Introduction
Longitudinaal onderzoek naar het hart bij gezelschapsdieren bijdraagt tot het begrijpen van diverse humane gerelateerde hart- en vaatziekten, zoals gentherapie betrekking aangeboren hartafwijkingen 1,2. In de afgelopen decennia verschillende diermodellen zoals muizen 3,4, 5,6 Xenopus, zebravis 7,8, vogel 9 en Drosophila 10-16, zijn gebruikt om het menselijk hart ontwikkelingsgerelateerd onderzoek. Het muizenmodel is op grote schaal gebruikt om de normale en abnormale ontwikkeling van het hart en hartafwijking fenotypes vanwege de overeenkomsten met het menselijk hart 3,4 bestuderen. De Xenopus embryo is bijzonder nuttig bij de studie van ontwikkeling van het hart vanwege de gemakkelijke hantering en gedeeltelijke transparantie 5,6. De transparantie van het embryo en de vroege larve van de zebravis model zorgt voor eenvoudige optische observatie van de ontwikkeling van het hart 7,8. De aviaire model is een gemeenschappelijk onderwerp van ontwikkelingsstoornissen hart studies Because het hart is eenvoudig te bereiken na verwijdering van de eierschalen en de morfologische gelijkenis van aviaire harten voor de mens 9. De Drosophila model heeft een aantal unieke eigenschappen waardoor het ideaal is voor het uitvoeren van longitudinale studies van het hart te maken. Ten eerste, het hartbuis van Drosophila is ~ 200 urn onder het dorsale oppervlak, die gemak biedt voor optische toegang en observatie van het hart. Bovendien zijn veel moleculaire mechanismen en genetische pathways zijn geconserveerd tussen Drosophila en vertebraten. De orthologen van meer dan 75% van humane ziekte genen gevonden in Drosophila, waardoor het al op grote schaal gebruikt in transgene studies 11,13. Bovendien heeft het een korte levensduur en lage onderhoudskosten, en is vaak gebruikt als een specimen model voor de ontwikkelingsbiologie onderzoek 14-16.
Eerdere rapporten beschreven protocollen voor het bewaken Drosophila hartfunctie zoals hijArtbeat. Er werden echter dissectie vereiste procedures 17,18. Optische beeldvorming is een effectieve manier om ontwikkeling van het hart bij dieren visualiseren gezien het niet-invasieve karakter. Verschillende optische beeldvormende technieken zijn toegepast bij het uitvoeren van dierlijke cardiale studie, zoals twee-foton microscopie 19, confocale microscopie 20,21, licht blad microscopie 22, en optical coherence tomography (OCT) 16,23-26. Relatief, oktober is in staat om grote diepte beeldvorming in kleine dieren harten zonder contrastmiddelen, terwijl een hoge resolutie en een ultrahoge snelheid van de beeldvorming, die belangrijk zijn voor beeldvorming levende dieren. Bovendien heeft de lage kosten van het ontwikkelen van een systeem oktober deze techniek voor optische beeldvorming van monsters populair. Oktober is met succes gebruikt voor longitudinale studie van Drosophila. Met behulp van oktober, cardiale morfologische en functionele beeldvorming is uitgevoerd naar het hart structuren te bestuderen, de funcnele functies van genen en de mechanismen van cardiovasculaire defecten in mutant modellen tijdens ontwikkeling van het hart. Zo werd leeftijdsafhankelijke hartfunctie daling bevestigd-down gereguleerd-angiotensine converting enzyme-gerelateerde (ACER) gen in Drosophila met 27 oktober. Fenotypering van gen-gerelateerde cardiomyopathie werd aangetoond in Drosophila met behulp van oktober 28-33. Onderzoek met behulp van oktober bleek ook de functionele rol van het menselijke SOX5 gen in het hart van Drosophila 34. In vergelijking met oktober, OCM maakt gebruik van een objectief met een hogere numerieke lensopening om een betere transversale oplossing te bieden. In het verleden heeft het hart disfunctioneren veroorzaakt door silencing een ortholoog circadiane gen dCry / dClock bestudeerd met behulp van een aangepast systeem OCM 15,16, evenals het effect van vetrijk dieet op cardiomyopathie in Drosophila tot obesitas geïnduceerde humane begrijpen hartziekten. 15
Hier, the experimentele protocol is samengevat voor longitudinaal onderzoek naar de cardiale morfologische en functionele veranderingen in Drosophila op het tweede instar (L2), derde instar (L3), pop dag 1 (PD1), pop dag 2 (PD2), pop dag 3 (PD3) , poppen dag 4 (PD4), pop dag 5 (PD5) en volwassen (figuur 1) via OCM om het onderzoek naar menselijke-gerelateerde aangeboren hartziekten vergemakkelijken. Cardiale functionele parameters, zoals HR en GLB werden kwantitatief geanalyseerd in verschillende ontwikkelingsstadia om de cardiale ontwikkelingsfuncties onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de OCM-systeem voor optische beeldvorming van Drosophila 16
- Selecteer een spectrometer en een hogesnelheidslijn scan camera met een frame rate van ten minste 80 frame / sec biedt zodat de OCM-systeem in staat om de hartslag van Drosophila te lossen zal zijn.
