Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Drosophila Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция In Vivo Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Продольная исследование сердца у мелких животных способствует пониманию различных сопутствующих сердечно - сосудистых заболеваний человека, таких как дефекты врожденных пороков сердца , связанных с генными 1,2. В последние десятилетия, различных животных моделях, таких как 3,4 мыши, Xenopus 5,6, 7,8, данио птичьего 9 и Drosophila 10-16, были использованы для проведения человеческого сердца-разработок в области научных исследований. Модель мыши широко используется для изучения нормальных и ненормальных развития сердца и сердечные фенотипы дефектов из - за его сходства с человеческим 3,4 сердца. Эмбрион Хепориз особенно полезен при изучении развития сердца из - за его легкой обработки и частичной прозрачности 5,6. Прозрачность эмбриона и ранней личинки данио модели позволяет легко оптического наблюдения сердца 7,8 развития. Птичий модель является общим предметом исследований в области развития сердца becausе сердце может быть легко доступны после удаления скорлупу и морфологическое сходство птиц сердца для людей 9. Модель дрозофилы имеет ряд уникальных особенностей , которые делают его идеальным для выполнения продольных исследований сердца. Во- первых, сердечная трубка дрозофилы составляет ~ 200 мкм ниже дорсальной поверхности, которая обеспечивает удобство для оптического доступа и наблюдения сердца. Кроме того, многие молекулярные механизмы и генетические пути сохраняются между дрозофилы и позвоночных. В ортологи более 75% генов болезней человека были обнаружены у дрозофилы, которые сделали его широко используются в трансгенных исследованиях 11,13. Кроме того, он имеет короткий жизненный цикл и низкие затраты на техническое обслуживание, а также был широко используется в качестве модели образца для исследования биологии развития 14-16.

В предыдущих докладах описаны протоколы для мониторинга дрозофилы сердечной функции , такие , как онartbeat. Тем не менее, процедуры рассечение были необходимы 17,18. Оптическая визуализация обеспечивает эффективный способ для визуализации развития сердца у животных из-за его неинвазивный характер. Различные методы оптических изображений были применены при выполнении сердца исследовании на животных, таких , как двухфотонной микроскопии 19, конфокальной микроскопии 20,21, световой микроскопии листа 22 и оптической когерентной томографии (ОКТ) 16,23-26. Для сравнения, ОКТ способна обеспечить большую глубину изображения в маленьких сердцах животных без использования контрастных веществ, сохраняя при этом высокое разрешение и сверхвысокой скорости обработки изображений, которые являются важными для получения изображений живых животных. Кроме того, низкая стоимость разработки системы ОКТ популяризовал эту технику для оптической визуализации образцов. Октябре был успешно использован для продольного изучения дрозофилы. Использование Октябре, сердечная морфологическое и функциональное отображение было проведено для изучения структуры сердца, функные роли генов, а также механизмы сердечно-сосудистых дефектов у мутантных моделей во время развития сердца. Например, зависимое от возраста снижение функции сердца была подтверждена с понижающей регуляции ангиотензин-превращающего фермента , связанных с (ACER) гена у дрозофилы с ОСТ 27. Фенотипирование кардиомиопатии связанных генов была продемонстрирована в дрозофилы с помощью ОКТ 28-33. Исследования с использованием Октябре также выявили функциональную роль гена Sox5 человека в сердце Drosophila 34. По сравнению с ОКТ, ОСМ использует объектив с более высокой числовой апертурой для обеспечения лучшего поперечное разрешение. В прошлом, дисфункция сердца , вызванное глушителей в ортолог человека циркадный ген dCry / dClock был изучен с помощью системы пользовательских OCM 15,16, а также эффект с высоким содержанием жиров-диеты на кардиомиопатии у дрозофилы , чтобы понять ожирения индуцированного человека заболевания сердца. 15

Здесь йэкспериментальный протокол электронной обобщается для продольного изучения сердечных морфологических и функциональных изменений в дрозофилы на второй возрастной стадии (L2), третьей возрастной стадии (L3), куколки день 1 (PD1), куколки день 2 (PD2), куколки 3 -й день (PD3) , куколки 4 -й день (PD4), куколки день 5 (PD5) и взрослых (рис 1) с использованием OCM для облегчения изучения врожденных сердечных заболеваний человека , связанных с . Сердечные функциональные параметры, такие как HR и CAP количественно анализировали на разных стадиях развития, чтобы выявить сердечные особенности развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223, (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223, (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15, (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37, (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11, (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12, (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91, (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76, (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5, (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178, (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22, (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246, (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22, (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10, (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299, (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41, (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9, (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15, (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2, (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19, (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114, (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8, (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15, (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4, (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6, (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22, (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1, (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3, (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17, (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109, (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132, (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17, (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21, (15), 18021-18033 (2013).
<em>Drosophila</em> Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция <em>In Vivo</em> Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter