Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Drosophila Upprättande och Längs avbildning av hjärtfunktionen In Vivo Använda optisk koherens mikroskopi (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Longitudinell studie av hjärtat i små djur bidrar till att förstå ett flertal humana relaterade kardiovaskulära sjukdomar, såsom gen relaterade medfödda hjärtfel 1,2. Under de senaste decennierna, olika djurmodeller, såsom mus 3,4, Xenopus 5,6, zebrafisk 7,8, avian 9, och Drosophila 10-16, har använts för att genomföra det mänskliga hjärtat utveckling relaterad forskning. Musmodellen har använts i stor utsträckning för att studera normal och onormal hjärt utveckling och hjärtfel fenotyper på grund av dess likheter med människans hjärta 3,4. Xenopus embryon är särskilt användbar i studiet av hjärtutveckling på grund av dess enkel hantering och delvis genomskinlighet 5,6. Öppenheten i embryot och tidig larv av zebrafisk modellen möjliggör enkel optisk observation av hjärt utveckling 7,8. Fågel modellen är en vanlig föremål för utvecklingshjärtstudier because hjärtat kan lätt nås efter avlägsnande av äggskal och morfologiska likheten mellan fågel hjärtan för människor 9. Drosophila modellen har vissa unika egenskaper som gör den idealisk för att utföra longitudinella studier av hjärtat. Först, är hjärtat rör av Drosophila ~ 200 pm under den dorsala ytan, vilket ger bekvämlighet för optisk access och observation av hjärtat. Dessutom är många molekylära mekanismer och genetiska vägar konserverade mellan Drosophila och ryggradsdjur. De ortologer på över 75% av sjukdomsgener mänskliga påträffades i Drosophila, som har gjort det ofta används i transgena studier 11,13. Dessutom har det en kort livscykel och låga underhållskostnader, och har ofta används som ett prov modell för utvecklingsbiologisk forskning 14-16.

Tidigare rapporter beskrev protokoll för övervakning av Drosophila hjärtfunktioner såsom hanArtbeat. Emellertid var dissektion förfaranden krävs 17,18. Optisk avbildning ger ett effektivt sätt att visualisera hjärt utveckling hos djur på grund av dess icke-invasiva natur. Olika optiska avbildningsmetoder har använts för att utföra djur hjärtstudie, såsom två-foton mikroskopi 19, konfokalmikroskopi 20,21, ljus ark mikroskopi 22, och optisk koherens tomografi (OCT) 16,23-26. Jämförelsevis, är oktober kan tillhandahålla stor bilddjupet i små djur hjärtan utan att använda kontrastmedel, samtidigt som en hög upplösning och en ultrahög utskriftshastighet, som är viktiga för att avbilda levande djur. Dessutom har den låga kostnaden för att utveckla ett oktober-system populariserade denna teknik för optisk avbildning av prover. Oktober har framgångsrikt använts för longitudinell studie av Drosophila. Använda oktober, har hjärt morfologiska och funktionella avbildnings utförts för att studera hjärtstrukturer, funktionella roller gener, och mekanismerna för kardiovaskulära defekter i muterade modeller under hjärt utveckling. Till exempel var åldersberoende hjärtfunktion nedgång bekräftas med nedregleras angiotensin converting enzyme relaterade (ACER) gen i Drosophila med 27 oktober. Fenotypning av genen relaterad kardiomyopati visades i Drosophila använder oktober 28-33. Forskning med hjälp av oktober avslöjade också den funktionella rollen av mänsklig SOX5 genen i hjärtat av Drosophila 34. Jämfört med oktober, använder OCM ett mål med en högre numerisk bländare för att ge bättre tvär upplösning. I det förflutna, har hjärtat dysfunktion orsakad av att tysta en ortolog human dygnsrytm gen dCry / dclock studerats med hjälp av en anpassad OCM systemet 15,16, liksom effekten av fettrik-diet på kardiomyopatier i Drosophila att förstå fetma inducerad human hjärtsjukdomar. 15

Här, the försöksprotokoll sammanfattas för longitudinell studie av hjärt morfologiska och funktionella förändringar i Drosophila på andra stadiet (L2), tredje stadiet (L3), puppa dag 1 (PD1), puppa dag 2 (PD2), puppa dag 3 (PD3) , puppa dag 4 (PD4), puppa dag 5 (PD5), och vuxna (figur 1) med hjälp av OCM för att underlätta studier av medfödda hjärtsjukdomar människorelaterade. Hjärt funktionella parametrar, såsom HR och CAP analyserades kvantitativt vid olika utvecklingsstadier för att avslöja de kardiella utvecklingsfunktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Beredning av OCM System för optisk avbildning av Drosophila 16

  1. Välj en spektrometer och en höghastighetslinje scan kamera som ger en bildfrekvens på åtminstone 80 ram / sekund så att OCM systemet kommer att kunna lösa hjärtslag Drosophila.
  2. Använda en bredbandig ljuskälla för att säkerställa den axiella upplösning på 2 | j, m för att identifiera hjärtstrukturen i Drosophila.
  3. Använd en 10X mål att uppnå en hög tvär upplösning.
  4. Använd en 45 ° stång spegel för att reflektera referensarmen ljusstråle och för att generera en ringformig provarm ljusstråle för att utöka skärpedjupet i proverna.
  5. Utveckla en anpassad datorprogram för att styra OCM systemet och utföra mätningar.

2. Drosophila Kultur

  1. Standard Fly Food Preparation
    1. Sätt ~ 5 ml omedelbar Drosophila formel i en ampull polystyrenröret med hjälp av en pappersränna.
    2. Häll ~ 8 ml vatten i formeln för att ordentligt mätta maten.
    3. Lägg till olika tillägg till standard flyga mat för olika experiment. När man förbereder för all-trans -retinal (ATR) mat för optogenetic stimulerings experiment 35, använd en pipett för att extrahera 100 mM ATR och upplösas i ~ 8 ml vatten för att få ATR koncentration av 1 mM i livsmedel. Efter blandning av lösningen jämnt, häll lösningen i formeln och rör om ordentligt.
    4. För att framställa en fettrik-diet för att studera fetma hjärt dysfunktioner i Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formel med 15 ml vatten i en kopp och värme under 30 sekunder i en mikrovågsugn. Sätt lite ekologisk extra virgin kokosolja i en kopp och värm under 90 sekunder i mikrovågsugnen.
    5. Extrahera 7,5 ml kokosnötolja och blanda med det färdiga formeln tillräckligt för att göra vikt / volymförhållande på kokosolja till mat ~ 30/100, och then extrakt ~ 2 ml blandade mat och lägga den på botten av ett rör.
    6. Vänta på en min tills mediet noggrant mättad. Kompaktera maten försiktigt med en plan yta för att optimera livsbetingelserna för Drosophila. Tillsätt 6 - 8 korn jäst till det beredda formel, och anslut röret med ett kluster av bomull.
  2. Bananfluga Kors och kultur
    1. Ta ett rör med beredd standard flyga mat och ta bort den pluggade bomull. Försiktigt överföra de vuxna flugor (manliga och kvinnliga) till röret, och anslut röret med bomull omedelbart. Kontrollera bomull för att se till att det inte finns något mellanrum mellan bomull och rörväggen för att hindra flugor från att fly från röret.
    2. Hålla fruktflugor i inkubator vid 25 ° C under tvär avel. De flesta av de gener som är aktiva och de cellulära proteiner syntetiseras vid 25 ° C 36 till 39.
    3. Ta röret ut från inkubatorn efter åtta handen överföringen enDult flyger ut ur röret för att få äggen vid samma ålder för experimentell kontroll.
    4. Fortsätta odla de ägg i inkubator vid 25 ° C, som är den standard temperatur under Drosophila utveckling med perioden för 8,5 dagar 40,41 utveckling.
      OBS: Temperatur påverkar utvecklingsperiod (ägg till vuxen) och expressionsnivån av olika gener.

3. Utföra optisk avbildning med OCM

  1. Mount Fly Larva för optisk avbildning
    OBS: Ägget av Drosophila luckor i 22 - 24 h vid 25 ° C till den första instar larven (L1). Den andra stadiet larv framträder efter ytterligare 24 timmar. Den största larver formen är den tredje stadiet larv, som molts efter ca 24 timmar. Strukturella egenskaper i larven kan användas för att särskilja deras olika utvecklingsstadier. Storleken av mouthparts mellan den första instar och den andra instar är annorlunda. Munnenhakar i den första instar larven är mycket små och ser ut som två par av små svarta prickar, medan munnen krokar i den andra instar larven är större och strukturen är tydligare. Spiracles används vanligen för att identifiera den andra stadiet och det tredje stadiet. Den andra stadiet larv har klubbats främre spiracles, medan för tredje stadiet, är de främre spiracles grenade. En mörkorange ring kommer att börja visas på spetsen av de posteriora spiracles i tredje stadiet larv.
    1. Fäst en bit dubbelsidig tejp till en ren mikroskopglas. Utvisa luftbubblor under bandet för att undvika reflexer från luftbubblor under avbildning.
    2. Ta ett av rören med de odlade flyger ut från inkubatorn vid larvstadiet.
    3. Identifiera larven i media, ta bort den från media med en mjuk borste och placera på en ren vävnad. Ta bort någon mat fastnat larven med en våt mjuk borste och torka den på vävnaden.
    4. Flytta cleaned flyga till en vävnad under objektivet av ett brett fält mikroskop.
    5. Justera fokus mikroskop för att hitta en tydlig bild av flugan. Identifiera rätt utvecklingsstadium larven av dess strukturella egenskaper med mikroskopet.
    6. Placera i farten med hjälp av mjuk borste. Säkerställa kroppen är rak med den dorsala sidan vänd uppåt för att förbereda sig för montering på objektglaset genom att ryggsidan. Utför detta steg under mikroskop.
    7. Se till att larven är helt torrt innan montering på bandet. Annars kommer larven fäster inte till bandet.
    8. Stick ryggsidan av den placerad flyga till dubbelsidiga tejpen på glasskiva med måttligt tryck. Notera att för mycket tryck kan döda flugan och för lite kraft kommer att leda till flyga rörelse under avbildning.
  2. Optisk avbildning av Drosophila på larvstadier (L2 och L3) med OCM
    OBS: En bred lumen av hjärtat röret kan vara found ligger i segmenten mellan A5 till A8 på larvstadierna (Figur 1). De tvärgående OCM M-mode bilder (2D + tid) förvärvades i A7 segment av hjärtröret för varje larv för att underlätta det systoliska och diastoliska analys.
    1. Placera den monterade larven på den justerbara prov skede av OCM system längs y-tvärriktningen med ryggsidan vänd uppåt nedanför objektivlinsen. Ett litet hål i provstadiet är nödvändig för att placera larven att undvika dess kontakt med scenen planet.
    2. Justera urvalet steget för att flytta hjärtat röret hos bananfluga till fokalplanet av avbildningstrålen. Att enkelt hitta den A7-segmentet, hitta den bakre regionen av hjärtat röret med den realtid tvärsnitts OCM bilder i bilden förvärvet programvara. Flytta sedan scenen framåt tills A7 segmentet är synlig.
    3. Ställ in parametrarna för bilden förvärvet programvara för att 100 A-scanningar per B-scan (ram), 100 B-skanningar, och scanner spänning för att täcka ~ 0,28 mm i X-tvärriktningen, och 0 V i y-tvärriktningen. Klicka på "start" -knappen i programvaran för att inhämta de uppgifter som bakgrundsljud för bakgrund subtraktion genom att blockera prov strålgången med en mörk duk.
      OBS: tre av de 100 ramarna kan användas för bakgrunden subtraktion.
    4. Ställ in parametrarna för datainsamling programvara till 128 A-scanningar per B-scan, 4096 B-skanningar, och scannern spänning för att täcka ~ 0,28 mm x-tvärriktningen, och 0 V i y-tvärriktningen. Klicka på "start" -knappen i programvaran för att förvärva de tvärgående M-mode bilder över A7 segment av flugan hjärtröret över ett område som omfattar 0,28 x 0,57 mm 2 för ca 30 sek.
    5. Blockera bildtrålen med hjälp av en mörk duk under datasparprocessen för att undvika långvarig exponering av flugan hjärta till bild ljus.
    6. Upprepa mätningen för 5 gånger för att få tillförlitlig mätning av hjärt kulction.
    7. Ställ in parametrarna för bilden förvärvet programvara för att 400 A-scanningar per B-scan, 800 B-skanningar, och scannern spänning för att täcka ~ 1,7 mm x-tvärriktningen, och ~ 4 mm i y-tvärriktningen. Flytta det stadium i båda riktningar för att säkerställa hela fruktflugan kan avbildas. Klicka på "start" -knappen i programvaran för att förvärva en datamängd för att få bilder av bananflugan i 3 dimensioner. Obs: 3D flyga struktur kan göras med hjälp av Amira 3D-program