- Gebruik een breedband lichtbron om de axiale resolutie van 2 urn te garanderen aan de hartstructuur van Drosophila identificeren.
- Gebruik een 10X doelstelling om een hoge transversale resolutie te verkrijgen.
- Gebruik een 45 ° staaf spiegel om de referentie-arm lichtstraal reflecteren en om een ringvormig monster arm lichtbundel om de diepte van de focus in de monsters uit te breiden te genereren.
- Ontwikkelen van een aangepaste computer programma om het OCM systeem te bedienen en het uitvoeren van metingen.
2. Drosophila Cultuur
- Standard Fly Voedselbereiding
- Put ~ 5 ml direct Drosophila formule in een polystyreen flesjebuis met de hulp van een papieren goot.
- Giet ~ 8 ml water in de formule goed te verzadigen eten.
- Voeg verschillende aanvullingen op de standaard vlieg voedsel voor verschillende experimenten. Bij de voorbereiding van all-trans -retinal (ATR) voedsel voor de optogenetic pacing experiment 35, gebruik dan een pipet tot 100 mM ATR halen en oplossen in ~ 8 ml water aan de ATR concentratie van 1 mM krijgen in voedsel. Na het mengen van de oplossing uniform, giet de oplossing in de formule en roer het voldoende.
- Een vetrijk dieet bereiden bestuderen obesitas gerelateerde stoornissen hart in Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formule met 15 ml water in een beker en verwarm gedurende 30 seconden in een magnetron. Doe wat biologische extra vierge kokosolie in een kopje en verwarm het voor 90 seconden in de magnetron.
- Extract 7,5 ml kokosolie en meng met de formule bereid voldoende om het gewicht / volumeverhouding kokosolie maken voedsel ~ 30/100 en then extract ~ 2 ml gemengd voedsel en hiermee aan de bodem van een buis.
- Wacht 1 min tot het medium goed verzadigd. Compact De voedsel voorzichtig met een vlakke ondergrond om de levensomstandigheden van de Drosophila optimaliseren. Voeg 6-8 korrels van gist op de voorbereide formule, en steek de buis met een cluster van katoen.
- Fruit Fly Kruisen en Cultuur
- Neem een buis met voorbereide standaard vlieg voedsel, en verwijder de aangesloten katoen. Breng voorzichtig de volwassen vliegen (mannen en vrouwen) aan de buis en steek de buis met katoenen onmiddellijk. Controleer de katoen om ervoor te zorgen dat er geen kloof tussen de katoen en de buiswand om vliegen te voorkomen dat ontsnappen uit de buis.
- Houd de fruitvliegen in de incubator bij 25 ° C gedurende kruisen. De meeste genen actief en cellulaire eiwitten worden gesynthetiseerd bij 25 ° C 36-39.
- Neem de buis uit de incubator na 8 kant overdracht van de aDult vliegt uit de buis om de eieren op dezelfde leeftijd voor experimentele controle te krijgen.
- Verder kweken van de eieren in de incubator bij 25 ° C, wat de standaard temperatuur Drosophila ontwikkeling met de ontwikkelingsperiode van 8,5 dagen 40,41.
LET OP: De temperatuur beïnvloedt de ontwikkelingsperiode (ei tot volwassen) en de expressie van verschillende genen.
