यूब इमेजिंग किरण के फोकल हवाई जहाज़ के लिए उड़ान भरने स्थानांतरित करने के लिए नमूना मंच समायोजित करें। आसानी से उ 7 खंड खोजने के लिए, वास्तविक समय छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में क्रॉस अनुभागीय ओसीएम छवियों के साथ दिल ट्यूब के पीछे क्षेत्र पाते हैं। तब चरण आगे ले जाने के लिए जब तक ए 7 खंड दिख रहा है।
    3. प्रति बी-स्कैन 100 ए-स्कैन (फ्रेम), 100 बी स्कैन करने के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का सेट पैरामीटर, और scanneआर वोल्टेज एक्स-अनुप्रस्थ दिशा में ~ 0.28 मिमी, और 0 वाई-अनुप्रस्थ दिशा में वी कवर करने के लिए। एक काले कपड़े से नमूना किरण पथ अवरुद्ध करके पृष्ठभूमि घटाव के लिए पृष्ठभूमि शोर डेटा प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर में "शुरू" बटन पर क्लिक करें।
      नोट: 100 फ्रेम के 3 पृष्ठभूमि घटाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. प्रति बी-स्कैन 128 ए-स्कैन, 4096 बी-स्कैन, और स्कैनर वोल्टेज के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के निर्धारित मापदंडों एक्स-अनुप्रस्थ दिशा में ~ 0.28 मिमी, और 0 वी वाई-अनुप्रस्थ दिशा में कवर करने के लिए। के बारे में 30 सेकंड के लिए 0.28 x 0.57 मिमी 2 कवर क्षेत्र पर मक्खी दिल ट्यूब के उ 7 खंड के पार अनुप्रस्थ एम मोड छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर में "शुरू" बटन पर क्लिक करें।
    5. डेटा को बचाने की प्रक्रिया के दौरान एक काले कपड़े का उपयोग इमेजिंग प्रकाश के लिए उड़ान भरने दिल की लंबी जोखिम से बचने के लिए इमेजिंग किरण ब्लॉक।
    6. 5 बार के लिए माप दोहराएँ दिल मज़ा के विश्वसनीय माप पाने के लिएction।
    7. प्रति बी-स्कैन 400 ए-स्कैन, 800 बी स्कैन, और स्कैनर वोल्टेज के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के निर्धारित मापदंडों एक्स-अनुप्रस्थ दिशा में ~ 1.7 मिमी कवर, और वाई-अनुप्रस्थ दिशा में ~ 4 मिमी के लिए। यह सुनिश्चित करने के लिए पूरे फल मक्खी imaged किया जा सकता दोनों दिशाओं में मंच ले जाएँ। एक डाटासेट प्राप्त करने के लिए 3 आयामों में फल मक्खी की छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर में "शुरू" बटन पर क्लिक करें। नोट: 3 डी मक्खी संरचना अमीरा 3 डी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गाया जा सकता है
    8. मापा मक्खी गीला करना और धीरे गिलास स्लाइड से इसे हटाने के लिए एक गीली मुलायम ब्रश का उपयोग करें। यह सतत विकास के लिए एक अलग ट्यूब में ले जाएँ। अगले विकास के चरणों के माध्यम से अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए ट्यूब लेबल।
  3. पोटा संबंधी चरणों में छवि ड्रोसोफिला
    नोट: सभी फल मक्खियों PD1 से PD5 करने के लिए इमेजिंग के लिए बाहर ले जाया गया। जैसा कि चित्र 1 बी में लार्वा योजनाबद्ध में दिखाया गया है, एक व्यापक लुमेन वीं की ए 8 क्षेत्रों के लिए ए 5 में रहता हैPD1 जब तक ई दिल ट्यूब। PD2 से, एक शंक्वाकार चैम्बर A4 क्षेत्रों के लिए A1 के बीच विकसित करने के लिए शुरू होता है। लगातार छवियों के अधिग्रहण और दिल विश्लेषण की सुविधा के लिए, अनुप्रस्थ एम मोड छवियों PD1 पर उ 7 खंड से प्राप्त किया, और PD2 के बाद A1 खंड से, चित्रा 1 बी में के रूप में चिह्नित किया गया।
    1. PD1 पर छवि ड्रोसोफिला
      नोट: ड्रोसोफिला एक कम समय खिड़की के लिए एक सफेद puparium होगा (0 - 1 घंटा) PD1 के दौरान। इस बार खिड़की जल्दी प्यूपा के ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदर्शन क्योंकि उच्च पारदर्शिता ओसीएम इमेजिंग के लिए उच्च प्रकाश प्रवेश करने के लिए सुराग के लिए आदर्श है।
      1. के रूप में फल मक्खियों ट्यूब दीवार पर पाए जाते हैं, जब वे प्यूपा बनने के लिए, एक गीला नरम ब्रश के साथ PD1 पर इमेजिंग के लिए अलग-अलग ट्यूब से हटाने प्यूपा, और अगर वहाँ शरीर के लिए अटक गया भोजन है ब्रश के साथ प्यूपा साफ।
      2. गीला ब्रश के साथ सीधे एक छोटा गिलास स्लाइड पर फल मक्खी माउंट और पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रखने (चित्रा 1 ए