    8. Använd en våt mjuk borste för att fukta den uppmätta farten och försiktigt ta bort den från objektglas. Flytta den till ett separat rör för kontinuerlig utveckling. Märk röret för longitudinella studien genom de följande utvecklingsstadier.
  3. Image Drosophila vid PUPP Stages
    OBS: Alla fruktflugor togs ut för avbildning från PD1 till PD5. Såsom visas i larven schematisk i figur 1b, förblir en bred lumen i A5 till A8 segment av the hjärta röret tills PD1. Från PD2, startar en konisk kammare för att utveckla mellan A1 till A4 segment. Att förvärva jämn bildkvalitet och underlätta hjärtanalys, var tvär M-mode bilder som erhållits från A7 segmentet vid PD1 och från A1 segmentet efter PD2, som markerat i figur 1b.
    1. Image Drosophila vid PD1
      OBS: Drosophila kommer att ha en vit puparium under en kort tidsfönster (0 - 1 h) under PD1. Detta tidsfönster är idealisk för att utföra optisk avbildning av tidig puppa eftersom hög transparens leder till högre ljuspenetrering för OCM avbildning.
      1. Eftersom fruktflugor finns på rörväggen när de blir puppa bort puppa från enskilda rör för avbildning vid PD1 med en våt mjuk borste och rengör puppa med borsten om det finns mat som fastnat i kroppen.
      2. Montera bananfluga på en liten glasskiva direkt med våt pensel och hålla ryggsidan uppåt (Figur 1a
      3. Avlägsna överflödigt vatten från sidan av flugan kroppen.
      4. Sätt glasskiva på provet skede av OCM systemet hålla bananflugan på toppen. Hitta tydlig realtidsbild av A7 segment av flugan hjärta utnyttja samma strategi som beskrivs i larven mätningen.
      5. Ställ in samma parametrar för datainsamling programvara som i avsnitt 3.2, och bildhjärtslagen på A7 segmentet att förvärva tvär M-mode och 3D-bilder.
      6. Efter bildbehandling, använd en pincett för att placera glasskiva med puppa tillbaka in i röret för kontinuerlig odling.
    2. Image Drosophila vid PD2 till pD5 Stages
      OBS: Eftersom provet blir mer och mer opak under PUPP stadierna kommer inträngningsdjupet hos avbildningssystemet reduceras.
      1. Använd en pincett för att försiktigt ta bort glaset sLiDE monterad med flugan på PD2 från röret för avbildning. På PD2 blir provet skal gulaktig och kroppen blir mindre transparent än PD1 (Figur 1).
      2. Sätt bilden på provstadiet av OCM systemet.
      3. Justera urvalet steget för att flytta flugan i fokalplanet för avbildning stråle av OCM-systemet. Hitta den främre änden av hjärtat rör med realtidstvärsnitts OCM bild. Flytta ~ 50 pm tillbaka i den bakre riktningen för att hitta A1 segment av hjärtröret.
        OBS: Vid denna punkt av hjärt utveckling (PD2), kommer den koniska kammaren vara mycket liten och kan inte slå.
      4. Samla tvär M-mode dataset från A1 segmentet samt 3D-data med hjälp av samma metod som tidigare utvecklingsstadier.
      5. Sätt bilden tillbaka till röret försiktigt för kontinuerlig odling.
        OBS: På PD3, är färgen på provet i skalet mörkare än i PD2 skede. På PD4 skede svarta ränder can observeras inuti skalet av proverna. Vissa flugor kommer att utvecklas till vuxna från detta steg i följande dag, medan andra kommer att utvecklas till PD5. På PD5 skede svarta ränder är ännu mer uppenbart ses i fruktflugor. Dessa flugor blir vuxna i följande dag.
  4. Bild Drosophila vid vuxen Stage
    OBS: I sitt vuxna stadium, kan kvinnliga och manliga flugor särskiljas genom storleken av kroppen och färgen på den nedre delen av magen. Kvinnliga vuxna har större storlek, medan män är mindre och mörkfärgad i nedre delen av magen.
    1. Ta röret ut från inkubatorn när bananfluga utvecklas till en vuxen, och överföra den vuxna flyga till en ~ 45 ml tomma flaskan.
    2. Doppa absorberande ände (~ 1 cm längd, ~ 3 mm i diameter) av en stav i anestesi, sätta staven i flaskan, och anslut röret med ett kluster av bomull för att hålla bedövningsmedel änden nedanför ansluten bomull och anesthetize flugan i 3 min. Varaktigheten av anestesi beror på storleken på flugan, och kan variera mellan 2,5 till 3,5 minuter (till exempel: man under 2,5 min, hona för tre eller 3,5 min).
    3. Förbereda en glasskiva med en bit dubbelsidig tejp.
    4. Flytta sövda flyga på glasskiva med ryggsidan uppåt med hjälp av mjuk borste.
    5. Separera vingarna med hjälp av en pincett och hålla fast vingarna på bandet under ett mikroskop för att fixera farten och exponera hjärtat regionen för avbildning.
    6. Bild flugan från A1 segment av flugan hjärta (Figur 1). Vid slutet av experimentet, kan farten offras.