3. Het uitvoeren van optische beeldvorming met OCM
- Mount Fly larve voor Optical Imaging
Opmerking: Het ei van Drosophila luiken in 22-24 uur bij 25 ° C om het eerste instar larven (L1). De tweede fase larve komt na de andere 24 uur. De grootste larvale vorm is de derde instar larve, die vervellingen na ongeveer 24 uur. Structurele kenmerken larve kan worden gebruikt om hun verschillende ontwikkelingsstadia onderscheiden. De grootte van de monddelen tussen de eerste en de tweede instar instar verschillend. De mondhaken van het eerste instar larven zijn zeer klein en lijken twee paar kleine zwarte vlekken, terwijl de mond haken van het tweede instar larven zijn groter en de structuur duidelijker. De siphonen worden meestal gebruikt om de tweede larvestadium en de derde instar identificeren. De tweede fase larve heeft anterior siphonen doodgeknuppeld, terwijl voor de derde instar, de voorste siphonen vertakt. Een donkeroranje ring begint te verschijnen op het uiteinde van het achterste siphonen in het derde instar larven.- Breng een stukje dubbelzijdige tape om een schone microscoop glasplaatje. Verdrijf de luchtbellen onder de tape om de reflecties veroorzaakt door luchtbelletjes tijdens de beeldvorming te voorkomen.
- Neem een van de buizen met de gekweekte vliegen uit de couveuse in het larvale stadium.
- Identificeer de larve in de media, haal hem uit de media met een zachte borstel en leg ze op een schone tissue. Verwijder levensmiddelen vast aan de larve met een natte zachte borstel en droog het op het weefsel.
- Verplaats de cleaned vliegen naar een weefsel onder de objectieflens van een microscoop breed.
- Pas de focus van de microscoop om een duidelijk beeld van de vlieg te vinden. Zij maken het ontwikkelingsstadium van de larve van de structurele kenmerken van de microscoop.
- Plaats de vliegen met behulp van de zachte borstel. Verzekeren het lichaam is recht met de rugzijde naar boven te bereiden voor montage op het glaasje door de rugzijde. Voer deze stap onder de microscoop.
- Zorg ervoor dat de larve volledig droog is voor montage op de tape. Anders zal de larve niet aan de tape.
- Plak de dorsale zijde van de gepositioneerde vliegen naar de dubbelzijdige tape op het glaasje met matige druk. Merk op dat er te veel druk kan de vliegen en te weinig kracht te doden zal leiden tot beweging tijdens beeldvorming vliegen.
- Optische beeldvorming van Drosophila bij larvale stadia (L2 en L3) met OCM
LET OP: Een brede lumen van het hart buis kan worden found in de segmenten tussen A5 tot A8 de larvale stadia (figuur 1). De dwarse OCM M-modus beelden (2D + tijd) werden verworven op de A7 segment van het hart buis voor elke larve van de systolische en diastolische analyse te vergemakkelijken.- Plaats de gemonteerde larve op de instelbare monsterstellage van de OCM systeem langs de y-dwarsrichting met de rugzijde naar boven onder de objectieflens. Een kleine opening in de monstertafel noodzakelijk voor het plaatsen van de larve haar contact met de fase vlak voorkomen.
- Stel het monster podium te bewegen het hart buis van de fruitvlieg op het brandvlak van de beeldvormende bundel. Om gemakkelijk de A7 segment, vind het achterste gebied van het hart buis met de real-time dwarsdoorsnede OCM beelden in de afbeelding acquisitie software. Verplaats vervolgens het podium naar voren totdat de A7 segment zichtbaar is.
- Stel de parameters van het beeld acquisitie software tot 100 A-scans per B-scan (frame), 100 B-scans, en de scanner spanning dekking ~ 0,28 mm in de x-dwarsrichting en 0 V in de y-dwarsrichting. Klik op de knop "start" in de software om de achtergrondruis data voor de achtergrond aftrekken verwerven door het blokkeren van het monster stralengang met een donkere doek.
Opmerking 3 van 100 frames kunnen worden gebruikt voor de achtergrond aftrekking. - Parameters van de data-acquisitie software 128 A-scans per B-scan 4096 B-scans en de scanner spanning dekking ~ 0,28 mm in de x-dwarsrichting en 0 V in de y-dwarsrichting. Klik op de knop "start" in de software om de dwarse M-modus beelden over de A7 segment van de vlieg hartbuis over een gebied met betrekking tot 0,28 x 0,57 mm 2 voor ongeveer 30 sec te verwerven.
- Blokkeer de beeldvormende bundel met een donkere doek tijdens de data opslaan proces om langdurige blootstelling van de vlieg hart naar de beeldvorming licht te vermijden.
- Herhaal de meting voor 5 keer om een betrouwbare meting van het hart plezier te krijgenctie.
- Parameters van de beeldacquisitie software 400 A-scans per B-scan, 800 B-scans en de scanner spanning dekking ~ 1,7 mm in de x-dwarsrichting en ~ 4 mm in de y-dwarsrichting. Verplaats het podium in beide richtingen om ervoor te zorgen het hele fruitvlieg kunnen worden afgebeeld. Klik op de knop "start" in de software om een dataset te verwerven om beelden van de fruitvlieg in 3 dimensies te verkrijgen. Opmerking: De 3D vlieg structuur kan worden gemaakt met behulp van 3D-software Amira
- Gebruik een natte zachte borstel om de gemeten fly bevochtigen en voorzichtig verwijderen uit het glaasje. Verplaats het in een afzonderlijke buis voor de continue ontwikkeling. Label de buis voor longitudinale studie door de volgende ontwikkelingsstadia.
- Afbeelding Drosophila bij Pupal Stages
LET OP: Alle fruitvliegjes werden genomen voor de beeldvorming van PD1 tot PD5. Zoals in de larve schema in figuur 1b, een breed lumen blijft A5 A8 segmenten vae hartbuis tot PD1. Van PD2, een conische kamer begint te ontstaan tussen A1 tot A4 segmenten. Om consistente beelden te verwerven en het hart analyse te vergemakkelijken, werden dwarse M-modus beelden verkregen uit de A7 segment PD1 en van A1 segment na PD2, zoals aangegeven in Figuur 1b.- Afbeelding Drosophila bij PD1
LET OP: Drosophila zal een witte puparium voor een korte tijd raam (0-1 uur) tijdens PD1. Dit tijdvenster is ideaal voor het uitvoeren van optische beeldvorming van de vroege pop omdat de hoge transparantie leidt tot hogere lichtinval voor de OCM beeldvorming.- Aangezien de fruitvliegjes bevinden zich aan de buiswand wanneer zij pop, verwijder de pop uit afzonderlijke buizen voor beeldvorming bij PD1 met een natte zachte borstel en reinig de pop met de borstel als er voedsel vast aan het lichaam.
- Monteer de fruitvlieg op een klein glasplaatje rechtstreeks met de natte borstel en houd de dorsale zijde naar boven (figuur 1a
- Verwijderen overmatig water uit de zijkant van de vlieg lichaam.
- Zet het glaasje op het monster etappe van de OCM-systeem, het bijhouden van de fruitvlieg op de top. Vind duidelijke real-time beeld van de A7 segment van de vlieg hart gebruik te maken van dezelfde strategie in de larve meting beschreven.
- Stel dezelfde parameters van de data-acquisitie software zoals in paragraaf 3.2, en het beeld van de hartslag bij de A7 segment dwarse M-modus en 3D-beelden te verwerven.
- Na beeldvorming, gebruik dan een pincet om het glaasje met pop plaatsen terug in de buis voor continue cultuur.
- Afbeelding Drosophila bij PD2 om PD5 Stages
OPMERKING: Aangezien het specimen wordt steeds ondoorzichtige tijdens het popstadium stadia, de penetratiediepte van het beeldvormingssysteem worden verminderd.- Gebruik een pincet om voorzichtig de glazen sLiDE gemonteerd met de vlieg op PD2 uit de buis voor de beeldvorming. Bij PD2, het monster reservoir wordt geel en het lichaam minder transparant opzichte PD1 (figuur 1).
- Zet de schuif op het monster etappe van de OCM-systeem.
- Stel de monster etappe naar de vliegen te verplaatsen naar de focal plane van beeldvorming straal van het OCM-systeem. Vind het voorste einde van het hart buis beeld real-time cross-sectionele OCM met. Verplaats ~ 50 urn terug in het achterste richting de A1 segment van het hart buis te vinden.
LET OP: Op dit punt van de ontwikkeling van het hart (PD2), de kegelvormige kamer zal zeer klein zijn en mogen niet worden verslaan. - Verzamel transversale M-mode datasets van het A1 segment alsmede 3D data op dezelfde manier als eerdere ontwikkelingsstadia.
- Zet de schuif terug naar de buis zorgvuldig voor continue cultuur.
OPMERKING: Bij PD3, de kleur van het monster in de schaal is donkerder dan die PD2 stadium. Bij PD4 stadium, zwarte strepen can in acht worden genomen in de schil van de monsters. Sommige vliegt zal ontwikkelen tot volwassenen van deze fase van de volgende dag, terwijl anderen zullen evolueren naar PD5. Bij PD5 stadium, zwarte strepen zijn nog duidelijk te zien in de fruitvliegjes. Deze vliegen worden volwassenen in de volgende dag worden.
- Afbeelding Drosophila bij PD1
- Afbeelding Drosophila bij het volwassen stadium
OPMERKING: Bij het volwassen stadium, kunnen vrouwelijke en mannelijke vliegen worden onderscheiden door de grootte van het lichaam en de kleur van de onderbuik. Vrouwelijke volwassenen hebben groter formaat, terwijl de mannetjes zijn kleiner en donker gekleurd in de onderbuik.- Neem de buis uit de incubator als de fruitvlieg zich ontwikkelt tot een volwassen, en de overdracht van de volwassen vliegen naar een ~ 45 ml lege flacon.
- Dompel het absorberende uiteinde (~ 1 cm lengte, ~ 3 mm diameter) van een wand in de anesthesie, zet de wand in de flacon en sluit de buis met een cluster van katoen aan het verdovingsmiddel einde net onder de aangesloten katoen en te houden Anesthetize de vlieg voor 3 min. De duur van de anesthesie afhankelijk van de grootte van de vlieg en kan variëren tussen 2,5 tot 3,5 min (bijvoorbeeld 2,5 min voor mannelijke, vrouwelijke 3 of 3,5 min).
- Bereid een glasplaatje met een stukje dubbelzijdige tape.
- Verplaats het verdoofd vlieg op het glas dia met dorsale zijde naar boven met behulp van de zachte borstel.
- Scheid de vleugels met behulp van een pincet en plak de vleugels op de band onder een microscoop om de vliegen te lossen en bloot de hartstreek voor beeldvorming.
- Het imago van de vlieg van de A1 segment van de vlieg hart (figuur 1). Na afloop van het experiment, kan de vlieg worden opgeofferd.
4. Imaging Analyse 16
- Ontwikkelen van Matlab programma's om de 2D- en 3D-binaire bestanden verzameld met het beeld acquisitie software om image bestanden te converteren.
- Gebruik ImageJ om het hart buis regio in de dwarse M-modus foto's en een toverstaf algoritme te identificeren createa masker van het hart streek voor elk beeld transversale M-mode. Segment de gemaskerde gebied en gebruik een piek vinden algoritme om de systolische en diastolische locaties te identificeren. Bereken tijdsafhankelijke veranderingen het hart diameter van de dwarse M-modus beelden.
- Op basis van de verworven tijdsafhankelijke hart diameters, het berekenen van de cardiale parameters zoals HR, hartactiviteit periode (CAP), eind diastole diameter (EDD), eind systole diameter (ESD), eind diastole gebied (EDA), en eindigen systole gebied ( ESA). Bereken de fractionele verkorting (FS) met
- Gebruik ImageJ om de 3D OCM beelden te analyseren om de structurele ontwikkeling van de vlieg hart te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De longitudinale cardiale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de fruitvliegen met 24B-GAL4 / + rek bij kamertemperatuur OCM. De metingen werden uitgevoerd bij L2, L3, en 8 uur intervallen van PD1 tot PD4, en volwassen dag 1 (AD1) aan de metamorfoseprocédé (tabel 1) te volgen. Larven, poppen vroege, late poppen en volwassen vliegen werden gemonteerd op glasplaatjes zoals in Figuur 1A. Het segment kenmerken van het hart voor larven en volwassen vliegen werden getoond in de schematische voorstellingen in figuur 1B.
In deze ontwikkelingsfase onderzoek werden 4096 frames verkregen in 32 sec met onze aangepaste OCM systeem om de hartslag van een fruitvlieg traceren. Om meetnauwkeurigheid te verbeteren, werden vijf herhaalde metingen voor elk monster bij elke ontwikkelingsfase. 3D-gegevens kunnen ook worden verkregen bij het hart structuur verandert observeren tijdens metamorfose.