      3. मक्खी शरीर की ओर से अत्यधिक पानी निकाल दें।
      4. ओसीएम प्रणाली का नमूना मंच पर कांच स्लाइड रखो, शीर्ष पर फल मक्खी रखे हुए हैं। मक्खी दिल में एक ही रणनीति लार्वा माप में वर्णित के उपयोग के उ 7 खंड के स्पष्ट वास्तविक समय छवि का पता लगाएं।
      5. धारा 3.2 में के रूप में डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का एक ही मापदंड सेट करें, और छवि ए 7 खंड पर दिल की धड़कन को अनुप्रस्थ एम मोड और 3 डी छवियों को प्राप्त करने के लिए।
      6. इमेजिंग के बाद, पीठ निरंतर संस्कृति के लिए ट्यूब में प्यूपा के साथ कांच स्लाइड जगह के लिए एक चिमटी से नोचना का उपयोग करें।
    2. PD5 चरणों के PD2 पर छवि ड्रोसोफिला
      नोट: चूंकि नमूना अधिक से अधिक अपारदर्शी पोटा संबंधी चरणों के दौरान हो जाता है, इमेजिंग प्रणाली के प्रवेश गहराई कम हो जाएगा।
      1. ध्यान से गिलास रों को हटाने के लिए एक चिमटी से नोचना उपयोगLIDE इमेजिंग के लिए ट्यूब से PD2 पर उड़ान भरने के साथ मुहिम शुरू की। PD2 में नमूना खोल पीले हो जाता है और शरीर PD1 (चित्रा 1) की तुलना में कम पारदर्शी हो जाता है।
      2. ओसीएम प्रणाली का नमूना मंच पर स्लाइड रखो।
      3. ओसीएम प्रणाली की इमेजिंग किरण के फोकल हवाई जहाज़ में मक्खी स्थानांतरित करने के लिए नमूना मंच समायोजित करें। वास्तविक समय पार के अनुभागीय ओसीएम छवि के साथ दिल ट्यूब के पूर्वकाल अंत का पता लगाएं। 50 माइक्रोन पीछे दिशा में वापस ले जाएँ ~ दिल ट्यूब के A1 खंड खोजने के लिए।
        नोट: दिल विकास (PD2) के इस बिंदु पर, शंक्वाकार चैम्बर बहुत छोटा हो जाएगा और पिटाई नहीं की जा सकती है।
      4. A1 खंड से अनुप्रस्थ एम मोड डेटासेट के साथ ही पिछले विकास के चरणों के रूप में एक ही विधि का उपयोग कर 3 डी डेटा ले लीजिए।
      5. स्लाइड निरंतर संस्कृति के लिए ध्यान से ट्यूब को वापस रखो।
        नोट: PD3 में खोल में नमूना के रंग है कि PD2 स्तर पर अधिक गहरा है। PD4 स्तर पर, काली धारियों सीएn नमूनों के खोल के अंदर मनाया जा। कुछ मक्खियों, अगले दिन में इस स्तर से वयस्क के रूप में विकसित, जबकि दूसरों को PD5 में विकसित होगा। PD5 स्तर पर, काली धारियों और भी अधिक स्पष्ट रूप से फल मक्खियों में देखा जाता है। इन मक्खियों अगले दिन में वयस्क हो जाएगा।
  4. वयस्क अवस्था में छवि ड्रोसोफिला
    नोट: वयस्क अवस्था में महिला और पुरुष मक्खियों शरीर के आकार और पेट के निचले हिस्से के रंग से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। महिला वयस्क, बड़े आकार के है, जबकि पुरुषों के छोटे और काले रंग का पेट के निचले हिस्से में हैं।
    1. इनक्यूबेटर से ट्यूब बाहर ले लो जब फल मक्खी एक वयस्क के रूप में विकसित करता है, और वयस्क एक ~ 45 मिलीलीटर खाली शीशी के लिए उड़ान भरने के लिए स्थानांतरण।
    2. संज्ञाहरण में एक छड़ी के शोषक अंत (~ 1 सेमी लंबाई, ~ 3 मिमी व्यास) डुबकी, शीशी में छड़ी डाल दिया, और सिर्फ खामियों को दूर कपास नीचे करने के लिए और संवेदनाहारी के अंत रखने के लिए कपास के एक समूह के साथ ट्यूब प्लग ANES3 मिनट के लिए मक्खी thetize। संज्ञाहरण की अवधि के लिए उड़ान भरने के आकार पर निर्भर करता है, और 2.5 करने के लिए 3.5 मिनट के बीच भिन्न हो सकते हैं (उदाहरण के लिए: के लिए 2.5 मिनट के लिए 3 या 3.5 मिनट पुरुष, महिला)।
    3. दो तरफा टेप का एक टुकड़ा के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार करें।
    4. पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ मुलायम ब्रश का उपयोग के साथ कांच स्लाइड पर anesthetized मक्खी ले जाएँ।
    5. एक चिमटी से नोचना का उपयोग कर पंखों को अलग करें और एक खुर्दबीन के नीचे टेप पर पंख छड़ी मक्खी को ठीक करने और इमेजिंग के लिए हृदय क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए।
    6. छवि मक्खी दिल की A1 खंड से मक्खी (चित्रा 1)। प्रयोग के अंत में, मक्खी बलिदान किया जा सकता है।