4. bildanalys 16

  1. Utveckla Matlab program för att konvertera 2D och 3D binära filer som samlats med bilden förvärvet programvara för bildfiler.
  2. Använd ImageJ att identifiera hjärtröret region i tvär M-mode bilder och en trollstav algoritm för att createa mask av hjärtregionen för varje tvärgående M-mode bild. Segment den maskerade regionen och använda en topp-finding algoritm för att identifiera systoliskt och diastoliskt platser. Beräkna ändras tidsberoende hjärta diameter från de tvärgående M-mode bilder.
  3. Baserat på de förvärvade tidsberoende hjärt diametrar beräkna hjärt parametrar såsom HR, hjärtaktivitetsperiod (CAP), slutdiastole diameter (EDD), slut systole diameter (ESD), slutdiastole område (EDA) och avsluta systole område ( ESA). Beräkna bråk förkortning (FS) med ekvation 1
  4. Använd ImageJ att analysera 3D OCM bilderna för att visualisera den strukturella utvecklingen av flugan hjärta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den längsgående hjärt avbildning utfördes med hjälp av bananflugor med 24B-GAL4 / + stam vid rumstemperatur med OCM. Mätningarna utfördes vid L2, L3, och vid 8 h intervall från PD1 till PD4, och vuxen dag 1 (AD1) för att spåra den metamorfos processen (tabell 1). Larv, tidig puppa, sen puppa och vuxna flugor monterades på objektglas som ses i Figur 1A. Segmentet funktioner i hjärta för larver och vuxna flugor visades i de schematiska representationerna i figur 1B.

I denna utvecklings studie 4096 ramar förvärvades 32 sekunder med våra egna OCM system för att spåra hjärtslag av en fruktflugor. För att förbättra mätnoggrannhet, var fem upprepade mätningar för varje prov vid varje utvecklingsstadium. 3D-data kan också erhållas för att observera de hjärtstrukturen förändras under metamorfos.

Tvär M-mode och 3D-bilder var c reated med egna Matlab program och ImageJ. En ansiktsbilder och axiella sektioner konstruerades också från de förvärvade data visualisera remodeling processen för hjärtat under Drosophila metamorfos (Figur 2). För att kvantifiera hjärtfunktionen av fruktflugor, var hjärtregionen automatiskt segmenterade med en anpassad Matlab program från alla 4096 ramar. Flugan hjärtfrekvens (HR) kan kvantifieras från tvär M-mode OCM bilder (figur 3a). Under PUPP stadier slutar Drosophila hjärtat slår ibland 16. Vi införde en ny hjärt funktionell parameter, hjärtaktivitetsperiod (CAP) för att kvantifiera förhållandet mellan perioden med ett hjärtslag till den totala avbildningstiden (figur 3b). EDD, ESD, EDA, har ESA och FS används också för att kvantifiera hjärtkammaren förändringar i både axiella och tvärgående dimensionerna under Drosophila utveckling. 16

