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Biology

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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Étude longitudinale du cœur chez les petits animaux contribue à la compréhension d' une variété de maladies cardiovasculaires liées humaines, comme gènes liés à des malformations cardiaques congénitales 1,2. Au cours des dernières décennies, divers modèles animaux, tels que le 3,4 de la souris, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviaire 9, et Drosophila 10-16, ont été utilisées pour mener le cœur du développement humain recherche liée. Le modèle de souris a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque normal et anormal et phénotypes de défauts cardiaques en raison de ses similitudes avec le 3,4 cœur humain. L'embryon de Xenopus est particulièrement utile dans l'étude du développement cardiaque due à sa facilité de manipulation et partielle 5,6 transparence. La transparence de l'embryon et larve début du modèle zebrafish permet l' observation optique facile cardiaque 7,8 de développement. Le modèle aviaire est un sujet commun d'études cardiaques développement because le cœur peut être facilement accessible après avoir retiré les coquilles et la similitude morphologique des coeurs aviaires aux humains 9. Le modèle drosophile a des caractéristiques uniques qui le rendent idéal pour la réalisation d' études longitudinales du cœur. Tout d' abord, le tube du coeur de la drosophile est d' environ 200 um en dessous de la surface dorsale, qui fournit un accès facilité pour l' observation optique et du coeur. En outre, de nombreux mécanismes moléculaires et les voies génétiques sont conservées entre la drosophile et les vertébrés. Les orthologues de plus de 75% des gènes de maladies humaines ont été trouvées chez la drosophile, qui ont fait largement utilisé dans les études transgéniques 11,13. En outre, il a un cycle de vie court et faibles coûts de maintenance, et a été couramment utilisé comme un modèle exemplaire pour la recherche sur la biologie du développement 14-16.

Les rapports précédents ont décrit les protocoles de surveillance de la fonction cardiaque chez la drosophile comme le luiartbeat. Toutefois, les procédures de dissection ont été nécessaires 17,18. L'imagerie optique fournit un moyen efficace pour visualiser le développement cardiaque chez les animaux en raison de sa nature non-invasive. Différentes modalités d'imagerie optique ont été appliquées dans l' exécution de l' étude cardiaque des animaux, tels que la microscopie à deux photons 19, microscopie confocale 20,21, microscopie nappe de lumière 22, et tomographie par cohérence optique (OCT) 16,23-26. Comparativement, EAO est capable de fournir une grande profondeur d'imagerie dans les petits coeurs des animaux sans l'aide d'agents de contraste, tout en conservant une haute résolution et une vitesse d'imagerie ultravide, qui sont importants pour l'imagerie des animaux vivants. En outre, le faible coût de développement d'un système octobre a popularisé cette technique pour l'imagerie optique de spécimens. Octobre a été utilisé avec succès pour l'étude longitudinale de la drosophile. Utilisation de EAO, l'imagerie morphologique et fonctionnelle cardiaque a été réalisée pour étudier les structures cardiaques, le foncrôles additionnelles de gènes, et les mécanismes de défauts cardiovasculaires dans les modèles mutants au cours du développement cardiaque. Par exemple, le déclin de la fonction cardiaque dépendant de l' âge a été confirmée par conversion de l' angiotensine liés enzyme (ACER) gène régulé à la baisse chez la drosophile avec le 27 octobre. Phénotypage du gène lié cardiomyopathie a été démontrée chez la drosophile en utilisant 28-33 octobre. Les recherches utilisant octobre a également révélé le rôle fonctionnel du gène SOX5 humain au cœur de Drosophila 34. Par rapport à octobre, OCM utilise un objectif avec une ouverture numérique supérieure pour fournir une meilleure résolution transversale. Dans le passé, le dysfonctionnement cardiaque causé par silençage un gène circadien humain orthologue dCry / dclock a été étudiée en utilisant un système de OCM personnalisé 15,16, ainsi que l'effet de la haute teneur en graisses-alimentation sur cardiomyopathies chez la drosophile pour comprendre l' obésité induite par l' homme maladies cardiaques. 15

Ici, ee protocole expérimental est résumée pour l' étude longitudinale des changements morphologiques et fonctionnels cardiaques chez la drosophile au deuxième stade (L2), troisième stade (L3), le jour de pupe 1 (PD1), le jour de pupe 2 (PD2), le jour de pupe 3 (PD3) , pupe jour 4 (PD4), le jour de pupe 5 (PD5) et adultes (Figure 1) à l' aide OCM pour faciliter l' étude des maladies cardiaques congénitales liées à l' homme. paramètres fonctionnels cardiaques, tels que les RH et la PAC ont été analysés de façon quantitative à différents stades de développement des caractéristiques cardiaques développement révéler.

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Protocol

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1. Préparation du système d'imagerie optique OCM de la drosophile 16

  1. Sélectionnez un spectromètre et d' une caméra de balayage ligne à grande vitesse qui fournit un débit d'au moins 80 images / sec cadre de sorte que le système d'OCM sera en mesure de résoudre le battement de coeur de la drosophile.
  2. Utiliser une source de lumière à large bande afin d' assurer la résolution axiale de 2 um pour identifier la structure du coeur de la drosophile.
  3. Utilisez un objectif 10X pour obtenir une résolution transversale élevée.
  4. Utilisez un miroir à 45 ° de la tige pour réfléchir le faisceau de lumière du bras de référence et pour générer un faisceau de lumière de bras d'échantillon annulaire pour étendre la profondeur de champ dans les échantillons.
  5. Élaborer un programme informatique personnalisé pour contrôler le système et effectuer des mesures OCM.

2. Drosophila Culture

  1. Norme Fly Préparation des aliments
    1. Mettre ~ 5 ml de la formule instantanée drosophile dans un flacon en polystyrènele tube à l'aide d'une goulotte à papier.
    2. Versez ~ 8 ml d'eau dans la formule pour saturer correctement la nourriture.
    3. Ajouter différents suppléments à la nourriture de mouche standard pour différentes expériences. Lors de la préparation pour les tout - -retinal (ATR) aliments trans pour la stimulation optogenetic expérience 35, utiliser une pipette pour extraire mM ATR 100 et dissoudre dans ~ 8 ml d' eau pour obtenir la concentration ATR de 1 mM dans les aliments. Après avoir mélangé la solution uniformément, verser la solution dans la formule et remuer suffisamment.
    4. Pour préparer une graisse alimentation riche pour l' étude des dysfonctionnements cardiaques liées à l'obésité chez la drosophile, 10,15 mélange ~ 10 ml formule avec 15 ml d' eau dans une tasse et de la chaleur pendant 30 secondes dans un four à micro - ondes. Mettez un peu d'huile de noix de coco extra vierge organique dans une autre tasse et chauffer pendant 90 secondes dans le four à micro-ondes.
    5. Extrait 7,5 ml d'huile de noix de coco et mélanger avec la formule préparée suffisamment pour rendre le rapport poids / volume d'huile de noix de coco à la nourriture ~ 30/100, et een extrait ~ 2 ml mélangés nourriture et le mettre au fond d'un tube.
    6. Attendre 1 min jusqu'à ce que le milieu est complètement saturé. Compacter la nourriture soigneusement avec une surface plane afin d' optimiser les conditions de vie de la drosophile. Ajouter 6 - 8 grains de levure à la formule préparée, et branchez le tube avec une grappe de coton.
  2. Fruit Fly Croix et Culture
    1. Prenez un tube avec des aliments préparés à la mouche standard, et enlever le coton branché. Soigneusement transférer les mouches adultes (hommes et femmes) dans le tube, et branchez le tube avec du coton immédiatement. Vérifiez le coton pour vous assurer qu'il n'y a pas d'écart entre le coton et la paroi du tube pour empêcher les mouches de sortir du tube.
    2. Gardez les mouches des fruits dans l'incubateur à 25 ° C pour les croisements. La plupart des gènes sont actifs et les protéines cellulaires sont synthétisés à 25 ° C 36-39.
    3. Prenez le tube hors de l'incubateur après 8 transfert de la main la unedult vole hors du tube pour obtenir les oeufs au même âge pour le contrôle expérimental.
    4. Continuez à cultiver les oeufs dans l'incubateur à 25 ° C, ce qui est la température standard pour le développement de Drosophila avec la période de développement de 8,5 jours 40,41.
      NOTE: La température influence la période de développement (de l'œuf à l'adulte) et le niveau de divers gènes d'expression.