4. इमेजिंग विश्लेषण 16

  1. मैटलैब कार्यक्रमों का विकास 2 डी और 3 डी बाइनरी छवि फ़ाइलों के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एकत्र फ़ाइलों को परिवर्तित करने के लिए।
  2. अनुप्रस्थ एम मोड छवियों में दिल ट्यूब क्षेत्र और एक जादू की छड़ी एल्गोरिथ्म की पहचान करने के लिए creat करने के लिए ImageJ का प्रयोग करेंप्रत्येक अनुप्रस्थ एम मोड छवि के लिए दिल क्षेत्र के ईए मुखौटा। खंड नकाबपोश क्षेत्र और एक चोटी खोजने कलन विधि का उपयोग सिस्टोलिक और डायस्टोलिक स्थानों की पहचान करने के लिए। अनुप्रस्थ एम मोड छवियों से समय निर्भर दिल व्यास परिवर्तन की गणना।
  3. का अधिग्रहण समय निर्भर दिल व्यास के आधार पर, इस तरह के मानव संसाधन, हृदय की गतिविधि की अवधि (कैप), अंत पाद लंबा व्यास (EDD), अंत सिस्टोल व्यास (ईएसडी), अंत पाद लंबा क्षेत्र (EDA) के रूप में हृदय मापदंडों की गणना, और सिस्टोल क्षेत्र अंत ( ईएसए)। आंशिक छोटा (एफएस) के साथ की गणना 1 समीकरण
  4. ImageJ का उपयोग मक्खी दिल के संरचनात्मक विकास कल्पना करने के लिए 3 डी ओसीएम छवियों का विश्लेषण करने के लिए।