innehåll "> På larvstadier börjar hjärtröret på den bakre buken A8 med en bredare lumen (A5 - A8 i figur 1B) och slutar vid den främre ryggsegmentet A1 med en mindre diameter (T3 / A1 - A5 i figur 1B ). den hjärtkammaren var belägen medialt och dorsalt och blev större under L2 (figur 2 a, b) och L3 (Figur 2 c, d). När du har angett PD1, hjärtat röret observerades löper axiellt över toppen av en rörlig luft bubbla (Figur 2 e, f) Omkring 10 -. 13 timmar senare, bubblan försvann efter puparium bildning och de breda lumen blev vrängs Eftersom den främre hjärtröret ventralt placerad, hela hjärtat röret var osynlig utom den bakre regionen i. . OCM bilder ~ 12 timmar efter puparium bildning Senare under PD2, hjärtkammaren gradvis i linje längs ryggens buken, och den bakre delen (A6 - A8) av hjärtat eliminerades (Figur 2 g, h) 42,43. En konisk kammare började utveckla ~ A1 - A4 segmentet under PD2 och växte i storlek tills vuxna stadiet (figur 2 i - m).

Förutom att observera strukturella förändringar, har många funktionella förändringar hittades såväl under hjärt ombyggnad. M-mode bilder som visas i Figur 3 visar att hjärtslag avtog markant från larvstadiet till puppstadium, och sedan ökade kraftigt från puppa till vuxen. Betydande HR förändringar observerades under livscykeln (Figur 4a). Dessutom var hjärtaktivitetsperiod (CAP) analyserades för samtliga prover mätt från L2 till AD1 (figur 4b). Såsom visas i fig 4, håller HR vid ~ 277 slag per minut (bpm) för L2 och L3. När man kommer in tidigt PUPP stadierna finns en markant minskning av HR och CAP. HR är reducerad till 86 ± 11 bpm i början av PD1, och fortsätter att minska till 26 ± 8 bpm av end av PD1 slutligen kommer till ett fullständigt stopp i början av PD2. En intressant upptäckt är den förlängda perioden av hjärt inaktivitet observeras runt PD2 stadium (~ 24 h - 48 h efter puparium bildning), kallad hjärtutvecklings diastalsis 16. Vid slutet av PD2, återupptar långsamt intermittent beating (HR 17 bpm ± 6 med CAP 5 ± 2). Hela PD3 och PD4, HR och CAP ökar tills den når 392 ± 32 bpm och 95 ± 3% vid den första dagen av den vuxna stadiet (5 dagar efter början puppstadium).

Figur 1
Figur 1. Montering av Drosophila vid olika stadier och schematisk bild av hjärta metamorfos. (a) Montering av larver, puppa och vuxen WT (24B-GAL4 / +) flyger på objektglas. (b) Schematisk bild av hjärt metamorfos. Röda pilar på larv och vuxna schematic betecknar OCM M-mode imaging platser tills PD1 24 timmar och för efterföljande tidpunkter, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Drosophila Heart morfologiska förändringar. En face och axiella tvärsnitts OCM bilder av en WT Drosophila erhållits vid (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 och (k, m) vuxen stadier. M-mode bilder av Drosophila hjärtat erhölls från A7 segmentet tills PD1 och från A1 segmentet för senare skeden. Skal barer i en face och axiella sektionsbilder anger 200 um och 500 um, respectively. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Drosophila Heart funktionella förändringar. (a) M-mode bilder i olika utvecklingsstadier visar HR förändringar över livscykeln. (b) Exempel som visar hjärtaktivitet perioden (CAP) beräkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Kvantitativ analys av Funktionell Cardiac Parametersi WT Flugor på olika utvecklingsstadier, inklusive L2, L3, pupal steg vid 8 timmars intervall, och AD1. (a) HR. (b) CAP. Felet fältet i varje grupp representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

utvecklingsstadiet
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 tim 16 h 24 tim 32 tim 40 tim 48 h 56 tim 64 h 72 tim 80 tim 88 tim
provnumret 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