3. Réalisation d'imagerie optique avec OCM

  1. Mont Fly Larva pour l' imagerie optique
    NOTE: L'œuf de trappes de Drosophila en 22-24 heures à 25 ° C à la première stade larvaire (L1). Le deuxième stade larvaire émerge après l'autre 24 heures. La plus grande forme larvaire est le troisième stade larvaire, qui mues après environ 24 heures. Les caractéristiques structurelles de larves peuvent être utilisés pour distinguer leurs différents stades de développement. La taille des pièces buccales entre le premier stade et le deuxième stade est différent. La bouchecrochets de la première larve de stade larvaire sont très petites et ressemblent à deux paires de minuscules taches noires, tandis que la bouche des crochets du second stade larvaire sont plus grandes et la structure est plus claire. Les stigmates sont généralement utilisés pour identifier le deuxième stade et du troisième stade larvaire. Le deuxième stade larvaire a matraqué stigmates antérieurs, tandis que, pour le troisième stade larvaire, les stigmates antérieurs sont ramifiés. Un anneau orange foncé commence à apparaître au bout des stigmates postérieurs au troisième stade larvaire.
    1. Appliquez un morceau de ruban adhésif double face à une lame de verre de microscope propre. Expulsez les bulles d'air sous la bande pour éviter les réflexions causées par des bulles d'air lors de l'imagerie.
    2. Prenez l'un des tubes avec les mouches cultivées sur de l'incubateur au stade larvaire.
    3. Identifier la larve dans les médias, retirez-le de la presse avec une brosse douce et placer sur un tissu propre. Retirez tous les aliments collé à la larve avec une brosse douce humide et sécher sur le tissu.
    4. Déplacez le cleaneD voler vers un tissu sous l'objectif d'un microscope à champ large.
    5. Réglez la mise au point du microscope pour trouver une vision claire de la mouche. Identifier la scène droite développement de la larve par ses caractéristiques structurelles avec le microscope.
    6. Positionner la volée en utilisant la brosse douce. Assurez-vous que le corps est droit avec la face dorsale vers le haut pour se préparer à monter sur la lame de verre par la face dorsale. Effectuez cette étape sous le microscope.
    7. Veiller à la larve est complètement sec avant de monter sur la bande. Dans le cas contraire, la larve ne sera pas adhérer à la bande.
    8. Collez la face dorsale de la mouche positionnée sur la bande double face sur la lame de verre avec une pression modérée. Notez que trop de pression peut tuer la mouche et trop peu de force conduira à voler le mouvement lors de l'imagerie.
  2. L' imagerie optique de la drosophile aux stades larvaires (L2 et L3) avec OCM
    NOTE: Une large lumière du tube cardiaque peut être found situé dans les segments entre A5 à A8 aux stades larvaires (Figure 1). Les images en mode M OCM transversal (2D + temps) ont été acquises au niveau du segment A7 du tube de coeur pour chaque larve pour faciliter la tension artérielle systolique et diastolique d'analyse.
    1. Placer la chenille montée sur la platine porte-échantillon ajustable du système BGC selon la direction y transversale à la face dorsale tournée vers le haut en dessous de la lentille d'objectif. Un petit trou dans l'étape d'échantillonnage est nécessaire pour placer la chenille afin d'éviter son contact avec le plan de la scène.
    2. Ajuster la phase de l'échantillon pour déplacer le tube de coeur de la drosophile au plan focal du faisceau d'imagerie. Pour trouver facilement le segment A7, trouver la région postérieure du tube cardiaque avec le temps réel des images MCO en coupe transversale dans le logiciel d'acquisition d'image. Ensuite, passez la scène vers l'avant jusqu'à le segment A7 est visible.
    3. Définissez les paramètres du logiciel d'acquisition d'image à 100 A-scans par B-scan (cadre), 100 B-scans et le scannela tension r ~ couvrir 0,28 mm dans la direction transversale X et 0 V dans la direction y transversale. Cliquez sur le bouton "start" dans le logiciel pour acquérir les données de bruit de fond pour soustraction de fond en bloquant le trajet du faisceau d'échantillon avec un tissu sombre.
      REMARQUE: 3 des 100 images peuvent être utilisées pour la soustraction de fond.
    4. Régler les paramètres du logiciel d'acquisition de données 128 A-scans par balayage B, 4096 B-scan et la tension de balayage pour couvrir ~ 0,28 mm dans la direction x-transversale, et 0 V dans la direction y transversale. Cliquez sur le bouton "start" dans le logiciel pour acquérir les images transversales en mode M à travers le segment A7 du tube cardiaque à la mouche sur une région couvrant 0,28 x 0,57 mm 2 pendant environ 30 secondes.
    5. Bloquer le faisceau d'imagerie utilisant un tissu sombre pendant le processus de sauvegarde des données pour éviter une exposition prolongée du coeur de la mouche à la lumière d'imagerie.
    6. Répétez la mesure pour 5 fois pour obtenir une mesure fiable de l'amusement de coeurction.
    7. Définissez les paramètres du logiciel d'acquisition d'image à 400 A-scans par B-scan, 800 B-scans, et la tension du scanner pour couvrir ~ 1,7 mm dans la direction x-transversale, et ~ 4 mm dans la direction y transverse. Déplacer la scène dans les deux directions pour assurer l'ensemble de la mouche des fruits peut être imagée. Cliquez sur le bouton "start" dans le logiciel pour acquérir un ensemble de données pour obtenir des images de la mouche des fruits en 3 dimensions. Remarque: La structure de volée 3D peut être rendu à l'aide du logiciel Amira 3D