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Representative Results

अनुदैर्ध्य हृदय इमेजिंग 24B-Gal4 / + ओसीएम के साथ कमरे के तापमान पर तनाव के साथ फल मक्खियों का उपयोग किया गया था। माप एल 2, एल 3 पर प्रदर्शन किया गया है, और PD4 को PD1 से 8 घंटे के अंतराल पर, और वयस्क दिन 1 (AD1) कायापलट की प्रक्रिया (तालिका 1) ट्रैक करने के लिए। लार्वा, प्यूपा जल्दी, देर से प्यूपा और वयस्क मक्खियों गिलास स्लाइड चित्रा 1 ए के रूप में देखा पर बढ़ रहे थे। लार्वा और वयस्क मक्खियों के लिए दिल के खंड सुविधाओं चित्रा 1 बी में योजनाबद्ध अभ्यावेदन में दिखाया गया।

इस विकास अध्ययन में 4,096 फ्रेम एक फल मक्खी के दिल की धड़कन का पता लगाने के लिए हमारे कस्टम ओसीएम प्रणाली के साथ 32 सेकंड में हासिल किया गया। माप सटीकता में सुधार करने के लिए, पांच दोहराया माप प्रत्येक विकास के चरण में प्रत्येक नमूना के लिए ले जाया गया। 3 डी आंकड़े यह भी कायापलट के दौरान दिल संरचना में परिवर्तन निरीक्षण करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है।

ट्रांसवर्स एम मोड और 3 डी छवियों ग थे कस्टम मैटलैब कार्यक्रमों और ImageJ के साथ reated। चेहरा छवियों और अक्षीय वर्गों भी ड्रोसोफिला कायापलट (चित्रा 2) के दौरान दिल के पुनर्गठन की प्रक्रिया कल्पना करने के लिए अधिग्रहीत डेटा से निर्माण किया गया एन। फल मक्खियों के हृदय समारोह यों, दिल क्षेत्र स्वचालित रूप से सभी 4096 तख्ते से एक कस्टम मैटलैब प्रोग्राम का उपयोग कर खंडित किया गया था। (चित्रा 3 ए) मक्खी दिल की दर (मानव संसाधन) अनुप्रस्थ एम मोड ओसीएम छवियों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। पोटा संबंधी चरण के दौरान, ड्रोसोफिला दिल कभी कभी 16 की धड़कन बंद हो जाता है। हम एक नया हृदय कार्यात्मक पैरामीटर, हृदय की गतिविधि की अवधि (कैप) की शुरुआत की कुल इमेजिंग समय के लिए एक दिल की धड़कन के साथ अवधि के अनुपात यों (चित्रा 3 बी)। EDD, ESD, EDA, ईएसए, और FS भी ड्रोसोफिला विकास के दौरान दोनों अक्षीय और अनुप्रस्थ आयामों में दिल चैम्बर परिवर्तन यों इस्तेमाल किया गया था। 16

सामग्री "> लार्वा चरणों में, दिल ट्यूब एक व्यापक लुमेन के साथ पीछे पेट क्षेत्र ए 8 पर शुरू होता है (A5 - चित्रा 1 बी में ए 8) और एक संकरा व्यास (T3 / A1 के साथ पूर्वकाल पृष्ठीय खंड A1 पर समाप्त होता है - चित्रा 1 बी में A5 )। दिल चैम्बर मध्यवर्ती और पीछे की ओर स्थित था और एल 2 (चित्रा 2 ए, बी) और L3 (चित्रा 2 ग के दौरान बड़ा हुआ, घ)। PD1 प्रवेश करने के बाद, दिल ट्यूब एक चलती हवा के शीर्ष पर अक्षीय रूप से चल रहा है मनाया गया बुलबुला (चित्रा 2 ई, एफ) के लगभग 10 -। 13 घंटा के बाद, बुलबुला puparium गठन के बाद गायब हो गया और व्यापक लुमेन बन everted के बाद से पूर्वकाल दिल ट्यूब पेट के बल स्थित था, पूरे दिल ट्यूब में पीछे क्षेत्र को छोड़कर अदृश्य था। । ओसीएम छवियों ~ puparium गठन के बाद 12 घंटे के बाद PD2 दौरान, दिल चैम्बर धीरे-धीरे पृष्ठीय पेट के साथ गठबंधन किया है, और पीछे भाग (A6 - ए 8) दिल का सफाया किया गया था (चित्रा 2 जी, एच) 42,43। एक शंक्वाकार चैम्बर ~ A1 विकसित करने के लिए शुरू किया - PD2 दौरान A4 खंड और वयस्क अवस्था (चित्रा 2 मैं - एम) जब तक आकार में वृद्धि हुई है।

संरचनात्मक परिवर्तनों को देख इसके अलावा, कई कार्यात्मक परिवर्तन हृदय remodeling के दौरान साथ ही पाए गए। एम मोड 3 चित्र में दिखाया छवियों है कि दिल की धड़कन पोटा संबंधी चरण के लिए लार्वा चरण से काफी धीमा है, और फिर वयस्क के लिए प्यूपा से काफी वृद्धि प्रदर्शित करता है। महत्वपूर्ण मानव संसाधन परिवर्तन जीवन चक्र (चित्रा 4 ए) के दौरान मनाया गया। इसके अलावा, हृदय की गतिविधि की अवधि (कैप) सभी नमूनों एल 2 से AD1 (चित्रा 4 बी) को मापा के लिए विश्लेषण किया गया था। के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, मानव संसाधन L2 और L3 के लिए प्रति मिनट ~ पर 277 धड़कता (बीपीएम) रखती है। जल्दी पोटा संबंधी चरणों में प्रवेश करने पर मानव संसाधन और टोपी में एक उल्लेखनीय कमी नहीं है। मानव संसाधन PD1 की शुरुआत में 86 ± 11 बीपीएम के लिए कम है, और ई द्वारा 26 ± 8 बीपीएम को कम करने के लिए जारी हैPD1 के एन डी अंत में एक पूरी तरह से रोकने के लिए आ रहा PD2 में जल्दी। एक रोचक खोज PD2 मंच के आसपास मनाया कार्डियक निष्क्रियता की विस्तारित अवधि है (~ 24 घंटा - puparium गठन के बाद 48 घंटा), के रूप में कार्डियक विकासात्मक diastalsis 16 के लिए भेजा। PD2 के अंत में, धीमी गति से रुक-रुक कर पिटाई जारी रखता है (कैप 5 ± 2 के साथ मानव संसाधन 17 बीपीएम ± 6)। PD3 और PD4, मानव संसाधन और कैप वृद्धि (पोटा संबंधी चरण की शुरुआत से 5 दिनों के बाद) वयस्क अवस्था के पहले दिन 392 ± 32 बीपीएम और 95 ± 3% तक पहुँचने तक के दौरान।

आकृति 1
चित्रा विभिन्न चरणों और हार्ट कायापलट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पर ड्रोसोफिला 1. बढ़ते। (क) लार्वा, पोटा संबंधी के बढ़ते, और वयस्क डब्ल्यूटी (24B-Gal4 / +) गिलास स्लाइड पर मक्खियों। (ख) दिल कायापलट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। लार्वा और वयस्क schemati पर लाल तीरग ओसीएम एम मोड इमेजिंग स्थानों PD1 24 घंटा तक और, क्रमशः निरूपित बाद के समय बिंदुओं के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 ड्रोसोफिला दिल morphological परिवर्तन। एन चेहरा और एक गुम्मट ड्रोसोफिला में (क, ख) एल 2 प्राप्त की अक्षीय अनुभागीय ओसीएम छवियों (सी, डी) L3 (ई, एफ) PD1 (जी, एच) PD2 (मैं, एल) PD4 और (कश्मीर, एम) वयस्क चरणों। ड्रोसोफिला दिल के एम मोड छवियों PD1 तक और बाद के चरणों के लिए A1 खंड से उ 7 खंड से प्राप्त किया गया। में एन चेहरे और अक्षीय अनुभागीय छवियों 200 माइक्रोन और 500 माइक्रोन, आर निरूपित पैमाने सलाखोंespectively। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3. ड्रोसोफिला दिल कार्यात्मक परिवर्तन चित्रा। (क) विभिन्न विकास जीवन चक्र भर में मानव संसाधन परिवर्तन दिखा चरणों में एम मोड छवियों। (ख) हृदय की गतिविधि की अवधि (कैप) गणना का प्रदर्शन उदाहरण हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. मात्रात्मक कार्यात्मक हृदय पैरामीटर का विश्लेषणगुम्मट में एल 2, एल 3, 8 घंटा के अंतराल पर पोटा संबंधी चरणों, और AD1 सहित विभिन्न विकास के चरणों, पर मक्खियों। (क) मानव संसाधन। (ख) कैप। प्रत्येक समूह की त्रुटि बार मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विकासात्मक चरण
एल 2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 घंटा 16 घंटा 24 घंटा 32 मानव संसाधन 40 घंटा 48 घंटा 56 मानव संसाधन 64 मानव संसाधन 72 घंटा 80 घंटा 88 मानव संसाधन
नमूना संख्या 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

तालिका 1 गुम्मट फलों की संख्या कार्डिएक विकासात्मक अध्ययन में विभिन्न विकास के चरणों में मापा मक्खियों।

वीडियो 1
वीडियो 1. एक गुम्मट में अस्थायी आयाम के साथ दिल की धड़कन की ट्रैकिंग और Z दिशा (अक्षीय दिशा) के साथ इसी हार्ट चैंबर व्यास परिवर्तन एल 2 पर उड़ान भरने के लिए। दिल एक स्थिर दर पर रिश्तेदार तेजी से धड़क रहा था। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) p>

वीडियो 2
वीडियो 2. एक गुम्मट में अस्थायी आयाम के साथ दिल की धड़कन की ट्रैकिंग और Z दिशा (अक्षीय दिशा) के साथ इसी हार्ट चैंबर व्यास परिवर्तन PD1 पर उड़ान भरने के लिए। मानव संसाधन कम करने के लिए शुरू कर दिया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

वीडियो 3
वीडियो 3. एक गुम्मट में अस्थायी आयाम के साथ दिल की धड़कन की ट्रैकिंग और साथ Z दिशा (अक्षीय दिशा) इसी हार्ट चैंबर व्यास परिवर्तन PD2 पर उड़ान भरने के लिए। दिल समय के दौरान पूरी तरह से धड़कन बंद कर दिया। साजिश रची Z-व्यास के दोलन इमेजिंग शोर की वजह से था। लक्ष्य = "_blank"> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

वीडियो 4
वीडियो 4. एक गुम्मट में अस्थायी आयाम के साथ दिल की धड़कन की ट्रैकिंग और साथ Z दिशा (अक्षीय दिशा) इसी हार्ट चैंबर व्यास परिवर्तन PD4 पर उड़ान भरने के लिए। PD2 के बाद, मानव संसाधन और टोपी को बढ़ाने के लिए शुरू कर दिया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

वीडियो 5
वीडियो 5. AD1 पर एक गुम्मट फ्लाई में अस्थायी आयाम के साथ दिल की धड़कन की ट्रैकिंग और साथ Z दिशा (अक्षीय दिशा) इसी हार्ट चैंबर व्यास परिवर्तन। मानव संसाधन सभी चरणों के बीच ज्यादा था और कैप लगभग 100% थी।rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

वीडियो 6
एक लार्वा मक्खी की वीडियो 6. 3 डी संरचनात्मक प्रतिपादन। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

ड्रोसोफिला के तेजी से दिल की धड़कन, लार्वा और वयस्क चरणों में 400 बीपीएम के चारों ओर एक अधिकतम मानव संसाधन के साथ, दिल diastoles और systoles (कोई कम से कम 80 फ्रेम / सेकंड के अनुभवों के आधार पर) को हल करने के लिए उच्च गति इमेजिंग की आवश्यकता है। छोटे दिल चैम्बर आकार और माइक्रोन पैमाने दिल की दीवार मोटाई के कारण (5 - 10 माइक्रोन), एक उच्च स्थानिक संकल्प (2 माइक्रोन से बेहतर) दिल ट्यूब संरचनाओं को हल करने के लिए आवश्यक है। इस अध्ययन में, एक उच्च संकल्प और अति उच्च गति ओसीएम प्रणाली विकसित किया गया था, जहां और 600 लाइनों / मिमी संचरण झंझरी के साथ एक स्पेक्ट्रोमीटर एक 2,048 पिक्सेल लाइन-स्कैन कैमरे का इस्तेमाल किया गया था। 20 kHz के एक दर एक-स्कैन लाइन-स्कैन कैमरे द्वारा प्रदान की जाती है। 128 फ्रेम के फ्रेम दर / सेकंड काफी तेजी से एल 2, एल 3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, और वयस्क सहित कई विकास के चरणों, पर ड्रोसोफिला दिल की धड़कन पर कब्जा है। प्रकाश स्रोत के एक केंद्रीय तरंगदैर्ध्य और ~ 800 एनएम और बैंडविड्थ के साथ एक व्यापक बैंडविड्थ supercontinuum प्रकाश स्रोत था ~220 एनएम क्रमशः और ~ ऊतकों में 1.3 माइक्रोन से एक अक्षीय संकल्प प्राप्त की। एक 10x उद्देश्य नमूना हाथ में इस्तेमाल किया गया था 3.9 माइक्रोन का ~ एक अनुप्रस्थ संकल्प साकार करने के लिए। चूंकि ड्रोसोफिला के दिल ट्यूब पृष्ठीय सतह के नीचे लगभग 200 माइक्रोन है, माइक्रोन मीटर के सैकड़ों की एक इमेजिंग गहराई की आवश्यकता है। एक 45 ° रॉड दर्पण एक कुंडलाकार नमूना किरण पैदा करते हैं और नमूना 44 में ध्यान की गहराई का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। संवेदनशीलता और 3 DB रोल बंद 96 डीबी और 600 माइक्रोन क्रमश ~ 9 मेगावाट नमूना हाथ शक्ति के साथ होने के लिए निर्धारित किया गया है। एक कस्टम कंप्यूटर प्रोग्राम ओसीएम प्रणाली नियंत्रण और माप का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हृदय की संरचनात्मक छवियों और प्राप्त कार्यात्मक मापदंडों का उपयोग कर ओसीएम मात्रात्मक अपने पूरे जीवन चक्र के दौरान दिल आकृति विज्ञान और ड्रोसोफिला के समारोह को चिह्नित करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन।

वर्तमान में, कई अन्य तकनीकों भी छवि एक छोटा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंजानवर के दिल संरचना या समारोह में, इस तरह गणना टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और अल्ट्रासाउंड के रूप में। ओसीएम ठीक संरचनाओं और पशुओं के दिलों में तेजी से गतिशीलता के दृश्य को सक्षम करने, इन तकनीकों की तुलना में अधिक स्थानिक और लौकिक प्रस्तावों प्रदान करता है। Confocal माइक्रोस्कोपी एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल इमेजिंग तकनीक है, लेकिन अपनी कम इमेजिंग पैठ और इमेजिंग विपरीत एजेंटों की माँग जीवित पशुओं में उसके आवेदन की सीमा। तुलनात्मक रूप से, ओसीएम उच्च गति और छोटे जानवरों में तेजी से हृदय की गतिशीलता visualizing गैर invasively के लिए लेबल मुक्त इमेजिंग सक्षम बनाता है। हालांकि, अब भी ओसीएम की सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, ओसीएम द्वारा प्रदान की इमेजिंग गहराई प्रकाश बिखरने से कई सौ माइक्रोन से लगभग 1 मिमी के लिए ऊतक में जबकि अल्ट्रासाउंड करने के लिए 10 सेमी की गहराई से पैठ है सीमित है। confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में, ओसीएम एक उच्च गति और बेहतर इमेजिंग गहराई है, लेकिन कम संकल्प और गरीब आणविक विपरीत के साथ है। इसके अलावा, हमारे वर्तमान प्रणाली ओसीएम बावर्णक्रम-डोमेन का पता लगाने प्रणालियों पर sed। उच्चतर इमेजिंग बह स्रोत के आधार पर ओसीएम 45 की गति से दिल की धड़कन की तरह तेजी से गतिशीलता के अधिक विशिष्ट छवियों प्रदान कर सकता है।

ओसीएम साथ ड्रोसोफिला में दिल की धड़कन के अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए, वहाँ प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। मक्खियों प्रयोग के सभी स्तरों पर बहुत नाजुक नियंत्रित किया जाना चाहिए। लार्वा प्रबंध विशेष रूप से कोमल होना चाहिए, क्योंकि यह लार्वा, जो निम्नलिखित विकास के चरणों में दिल की संरचना और कार्य को प्रभावित कर सकता है नुकसान करने के लिए आसान है। मक्खियों कवर कांच और इमेजिंग चरण बहुत ठीक पर तैनात किया जाना चाहिए। खराब स्थिति मक्खियों यह मुश्किल गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने के लिए और विषम संरचनात्मक और कार्यात्मक दिल पैरामीटर मान कारण हो सकता है कर देगा। इसके अतिरिक्त, स्थानांतरित वयस्क दूसरे के लिए एक ट्यूब से मक्खियों और कपास की गेंद plugging बहुत ट्यूब से उनके भागने को रोकने के लिए तेजी से होना चाहिए।

पर विभिन्न अध्ययनोंड्रोसोफिला दिल विकास प्रोटोकॉल को संशोधित करके किया जा सकता है। तापमान जिस पर मक्खियों सुसंस्कृत हैं वृद्धि हुई है या हृदय की जीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन और मक्खी विकास की अवधि को बदलने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस से कम किया जा सकता है। इस तरह नारियल तेल या मानक के भोजन के लिए एटीआर के रूप में कुछ सामग्री जोड़कर, हृदय विकास बदला जा सकता है। विशिष्ट अध्ययन जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक मक्खियों में आयोजित किया जा सकता है। जब फल मक्खी दिल विकास का अध्ययन longitudinally, अलग अलग समय अंतराल उदाहरण के लिए, ओसीएम माप प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक 8 घंटे के अंतराल पोटा संबंधी चरणों के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे ओसीएम प्रणाली की सीमित संवेदनशीलता के कारण, वर्दी का धब्बा शोर का एक बहुत अनुप्रस्थ एम मोड छवियों, जो यह मुश्किल सही ढंग से मैटलैब कार्यक्रमों के साथ दिल संकुचन का संकेत है की पहचान करने और डेटा विश्लेषण की दक्षता में कमी करने के लिए कर सकते हैं में पाया जाता है। संवेदनशीलता ओसीएम प्रणाली के संरेखण में सुधार के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। अनुकूलित छानने एल्गोरिदमspeckles के एक हिस्से को हटाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल मानव circadian orthologs, dCry और dClock ड्रोसोफिला में प्रेरित हृदय दोष की चुप्पी अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। में कमी बजे लार्वा, प्यूपा, और वयस्क 15,16 सहित विभिन्न विकास के चरणों, पर मनाया गया। दिल के विकास में circadian जीन की भूमिका का पता चला था, जो हृदय रोगों और circadian ताल संबंधित गतिविधि पैटर्न के बीच सहयोग समझा जा सकता है। उच्च वसा आहार (HFD) प्रेरित हृदय संबंधी विकार भी दिल HFD 15 से तंग आ चुके फल मक्खियों के कार्यात्मक परिवर्तन का विश्लेषण करके अध्ययन किया गया। इन अध्ययनों से हृदय की संरचना और समारोह के विकास के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन यह भी जन्मजात और प्रसव के बाद मानव रोगों को समझने में हृदय अनुदैर्ध्य अध्ययन के महत्व के रूप में न केवल ड्रोसोफिला का प्रदर्शन किया। ओसीएम मंच भविष्य के अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में सक्षम होगा मैंn जीन से संबंधित मानव हृदय रोग।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 118, ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी ऑप्टिकल जुटना माइक्रोस्कोपी दिल आकृति विज्ञान हृदय समारोह ऑप्टिकल इमेजिंग हृदय गति हृदय की गतिविधि की अवधि
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen,… More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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