Tabell 1. Antal WT fruktflugor mättes vid olika utvecklingsstadier i Cardiac utvecklingsstudie.

video 1
Video 1. Spårning av hjärtslag Längs tidsdimensionen och Motsvarande hjärta kammardiameter Förändring längs Z-riktningen (axiell riktning) i en WT flyga på L2. Hjärtat slog relativt snabbt i en jämn takt. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.) p>

video 2
Video 2. Spårning av hjärtslag längs tidsdimensionen och Motsvarande hjärta kammardiameter Förändring längs Z-riktningen (axiell riktning) i en WT flyga på PD1. HR börjat minska. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

video 3
Video 3. Spårning av hjärtslag längs tidsdimensionen och Motsvarande hjärta kammardiameter Förändring längs Z-riktningen (axiell riktning) i en WT flyga på PD2. Hjärtat slutade slå fullständigt under tiden. Svängning plottas z-diameter berodde på avbildnings buller. target = "_ blank"> Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

video 4
Video 4. Spårning av hjärtslag längs tidsdimensionen och Motsvarande hjärta kammardiameter Förändring längs Z-riktningen (axiell riktning) i en WT flyga på PD4. Efter PD2, HR och CAP började öka. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

video 5
Video 5. Spårning av hjärtslag längs tidsdimensionen och Motsvarande hjärta kammardiameter Förändring längs Z-riktningen (axiell riktning) i en WT flyga på AD1. HR var den högsta bland alla stadier och CAP var nästan 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

video 6
Video 6. 3D struktur rendering av en larv fluga. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den snabba hjärtslag Drosophila, med en maximal HR runt 400 bpm på larv och vuxenstadier, kräver hög utskriftshastighet för att lösa hjärt diastoler och systoler (inte mindre än 80 bilder / sek baserad på erfarenheter). Grund av den lilla hjärtkammaren storlek och mikron skala hjärtväggtjocklek (5-10 ^ m), en hög rumslig upplösning (bättre än 2 ^ m) krävs för att lösa hjärt rörstrukturer. I denna studie var en hög upplösning och ultrahög hastighet OCM system utvecklat, där en spektrometer med 600 linjer / mm överföring galler och en 2048 pixel linjeavsökningskamera användes. En A-svephastighet av 20 kHz tillhandahålls av linjeavsökningskameran. Bildrutehastighet 128 bilder / sek är tillräckligt snabb för att fånga Drosophila hjärtslag i flera utvecklingsstadier, inklusive L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, och vuxen. Ljuskällan var en bred bandbredd supercontinuum ljuskälla med en central våglängd och bandbredd av ~ 800 nm och ~220 nm respektive och erhålles en axiell upplösning på ~ 1,3 | im i vävnad. En 10X objektiv användes i provet arm för att realisera en tvärgående upplösning av ~ 3,9 um. Eftersom hjärtat rör av Drosophila är cirka 200 pm under den dorsala ytan, krävs ett avbildnings djup av hundratals mikron meter. En 45 ° stång spegel kan användas för att generera en ringformig provstråle och förlänga fokuseringsdjupet i provet 44. Känsligheten och 3 dB roll off bestämdes att vara 96 ​​dB och 600 | j, m, respektive med provarmen kraften i ~ 9 mW. En anpassad datorprogram användes för att styra OCM systemet och utföra mätningarna. Hjärt strukturella bilder och funktionella parametrar som erhållits visar möjligheten att använda OCM att kvantitativt karakterisera hjärtat morfologi och funktion av Drosophila under hela dess livscykel.