Transversale M-modus en 3D-beelden waren c reated met aangepaste Matlab-programma's en ImageJ. En gezichtsbeelden en axiale secties werden ook geconstrueerd uit de verkregen gegevens de remodellering van het hart te visualiseren tijdens Drosophila metamorfose (figuur 2). Om de hartfunctie van fruitvliegjes te kwantificeren, werd het hart streek automatisch gesegmenteerd met een aangepaste Matlab programma uit alle 4096 frames. De fly hartslag (HR) kan worden gekwantificeerd uit de dwarse M-modus OCM beelden (Figuur 3a). Tijdens pupal stadia, stopt het Drosophila hart af en toe 16 kloppen. We een nieuwe cardiale functionele parameter hartactiviteit periode (CAP) om de verhouding van de periode met een hartslag van de totale beeldvormingstijd kwantificeren (figuur 3b). EDD, ESD, EDA, ESA en FS werden ook gebruikt om de hartkamer veranderingen in zowel axiale als dwarsafmetingen in Drosophila ontwikkeling kwantificeren. 16
content "> At larvale stadia, het hartbuis begint bij het achterste buikstreek A8 die verder lumen (A5 - A8 in figuur 1B) en eindigt bij de voorste dorsale segment A1 met een kleinere diameter (T3 / A1 - A5 in figuur 1B ). het hartkamer werd mediaal en dorsaal gelegen, groeide in L2 (Figuur 2 a, b) en L3 (figuur 2 c, d). Na het invoeren PD1, het hartbuis waargenomen loopt axiaal over de bovenkant van een bewegende lucht bubble (figuur 2 e, f) ongeveer 10 -. 13 uur later, de zeepbel verdween na puparium vorming en de brede lumen werd binnenstebuiten gekeerd Sinds de voorste hart buis werd ventraal gelegen, de hele hartbuis was onzichtbaar, behalve het achterste regio in het. . OCM beelden ~ 12 uur na puparium vorming Later tijdens PD2, de hartkamer geleidelijk uitgelijnd langs de dorsale buik, en het achterste deel (A6 - A8) van het hart werd geëlimineerd (figuur 2 g, h) 42,43. Een conische kamer begon te ontwikkelen ~ A1 - A4 segment tijdens PD2 en groeide in omvang tot het volwassen stadium (figuur 2 i - m).Naast het observeren van structurele veranderingen, werden vele functionele veranderingen, alsmede gevonden tijdens cardiale remodeling. De M-modus beelden getoond in figuur 3 tonen aan dat de hartslag vertraagde aanzienlijk van de larvale stadium het popstadium en Vervolgens namen van pop tot volwassen. Significante HR veranderingen werden waargenomen tijdens de levenscyclus (figuur 4a). Voorts dient de periode hartactiviteit (CAP) werd geanalyseerd op alle monsters gemeten van L2 naar AD1 (figuur 4b). Zoals getoond in figuur 4, HR houdt bij ~ 277 slagen per minuut (bpm) voor L2 en L3. Bij binnenkomst in de vroege stadia pupal er een duidelijke daling van HR en CAP. HR wordt gereduceerd tot 86 ± 11 bpm begin PD1 en blijft afnemen tot 26 ± 8 spm door end van PD1 eindelijk tot stilstand in het begin van PD2. Een interessante ontdekking is de verlengde cardiale inactiviteit waargenomen rond PD2 fase (~ 24 uur - 48 uur na puparium vorming), genoemd cardiale ontwikkelingsstoornissen diastalsis 16. Aan het einde van PD2, trage intermitterende afstraffing hervat (HR 17 bpm ± 6 met CAP 5 ± 2). Gedurende PD3 en PD4, HR en CAP toename tot het bereiken van 392 ± 32 bpm en 95 ± 3% op de eerste dag van het volwassen stadium (5 dagen na het begin van de popstadium).
Figuur 1. Montage van Drosophila in verschillende stadia en schematische weergave van het Hart van Metamorphosis. (a) Montage van larven, pupal, en volwassen WT (24B-GAL4 / +) vliegt op glasplaatjes. (b) Schematische weergave van het hart metamorfose. Rode pijlen op larven en volwassen schematic geven de OCM M-mode imaging locaties tot PD1 24 uur en voor de volgende tijdstippen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Drosophila Hart morfologische veranderingen. En face en axiale doorsnede OCM beelden van een WT Drosophila verkregen bij (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 en (k, m) volwassen stages. M-modus beelden van de Drosophila hart werden verkregen uit de A7 segment tot PD1 en van A1 segment voor latere stadia. De schaal bars in en face en axiale sectionele beelden te duiden 200 pm en 500 urn, respectively. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Drosophila Hart functionele veranderingen. (a) M-mode beelden in verschillende ontwikkelingsstadia toont HR wijzigingen in levenscyclus. (b) voorbeelden waaruit blijkt cardiale periode van activiteit (CAP) berekening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Kwantitatieve Analyse van Functionele Cardiac Parameters in WT Vliegen in verschillende ontwikkelingsstadia, waaronder L2, L3, Pupal Stages bij 8 uur intervallen, en AD1. (a) HR. (b) CAP. De foutenbalk van elke groep de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| ontwikkelingsstadium | |||||||||||||||||
| L2 | L3 | PD1 | PD2 | PD3 | PD4 | AD1 | |||||||||||
| 8 hr | 16 hr | 24 hr | 32 hr | 40 hr | 48 uur | 56 hr | 64 hr | 72 uur | 80 hr | 88 hr | |||||||
| specimen Number | 21 | 17 | 13 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 18 | 17 | 18 | 9 | 25 | |||
Tabel 1. Aantal WT fruitvliegen Gemeten op verschillende ontwikkelingsstadia in de Cardiac Developmental Study.
Video 1. Volgen van Heartbeat Langs tijdsdimensie en Overeenkomstige hartkamer Diameter Change langs de Z-richting (axiale richting) in een WT vliegen op L2. Het hart werd relatief snel te verslaan in een gestaag tempo. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) p>
Video 2. Tracking van Heartbeat langs tijdsdimensie en Overeenkomstige hartkamer Diameter Change langs de Z-richting (axiale richting) in een WT vliegen op PD1. De HR begon te dalen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3. Tracking van Heartbeat langs tijdsdimensie en Overeenkomstige hartkamer Diameter Change langs de Z-richting (axiale richting) in een WT vliegen op PD2. Het hart stopte volledig kloppen in de tijd. De oscillatie van uitgezet z diameter was te wijten aan de beeldvorming lawaai. target = "_ blank"> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4. Tracking van Heartbeat langs tijdsdimensie en Overeenkomstige hartkamer Diameter Change langs de Z-richting (axiale richting) in een WT vliegen op PD4. Na PD2, de HR en CAP beginnen te stijgen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5. Tracking van Heartbeat langs tijdsdimensie en Overeenkomstige hartkamer Diameter Change langs de Z-richting (axiale richting) in een WT Fly bij AD1. De HR was de hoogste van alle graden en CAP was bijna 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 6. 3D structurele weergave van een larvale vliegen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De snelle hartslag van Drosophila, met een maximum HR rond de 400 slagen per minuut bij larven en volwassen stadia, vereist een hoge snelheid van de beeldvorming naar het hart diastoles en systolen (niet minder dan 80 beelden / sec op basis van ervaringen) op te lossen. Vanwege de kleine afmetingen en hartkamer micron schaal hart wanddikte (5-10 urn), een hoge ruimtelijke resolutie (beter dan 2 pm) vereist voor het oplossen van het hartbuis structuren. In deze studie, een hoge resolutie en ultrahoge snelheid OCM systeem ontwikkeld, waarbij een spectrometer met transmissie 600 lijnen / mm rooster en een 2048 pixel line-scan camera gebruikt. Een A-scansnelheid van 20 kHz wordt door de lijn-scan camera. De framesnelheid van 128 frames / sec is snel genoeg om de Drosophila hartslag op verschillende ontwikkelingsstadia, zoals L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, en volwassen vangen. De lichtbron was een grote bandbreedte supercontinuum lichtbron met een centrale golflengte en bandbreedte van ~ 800 nm en ~220 nm respectievelijk en behaalde een axiale resolutie van ~ 1.3 micrometer in weefsel. Een 10x objectief werd in het monster arm een dwars resolutie van ~ 3,9 micrometer realiseren. Aangezien het hartbuis van Drosophila is ongeveer 200 urn onder het dorsale oppervlak, wordt een beeldvormende scherptediepte honderden micron meters vereist. Een 45 ° staaf spiegel kan worden gebruikt om een ringvormig monster balk te genereren en uit te breiden de diepte van de focus in het specimen 44. De gevoeligheid en 3 dB roll-off waren vastbesloten om 96 dB en 600 urn, respectievelijk met het monster arm kracht van ~ 9 mW. Een aangepaste computerprogramma werd gebruikt om de OCM systeem de metingen te controleren en uitvoeren. De cardiale structurele beelden en functionele parameters die werden verkregen tonen de haalbaarheid van het gebruik OCM kwantitatief karakteriseren het hart morfologie en functie van Drosophila zijn gehele levenscyclus.
Momenteel worden verschillende andere technieken ook gebruikt om een kleinedier hartstructuur of functie, zoals computertomografie (CT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en ultrageluid. OCM biedt een hogere ruimtelijke en temporele resoluties dan deze technieken, waardoor visualisatie van fijne structuren en snelle dynamiek in dierlijke harten. Confocale microscopie is een ander veel gebruikt beeldvormende techniek, maar zijn lage beeldvorming penetratie en vordering van beeldvormende contrastmiddelen de toepassingen ervan te beperken in levende dieren. Relatief, OCM zorgt voor een hoge snelheid en label-free imaging voor het visualiseren van een snelle cardiale dynamiek van niet-invasieve in kleine dieren. Er zijn echter nog steeds beperkingen OCM. Zo wordt de beeldvormende diepte verschaft door OCM beperkt door lichtverstrooiing van enkele honderden micron tot ongeveer 1 mm in weefsel terwijl het ultrageluid penetratie diepte van 10 cm. Vergeleken met confocale microscopie, OCM heeft een hogere snelheid en een betere beeldvorming diepte, maar met een lagere resolutie en slechte moleculaire contrast. Bovendien zijn onze huidige OCM systeem is based op spectrale-domein detectiesystemen. Hogere snelheid van de beeldvorming op basis van swept-source OCM 45 kan meer verschillende beelden van de snelle dynamiek, zoals de hartslag te bieden.
Longitudinale studie van de hartslag in Drosophila met OCM voeren, zijn er verschillende kritische stappen in het protocol. De vliegen moet zeer delicaat worden behandeld in alle stadia van het experiment. Managing larve moeten extra zacht omdat het gemakkelijk is om de larve, die van invloed kunnen hartstructuur en functie in de volgende ontwikkelingsstadia beschadigen. De vliegen moet op het dekglas en de afbeeldeenheid zeer nauwkeurig. Slecht gepositioneerd vliegen maakt het moeilijk te verwerven kwaliteit beelden en kunnen scheef structurele en functionele hart parameterwaarden veroorzaken. Bovendien, het overbrengen van volwassen vliegen van de ene buis naar de andere en het aansluiten van de katoenen bal moet zeer snel om hun ontsnapping te voorkomen dat de buis.
Verschillende studiesDrosophila ontwikkeling van het hart kan worden uitgevoerd door het modificeren van het protocol. De temperatuur waarbij de vliegen worden gekweekt kan worden verhoogd of verlaagd van 25 ° C om de cardiale genexpressie niveau veranderen en verandert de ontwikkeling vlieg periode. Het voegt enkele ingrediënten zoals kokosnootolie of ATR het standaard voedsel, kan de ontwikkeling van het hart worden gewijzigd. Specifieke studies kunnen worden uitgevoerd in het wild type of transgene vliegen. Bij het bestuderen fruitvlieg hartontwikkeling langsrichting kunnen verschillende tijdsintervallen worden gebruikt om de OCM metingen, bijvoorbeeld, kan een 8 uur interval worden gebruikt tijdens het popstadium stadia. Vanwege beperkte gevoeligheid van onze OCM systeem is veel uniforme spikkelruis in de transversale M-modus beelden, die kan het moeilijk volledig te kunnen hart contractie signalen herkennen Matlab programma en de efficiëntie van gegevensanalyse verminderen. De gevoeligheid kan worden verhoogd door een betere uitlijning van de OCM systeem. Geoptimaliseerde filtering algoritmenHet verdient aanbeveling een gedeelte van de vlekken te verwijderen.
De beschreven protocol werd toegepast op de stilte van menselijke circadiane orthologen, dCry en dClock geïnduceerde hartafwijkingen Drosophila bestuderen. Verminderde HRs werden waargenomen bij verschillende ontwikkelingsstadia, waaronder larve, pop en volwassen 15,16. De rol van de circadiane genen in de ontwikkeling van het hart is geopenbaard, die de associatie tussen cardiovasculaire aandoeningen en circadiane ritme gerelateerde activiteit patronen kan verklaren. High-vet-dieet (HFD) geïnduceerde hartstoornissen werden ook onderzocht door het analyseren van hart functionele veranderingen van fruitvliegen gevoed met HFD 15. Deze studies toonden niet alleen Drosophila als een krachtig instrument in de ontwikkelingsstudie hart structuur en functie, maar ook de betekenis van cardiale longitudinaal onderzoek begrijpen aangeboren en postnatale menselijke ziekten. De OCM-platform zal een breed scala van toekomstige studies mogelijk te maken in gen dat verwant is menselijk hart-en vaatziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
References
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
- Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
- Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
- Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
- Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
- Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
- Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
- Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
- Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
- Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
- Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
- Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
- Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
- Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
- Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
- Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
- Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
- Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
- Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
- Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
- Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
- Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
- Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
- Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
- Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
- Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
- Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
- Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
- Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).