    8. Utilisez une brosse douce humide pour humidifier la volée mesurée et doucement le retirer de la lame de verre. Déplacez-le dans un tube séparé pour le développement continu. Etiqueter le tube pour l'étude longitudinale à travers les prochaines étapes de développement.
  3. Image Drosophila aux étapes de nymphose
    REMARQUE: Tous les mouches des fruits ont été prélevés pour l'imagerie de PD1 à PD5. Comme on le voit sur le schéma de la larve de la figure 1b, un large passage reste en A5 à A8 segments de thtube cardiaque e jusqu'à ce que PD1. De PD2, une chambre conique commence à se développer entre A1 à A4 segments. Pour acquérir des images cohérentes et faciliter l' analyse cardiaque, transversales images en mode M ont été obtenus à partir du segment de A7 à PD1, et du secteur A1 après PD2, tel qu'indiqué dans la figure 1b.
    1. Image Drosophila à PD1
      NOTE: Drosophila aura un puparium blanc pour une fenêtre de temps court (0-1 h) pendant PD1. Cette fenêtre de temps est idéal pour effectuer l'imagerie optique de pupe tôt parce que la transparence élevée conduit à la pénétration de lumière plus élevée pour l'imagerie de l'OCM.
      1. Comme les mouches des fruits se trouvent sur la paroi du tube quand ils deviennent chrysalides, retirez la pupe de tubes individuels pour l'imagerie à PD1 avec une brosse douce humide, et nettoyer la chrysalide avec la brosse, s'il y a la nourriture collée au corps.
      2. Monter la mouche des fruits sur une petite lame de verre directement avec la brosse humide et garder la face dorsale vers le haut (figure 1a
      3. Éliminer l'excès d'eau du côté du corps de mouche.
      4. Mettez la lame de verre sur la scène du système OCM de l'échantillon, en gardant la mouche des fruits sur le dessus. Trouver une image claire en temps réel du segment A7 du cœur à la mouche en utilisant la même stratégie décrite dans la mesure de la larve.
      5. Définissez les mêmes paramètres du logiciel d'acquisition de données dans la section 3.2, et l'image les battements de coeur au segment A7 d'acquérir M-mode transverse et des images 3D.
      6. Après l'imagerie, utilisez une pince pour placer la lame de verre avec pupe dans le tube pour la culture continue.
    2. Image Drosophila à PD2 aux stades Pd5
      REMARQUE: Etant donné que l'échantillon devient de plus en plus opaque au cours des étapes de nymphose, la profondeur du système d'imagerie de pénétration sera réduite.
      1. Utilisez une pince à épiler pour retirer soigneusement le verre slide monté à la mouche à PD2 du tube pour l'imagerie. À PD2, la coquille de l' échantillon devient jaune et le corps devient moins transparent par rapport à PD1 (figure 1).
      2. Mettre la lame sur la platine du système OCM de l'échantillon.
      3. Ajuster la phase de l'échantillon à se déplacer à la volée dans le plan focal du faisceau d'imagerie du système BGC. Trouver l'extrémité antérieure du tube cardiaque en temps réel image MCO en coupe avec. Déplacer ~ 50 pm dans la direction postérieure pour trouver le segment A1 du tube cardiaque.
        NOTE: A ce stade du développement cardiaque (PD2), la chambre conique sera très faible et ne peut pas être battu.
      4. Collecter des jeux de données transverses en mode M du segment A1 ainsi que des données 3D en utilisant la même méthode que celle des stades de développement précédents.
      5. Replacer la lame sur le tube soigneusement pour la culture continue.
        NOTE: À PD3, la couleur de l'échantillon dans la coquille est plus sombre que celle à l'étape PD2. Au stade PD4, rayures noires can être observée à l'intérieur de la coquille des spécimens. Certaines mouches vont se développer en adultes à partir de cette étape du lendemain, tandis que d'autres vont évoluer vers PD5. Au stade PD5, des bandes noires sont encore plus évidemment vu dans les mouches des fruits. Ces mouches deviendront adultes dans le jour suivant.
  4. Image Drosophila au stade adulte
    Remarque: Au stade adulte, les mouches mâles et femelles peuvent être distinguées par la taille du corps et de la couleur du bas-ventre. Les femelles adultes ont une plus grande taille, tandis que les mâles sont plus petits et de couleur foncée dans le bas ventre.
    1. Prenez le tube hors de l'incubateur lorsque la mouche des fruits se développe en un adulte, et le transfert de l'adulte voler à un ~ 45 ml flacon vide.
    2. Trempez l'extrémité absorbante (~ 1 cm de longueur, ~ 3 mm de diamètre) d'une baguette dans l'anesthésie, mettez la baguette dans le flacon, et branchez le tube avec une grappe de coton pour maintenir l'extrémité anesthésique juste en dessous du coton branché et anesthetize la volée pendant 3 min. La durée de l'anesthésie dépend de la taille de la mouche, et peut varier entre 02/05 à 03/05 min (par exemple, pendant 2,5 minutes mâle et femelle pour 3 ou 3,5 min).
    3. Préparer une lame de verre avec un morceau de ruban adhésif double face.
    4. Déplacer la volée anesthésiés sur la lame de verre avec face dorsale vers le haut en utilisant la brosse douce.
    5. Séparer les ailes en utilisant une pince à épiler et coller les ailes sur la bande sous un microscope pour fixer la volée et d'exposer la région du cœur pour l'imagerie.
    6. Image à la volée à partir du segment A1 du coeur de mouche (Figure 1). A la fin de l'expérience, la mouche peut être sacrifiée.

4. Imagerie Analyse 16

  1. Développer des programmes Matlab pour convertir les fichiers binaires 2D et 3D collectées avec le logiciel d'acquisition d'image pour les fichiers d'image.
  2. Utilisez ImageJ pour identifier la région du tube cardiaque dans les transversales images en mode M et un algorithme de baguette magique pour creatmasque ea de la région du cœur pour chaque image transversale M-mode. Segment de la région masquée et utiliser un algorithme de pointe trouver pour identifier les emplacements systolique et diastolique. Calculer les dépendants des changements de temps de diamètre du coeur des transversales images en mode M.
  3. Sur la base des dépendants diamètres cardiaques de temps acquis, calculer les paramètres cardiaques tels que HR, période d'activité cardiaque (CAP), fin diamètre diastole (EDD), fin diamètre systole (ESD), fin zone diastole (EDA), et mettre fin à la zone systole ( ESA). Calculer la fraction de raccourcissement (FS) avec L'équation 1
  4. Utilisez ImageJ pour analyser les images 3D OCM pour visualiser l'évolution structurelle du cœur à la mouche.

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Representative Results

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L'imagerie cardiaque longitudinale a été réalisée en utilisant les mouches des fruits avec le 24B-GAL4 / + déformation à température ambiante avec OCM. Les mesures ont été effectuées à L2, L3, et à des intervalles de 8 h de PD1 à PD4 et jour pour adultes 1 (AD1) pour suivre le processus de métamorphose (tableau 1). Larve, pupe tôt, fin pupe et les mouches adultes ont été montés sur les lames de verre comme on le voit sur la figure 1A. Les caractéristiques des segments du cœur pour les mouches larvaires et adultes ont été présentés dans les représentations schématiques de la figure 1B.

Dans cette étude, le développement, 4096 cadres ont été acquises en 32 sec avec notre système de mesure OCM pour tracer le rythme cardiaque d'une mouche des fruits. Pour améliorer la précision des mesures, cinq mesures répétées ont été prises pour chaque échantillon à chaque stade de développement. données 3D peuvent également être obtenus pour observer les changements de structure du cœur pendant la métamorphose.

Transverse M-mode et des images 3D étaient c réé avec des programmes et ImageJ Matlab personnalisés. En images du visage et des coupes axiales ont également été construits à partir des données acquises pour visualiser le processus de remodelage du coeur pendant la drosophile métamorphose (Figure 2). Pour quantifier la fonction cardiaque des mouches des fruits, la région du coeur a été automatiquement segmenté en utilisant un programme Matlab personnalisé à partir de tous les 4096 cadres. La fréquence cardiaque à la mouche (HR) peut être quantifiée à partir des images OCM transversale en mode M (Figure 3a). Pendant les pupes, le cœur cesse de battre Drosophila parfois 16. Nous avons introduit un nouveau paramètre fonctionnel cardiaque, période d'activité cardiaque (CAP) pour quantifier le rapport de la période avec un battement de coeur à l'heure d'imagerie totale (Figure 3b). EDD, ESD, EDA, l' ESA, et FS ont également été utilisés pour quantifier les changements de la chambre cardiaque dans les deux axiaux et transversaux dimensions au cours du développement de Drosophila. 16

content "> Au stade larvaire, le tube cardiaque commence à la partie postérieure abdominale région A8 avec une lumière plus larges (A5 - A8 à la figure 1B) et se termine au segment antérieur dorsal A1 avec un diamètre plus étroit (T3 / A1 - A5 dans la figure 1B ). la chambre de coeur a été localisé dedans et dorsalement et a grossi au cours de L2 (Figure 2 a, b) et L3 (Figure 2 c, d). Après avoir entré PD1, le tube cardiaque a été observée en cours d' exécution axialement au - dessus d'un air en mouvement bulle (Figure 2 e, f) Environ 10 -. 13 heures plus tard, la bulle a disparu après la formation de puparium et les grandes lumen est devenu éversée Depuis le tube cardiaque antérieure a été ventral situé, l'ensemble tube cardiaque était invisible , sauf la région postérieure du. . images MCO ~ 12 heures après la formation de puparium plus tard au cours de PD2, la chambre de coeur alignés progressivement le long de l'abdomen dorsal, et la partie postérieure (A6 - A8) du coeur a été éliminé (Figure 2 g, h) 42,43. Une chambre conique a commencé à développer ~ A1 - A4 secteur pendant PD2 et a grandi en taille jusqu'à ce que le stade adulte (figure 2 i - m).

Outre l'observation des changements structurels, de nombreux changements fonctionnels ont été trouvés aussi bien pendant le remodelage cardiaque. Les images en mode M représentés sur la figure 3 montrent que le rythme cardiaque ralentit de manière significative à partir du stade larvaire au stade de pupe, puis a augmenté sensiblement de chrysalide à l' âge adulte. Les changements des ressources humaines significatives ont été observées au cours du cycle de vie (figure 4a). Par ailleurs, la période d'activité cardiaque (CAP) a été analysé pour tous les échantillons mesurés à partir AD1 L2 (figure 4b). Comme le montre la figure 4, HR détient au ~ 277 battements par minute (bpm) pour L2 et L3. En entrant dans les pupes début il y a une diminution marquée des ressources humaines et de la PAC. RH est réduit à 86 ± 11 battements par minute au début de PD1 et continue à diminuer jusqu'à 26 ± 8 cpm par l'ee de PD1 enfin venir à un arrêt complet au début de PD2. Une découverte intéressante est la longue période d'inactivité cardiaque observée autour de stade PD2 (~ 24 h - 48 h après la formation de puparium), appelé diastalsis développement comme cardiaque 16. A la fin de PD2, battant intermittente lente reprise (HR 17 bpm ± 6 avec CAP 5 ± 2). Tout au long de PD3 et PD4, HR et CAP augmentation jusqu'à atteindre 392 ± 32 bpm et 95 ± 3% au premier jour du stade adulte (5 jours après le début du stade de pupe).

Figure 1
Figure 1. Montage de la drosophile à différents stades et représentation schématique du coeur Metamorphosis. (a) Montage des larves, des pupes et adultes WT (24B-GAL4 / +) vole sur des lames de verre. (b) Représentation schématique du coeur métamorphose. Les flèches rouges sur la larve et adulte schematic représentent les emplacements d'imagerie OCM mode M jusqu'à PD1 24 h et pour les points de temps suivants, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Drosophila Coeur changements morphologiques. En face et axiales images MCO en coupe d'un Drosophila WT obtenu à (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 et (k, m) adulte étapes. Images en mode M du cœur Drosophila ont été obtenus à partir du segment A7 jusqu'à PD1 et du secteur A1 pour les étapes ultérieures. Les barres d'échelle en en images en coupe visage et axiales représentent 200 um et 500 um, respectively. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Drosophila Coeur Changements fonctionnels. (a) des images en mode M à différents stades de développement montrant les changements de RH dans l' ensemble du cycle de vie. (b) Des exemples démontrant période d'activité cardiaque (CAP) de calcul. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Analyse quantitative du paramètre cardiaque fonctionnelles dans le document WT Flies aux stades de développement différents, y compris L2, L3, pupes à des intervalles de 8 h, et AD1. (a) HR. (b) CAP. La barre d'erreur de chaque groupe représente l'écart-type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Stade de développement
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h 88 h
Nombre d'échantillons 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

Tableau 1. Nombre de WT Fruit Flies Mesurée à divers stades de développement dans l'étude du développement cardiaque.

Vidéo 1
Vidéo 1. Suivi de Heartbeat Le long dimension temporelle et correspondant Chambre Coeur Diamètre Change le long de la direction z (direction axiale) dans un WT volent à L2. Le cœur battait relativement rapide à un rythme régulier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.) p>

Vidéo 2
Vidéo 2. Suivi de Heartbeat le long dimension temporelle et correspondant Chambre Coeur Diamètre Change le long de la direction z (direction axiale) dans un WT volent à PD1. Le HR a commencé à diminuer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 3
Vidéo 3. Suivi de Heartbeat le long dimension temporelle et correspondant Chambre Coeur Diamètre Change le long de la direction z (direction axiale) dans un WT volent à PD2. Le cœur a cessé de battre complètement pendant le temps. L'oscillation du tracé z diamètre était dû au bruit de l'imagerie. target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 4
Vidéo 4. Suivi de Heartbeat le long dimension temporelle et correspondant Chambre Coeur Diamètre Change le long de la direction z (direction axiale) dans un WT volent à PD4. Après PD2, HR et CAP ont commencé à augmenter. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 5
Vidéo 5. Suivi de Heartbeat le long dimension temporelle et correspondant Chambre Coeur Diamètre Change le long de la direction z (direction axiale) dans un WT Fly à AD1. Le HR était le plus élevé parmi toutes les étapes et la PAC était presque 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Vidéo 6
Rendu structurel Vidéo 6. 3D d'une mouche larvaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

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L'accélération du rythme cardiaque de la drosophile, avec un HR maximum autour de 400 bpm à des stades larvaires et adultes, exige de la vitesse élevée d'imagerie pour résoudre les diastole cardiaques et systole (pas moins de 80 images / s basé sur les expériences). En raison de la faible épaisseur de la taille de la chambre cardiaque et micron échelle paroi cardiaque (5-10 um), une résolution spatiale élevée (supérieure à 2 pm) est nécessaire pour résoudre les structures tubulaires de coeur. Dans cette étude, un système de vitesse OCM ultra haute résolution et a été mis au point, où un spectromètre à transmission 600 lignes / mm réseau et une caméra à balayage linéaire 2048 pixels ont été utilisés. Un taux de 20 kHz A-scan est fourni par la caméra de balayage linéaire. Le taux de 128 cadres de trame / sec est suffisamment rapide pour capturer le rythme cardiaque chez la drosophile à plusieurs stades de développement, y compris L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 et adulte. La source de lumière est une source de lumière de bande passante supercontinuum large avec une longueur d'onde centrale et la bande passante de ~ 800 nm et ~220 nm, respectivement, et obtient une résolution axiale de ~ 1,3 pm dans un tissu. Un objectif 10X a été utilisé dans le bras d'échantillon pour réaliser une résolution transversale de ~ 3,9 um. Etant donné que le tube du coeur de la drosophile est d' environ 200 um en dessous de la surface dorsale, une profondeur de plusieurs centaines de mètres microns d'imagerie est nécessaire. Un miroir en forme de tige 45 ° peut être utilisé pour générer un faisceau d'échantillon annulaire et étendre la profondeur du foyer dans le spécimen 44. La sensibilité et 3 dB roll-off ont été déterminées à 96 dB et 600 um, respectivement avec la puissance du bras échantillon de ~ 9 mW. Un programme informatique personnalisé a été utilisé pour contrôler le système et effectuer les OCM mesures. Les images cardiaques structurelles et les paramètres fonctionnels obtenus démontrent la faisabilité d'utiliser pour caractériser quantitativement OCM la morphologie de la fonction cardiaque et de la drosophile dans l' ensemble de son cycle de vie.

À l'heure actuelle, plusieurs autres techniques sont également utilisées pour imager une petiteanimaux de la structure ou de la fonction cardiaque, comme la tomodensitométrie (CT), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et l'échographie. OCM fournit des résolutions spatiales et temporelles plus élevées que ces techniques, ce qui permet la visualisation des structures fines et dynamiques rapides dans les coeurs des animaux. La microscopie confocale est une autre technique d'imagerie largement utilisé, mais sa faible pénétration de l'imagerie et de réquisition des agents de contraste d'imagerie limiter ses applications d'animaux vivants. Comparativement, OCM permet à haute vitesse et de l'imagerie sans étiquette pour la visualisation dynamique cardiaque rapide non invasive chez les petits animaux. Cependant, il y a encore des limitations de l'OCM. Par exemple, la profondeur d'imagerie fournie par BGC est limitée par la diffusion de la lumière provenant de plusieurs centaines de microns à environ 1 mm dans le tissu tandis que les ultrasons a des profondeurs de pénétration allant jusqu'à 10 cm. Par rapport à la microscopie confocale, a une vitesse OCM plus élevée et une meilleure profondeur d'imagerie, mais avec une résolution plus faible et le contraste moléculaire pauvres. En outre, notre système actuel est ba OCMsed sur les systèmes de détection de domaine spectral. Une plus grande vitesse d'imagerie basée sur balayé source peut fournir des 45 OCM images plus distinctes de dynamique rapide comme le rythme cardiaque.

Pour effectuer l'étude longitudinale du rythme cardiaque chez la drosophile avec OCM, il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Les mouches doivent être manipulés avec beaucoup de délicatesse à toutes les étapes de l'expérience. Gestion larve doit être particulièrement douce, car il est facile d'endommager la larve, ce qui pourrait affecter la structure et la fonction cardiaque dans les stades de développement suivants. Les mouches doivent être positionnés sur la vitre de recouvrement et l'étape de formation d'image très précise. mouches positionnées mal, il sera difficile d'acquérir des images de qualité et peut entraîner des valeurs structurelles et fonctionnelles asymétriques paramètres cardiaques. En outre, le transfert de mouches adultes d'un tube à l'autre et de brancher la boule de coton devrait être très rapide pour empêcher leur fuite du tube.

Différentes études surLe développement du cœur drosophile peut être réalisée en modifiant le protocole. La température à laquelle les mouches sont cultivées peut être augmentée ou diminuée de 25 ° C pour modifier le niveau d'expression de gène cardiaque et changer la période de développement des mouches. En y ajoutant des ingrédients tels que l'huile de coco ou de l'ATR pour la nourriture standard, le développement du cœur peut être modifiée. Des études spécifiques peuvent être réalisées dans le type sauvage ou des mouches transgéniques. Lorsque l'on étudie le développement du cœur de la mouche des fruits longitudinalement, des intervalles de temps différents peuvent être utilisés pour effectuer les mesures OCM, par exemple, un intervalle de 8 heures pourrait être utilisé au cours des étapes de nymphose. En raison de la sensibilité limitée de notre système OCM, beaucoup de bruit de chatoiement uniforme se trouve dans les transversales images en mode M, ce qui peut rendre difficile à identifier correctement les signaux coeur de contraction des programmes Matlab et de diminuer l'efficacité de l'analyse des données. La sensibilité peut être augmentée par l'amélioration de l'alignement du système des appels sortants. algorithmes de filtrage optimisésil est recommandé de retirer une partie des mouchetures.

Le protocole décrit a été appliqué pour étudier le silence des orthologues circadiens humains, malformations cardiaques induites dCry et dclock chez la drosophile. HRs Diminution ont été observées à différents stades de développement, y compris larve, nymphe et adulte 15,16. Le rôle des gènes circadiens dans le développement cardiaque a été révélé, ce qui peut expliquer l'association entre les troubles cardio-vasculaires et les modèles d'activité connexes du rythme circadien. Haute-fat-alimentation (SIH) troubles cardiaques induits ont également été étudiés en analysant les changements fonctionnels cardiaques de mouches des fruits nourris avec HFD 15. Ces études ont démontré non seulement la drosophile comme un outil puissant dans l'étude sur le développement de la structure et de la fonction cardiaque, mais aussi l'importance de l' étude longitudinale cardiaque dans la compréhension des maladies humaines congénitales et postnatales. La plate-forme OCM permettra un large éventail d'études futures in gène lié à la maladie cardiaque humaine.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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<em>Drosophila</em> Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque <em>in vivo</em> en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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