För närvarande är flera andra tekniker också användas för att avbilda en litendjurets hjärta struktur eller funktion, såsom datortomografi (CT), magnetisk resonanstomografi (MRT) och ultraljud. OCM ger högre rumsliga och tidsmässiga upplösningar än dessa tekniker, vilket möjliggör visualisering av fina strukturer och snabba dynamik i djur hjärtan. Konfokalmikroskopi är ett annat mycket använt bildteknik, men dess låga avbildning penetration och rekvisition av avbildnings kontrastmedel begränsa dess tillämpningar i levande djur. Jämförelsevis gör OCM höghastighetståg och etikett fritt avbildning för att visualisera snabba hjärt dynamik icke-invasivt i små djur. Det finns dock fortfarande begränsningar OCM. Till exempel är den bilddjupet som tillhandahålls av OCM begränsas av ljusspridning från flera hundra mikron till ca 1 mm i vävnad medan ultraljud har penetrationsdjup på upp till 10 cm. Jämfört med konfokalmikroskopi har OCM en högre hastighet och bättre bilddjupet, men med lägre upplösning och dålig molekylär kontrast. Dessutom är vårt nuvarande OCM systemet based på spektral domän detekteringssystem. Högre utskriftshastighet baserad på svepte-source OCM 45 kan ge mer distinkta bilder av snabba dynamik som hjärtslag.

För att utföra longitudinell studie av hjärtslag i Drosophila med OCM, det finns flera viktiga steg i protokollet. Flugorna måste hanteras mycket försiktigt i alla stadier av experimentet. Hantera larv bör vara särskilt försiktig eftersom det är lätt att skada larven, vilket kan påverka hjärt struktur och funktion i följande utvecklingsstadier. Flugorna måste placeras på täckglaset och bildstadiet mycket exakt. Dåligt placerade flugor kommer att göra det svårt att få högkvalitativa bilder och kan orsaka skeva strukturella och funktionella hjärtparametervärden. Dessutom flyger överföra vuxen från ett rör till ett annat och ansluta bomullstuss bör vara mycket snabb för att förhindra deras flykt från röret.

Olika studierDrosophila hjärta utveckling kan utföras genom att modifiera protokollet. Den temperatur vid vilken flugorna odlas kan ökas eller minskas från 25 ° C för att förändra hjärt genuttrycksnivån och ändra flugan utvecklingsperiod. Genom att lägga till några ingredienser såsom kokosnötolja eller ATR till vanliga livsmedel, kan hjärtat utvecklingen ändras. Specifika studier kan utföras i vildtyp eller transgena flugor. När man studerar bananfluga hjärtutveckling i längdled, kan olika tidsintervall användas för att utföra mätningarna OCM, till exempel, kan en 8 h intervall användas under de PUPP etapper. Med tanke på det begränsade känsligheten hos våra OCM system är en mycket enhetlig modbrus finns i tvär M-mode bilder, vilket kan göra det svårt att korrekt identifiera hjärtsammandragningssignaler med Matlab program och minska effektiviteten av dataanalys. Känsligheten kan ökas genom att förbättra inriktningen av OCM-systemet. Optimerade filtreringsalgoritmerrekommenderas att avlägsna en del av fläckarna.

Den beskrivna protokollet har använts för att studera tystnad mänskliga dygnsrytm ortologer, dCry och dclock inducerade hjärtfel i Drosophila. Minskade HRs observerades vid olika utvecklingsstadier, inklusive larv, puppa och vuxen 15,16. Rollen av dygns gener i hjärtat utveckling avslöjades, vilket kan förklara sambandet mellan kardiovaskulära sjukdomar och dygnsrytm relaterade aktivitetsmönster. Fettrik-diet (HFD) inducerade hjärtsjukdomar studerades också genom att analysera hjärt funktionella förändringar av fruktflugor som utfodrats med HFD 15. Dessa studier visade inte bara Drosophila som ett kraftfullt verktyg i utvecklingsstudie av hjärt struktur och funktion, men också betydelsen av hjärt longitudinell studie förstå medfödda och postnatal mänskliga sjukdomar. OCM-plattformen gör det möjligt för ett brett spektrum av framtida studier in gen relaterade mänskliga hjärtsjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223, (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223, (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15, (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37, (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11, (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12, (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91, (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76, (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5, (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178, (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22, (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246, (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22, (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10, (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299, (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41, (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9, (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15, (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2, (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19, (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114, (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8, (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15, (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4, (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6, (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22, (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1, (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3, (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17, (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109, (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132, (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17, (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21, (15), 18021-18033 (2013).
<em>Drosophila</em> Upprättande och Längs avbildning av hjärtfunktionen <em>In Vivo</em> Använda optisk koherens mikroskopi (OCM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter