Introduction
Küçük hayvanlarda kalp uzunlamasına bir çalışma gibi gen ile ilgili konjenital kalp defektleri 1,2 gibi insan ilgili kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli anlamak için katkıda bulunur. Geçmiş yıllarda, fare, 3,4, Xenopus 5,6 zebra balığı 7,8, kuş 9 ve Drosophila 10-16 gibi çeşitli hayvan modellerinde,, araştırma ile ilgili, insan kalp geliştirme çalışmaları için kullanılmıştır. Fare modeli yaygın normal ve anormal kalp gelişimi ve insan kalbi 3,4 ile benzerlikler nedeniyle kalp kusur fenotipleri incelemek için kullanılır olmuştur. Xenopus embriyo nedeniyle kolay kullanım ve kısmi şeffaflık 5,6 kalp gelişimi çalışmada özellikle yararlıdır. Embriyo ve zebra balığı model erken larva şeffaflık kalp gelişimi 7,8 kolay optik gözlem için izin verir. kuş modeli gelişimsel kalp çalışmalarının ortak bir konudur because Kalp kolayca yumurta kabuklarını ve insanlarda 9 kuş kalplerin morfolojik benzerliği çıkardıktan sonra ulaşılabilir. Drosophila modeli kalbin uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale bazı benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, Drosophila kalp tüpü kalbin optik erişim ve gözlem için kolaylık sağlar dorsal yüzeyinin altında ~ 200 mikron vardır. Ayrıca, birçok moleküler mekanizmaları ve genetik yollar Drosophila ve omurgalılar arasında muhafaza edilir. İnsan hastalık genlerinin 75 üzerinde% ortologlar yaygın transgenik çalışmalarda 11,13 kullanılan yapmış Drosophila, bulundu. Ayrıca, kısa bir ömrü ve düşük bakım maliyetleri vardır ve yaygın gelişimsel biyoloji araştırma 14-16 bir örnek model olarak kullanılmıştır.
Önceki raporlar o gibi Drosophila kalp fonksiyonlarını izlenmesi için protokol tarifArtbeat. Bununla birlikte, diseksiyon işlemleri 17,18 gerekmiştir. Optik görüntü nedeniyle non-invaziv doğası hayvanlarda kalp gelişimini görselleştirmek için etkili bir yol sağlar. Farklı optik görüntüleme yöntemleri gibi iki foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, hafif levha mikroskobu 22, ve optik koherens tomografi (OCT) 16,23-26 olarak, performans hayvan kalp çalışmada uygulanmıştır. Nispeten, Ekim görüntüleme canlı hayvanlar için önemli olan yüksek çözünürlük ve Ultrahigh görüntüleme hızı, tutarken, kontrast maddeleri kullanmadan küçük hayvan kalplerinde büyük bir görüntüleme derinliğini sağlama yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bir Ekim sistemini geliştirme düşük maliyetli örneklerinin optik görüntüleme için bu tekniği yaygınlaştırmıştır. Ekim başarıyla Drosophila boyuna çalışma için kullanılır olmuştur. Ekim, kalp morfolojik ve fonksiyonel görüntüleme kalp yapıları incelemek için yapılmıştır kullanma, işlevtional genlerin rolleri ve kalp gelişimi sırasında mutant modellerde kardiyovasküler kusurların mekanizmaları. Örneğin, yaşa bağlı kardiyak fonksiyon düşüş OCT 27 Drosophila aşağı-regüle anjiotensin dönüştürücü enzim ilgili (ACER) geni ile teyit edilmiştir. Gen ile ilgili kardiyomiyopati fenotiplendirme OCT 28-33 kullanılarak Drosophila gösterilmiştir. Araştırma kullanarak Ekim de Drosophila 34 kalbinde insan SOX5 geninin fonksiyonel rolünü ortaya koymuştur. OCT ile karşılaştırıldığında, OCM daha enine çözünürlük sağlamak için daha yüksek bir sayısal diyafram ile objektif kullanır. Geçmişte, bir ortologu insan sirkadiyen geni dCry / dClock susturma kaynaklanan kalp fonksiyon bozukluğu, obezite kaynaklı insan anlamak için özel bir OCM sistemi 15,16 yanı sıra Drosophila kardiyomiyopatilerde yüksek yağlı-diyetin etkisini kullanarak çalışılmıştır kalp hastalıkları. 15
Burada, inciE deneysel protokol ikinci dönem (L2), üçüncü instar (L3), pupa gün 1 (PD1), pupa günde 2 (PD2), pupa gün 3 de Drosophila kalp morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere boyuna çalışma için (PD3) özetlenmiştir , pupa gün 4 insan kaynaklı doğumsal kalp hastalıklarının çalışma kolaylaştırmak için OCM kullanarak (PD4), pupa gün 5 (PD5) ve yetişkin (Şekil 1). İK ve CAP olarak kardiyak fonksiyonel parametreler, kantitatif kalp gelişim özellikleri ortaya çıkarmak için farklı gelişim aşamalarında analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Drosophila 16 optik görüntüleme OCM Sistemi 1. Hazırlık
- Bir spektrometre ve OCM sistemi Drosophila kalp atışı çözmek mümkün olacak, böylece en az 80 kare / sn kare hızı sağlayan yüksek hızlı hat tarama kamerayı seçin.
- Drosophila kalp yapısını belirlemek için 2 um eksenel çözünürlük sağlamak için geniş bant ışık kaynağı kullanın.
- Bir yüksek enine çözünürlük elde etmek için bir 10X objektif kullanarak.
- Referans kol ışık ışınını yansıtacak ve örneklerde odak derinliği genişletmek için dairesel bir örnek kol ışık ışınını üretmek için 45 ° çubuk ayna kullanın.
- OCM sistemini kontrol ve ölçümleri gerçekleştirmek için özel bir bilgisayar programı geliştirmek.
2. Drosophila Kültür
- Standart Fly Gıda Hazırlama
- Polistiren şişenin içine ~ 5 ml anlık Drosophila formülü koymakBir kağıt oluk yardımı ile tüp.
- düzgün yemek doyurmak için formüle ~ 8 ml su dökün.
- Farklı deneyler için standart sinek gıda farklı takviyeleri ekleyin. Deney 35 ilerleme hızı optogenetic için all trans -retinal (ATR) yemek için hazırlanırken, 100 mM ATR ayıklamak ve gıda 1 mM ATR konsantrasyonunu elde etmek için mi 8 ~ içine su eritmek için bir pipet kullanın. homojen çözelti karıştırıldıktan sonra, formül içine dökün ve yeterince karıştırın.
- Bir mikrodalga fırında 30 saniye boyunca bir kabı ve ısı 15 mi su ile ~ 10,15 karışımı Drosophila obezite ile ilişkili kalp bozuklukları incelemek için 10 mi formül yüksek yağ diyet hazırlamak. Başka bir fincan bazı organik sızma hindistan cevizi yağı koyun ve mikrodalga fırında 90 saniye boyunca ısıtın.
- yeterince gıda ~ 30/100 ve th Hindistan cevizi yağı ağırlık / hacim oranı yapmak için 7.5 ml hindistan cevizi yağı Özü ve hazırlanan formülü ile karıştırınve gıda karışık özü ~ 2 ml tr tüpün dibine koydu.
- orta iyice doyana kadar 1 dakika bekleyin. Drosophila yaşam koşullarını optimize etmek için düz bir yüzeye dikkatlice gıda kompakt. Hazırlanan formül maya 8 taneleri ve pamuk küme ile tüp fiş - 6 ekleyin.
- Meyve Sineği Haçlar ve Kültür
- Hazırlanan standart sinek gıda ile tüp almak ve takılı pamuk çıkarın. Dikkatle tüp (erkek ve dişi) yetişkin uçar aktarmak ve hemen pamuk ile tüp takın. pamuk ve tüpten kaçan sinek önlemek için tüp duvar arasında boşluk olmadığından emin olmak için pamuk kontrol edin.
- çapraz üreme için 25 ° C'de inkübatör meyve sinekleri tutun. Genlerin en aktif ve hücresel proteinler 25 ° C 36-39 sentezlenirler.
- 8 el transferi bir süre sonra inkübatör tüpü dışarı atınDult deneysel kontrol için benzer yaşta yumurta elde etmek için tüp dışarı uçar.
- 8,5 gün 40,41 geliştirme dönemi ile Drosophila gelişimi için standart sıcaklık 25 ° C, kuvöz yumurta kültüre devam edin.
Not: Sıcaklık gelişim sürecini (yetişkin yumurta) ve çeşitli genlerin ekspresyon seviyesini etkiler.
3. OCM Optik Görüntüleme Sahne
- Optik Görüntüleme Mount Fly Larva
Not: 22, Drosophila kapakları yumurta - birinci instar larvası (L1) için 25 ° C'de 24 saat süredir. İkinci evre larva başka 24 saat sonra ortaya çıkar. en büyük larva formu yaklaşık 24 saat sonra molts Üçüncü dönem larva, olduğunu. larva Yapısal özellikler onların farklı gelişim aşamalarını ayırt etmek için kullanılabilir. İlk instar ve ikinci dönem arasındaki ağızlarının boyutu farklıdır. Ağızİlk evre larva kancalar çok küçük ve ikinci evre larva ağız kanca daha büyüktür ve yapı net iken, küçük siyah noktalar iki çift gibi görünüyorlar. spiracles genellikle ikinci instar ve üçüncü instar tanımlamak için kullanılır. Üçüncü instar için, ön spiracles dallı ederken, ikinci evre larva, ön spiracles clubbed etti. Bir koyu turuncu halka Üçüncü dönem larva posterior spiracles ucunda görünmeye başlayacaktır.- Temiz bir mikroskop cam slayt çift taraflı bant bir parça uygulayın. görüntüleme sırasında hava kabarcıklarının neden yansımaları önlemek için bant altında hava kabarcıkları sınırdışı.
- larva aşamasında inkübatör dışarı kültürlü sinekler tüplerin birini almak.
- , Medyada larva tespit temiz bir doku üzerine yumuşak bir fırça ve yer ile medya çıkarın. ıslak, yumuşak bir fırça ile larva yapışmış herhangi bir yiyecek çıkarıp doku üzerinde kurutun.
- cleane taşıGeniş alan mikroskobu objektif mercek altında bir dokuya sinek d.
- sinek net bir görüş bulmak için mikroskop odağı ayarlayın. mikroskopla yapısal özellikleri ile larva sağ gelişim aşamasını belirlemek.
- yumuşak bir fırça kullanarak sinek yerleştirin. Vücut düz sırt yan cam slayt monte hazırlanmak için yukarı bakacak şekilde dorsal yüzü olduğundan emin olun. Mikroskop altında bu adımı gerçekleştirin.
- Larva bant üzerine monte etmeden önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Aksi takdirde, larva banda uygun olmayacaktır.
- hafif bir baskıyla cam slayt çift taraflı bant konumlandırılmış sinek dorsal yüzü sopa. görüntüleme sırasında hareket uçmak yol açacaktır sinek ve çok az kuvvet öldürebilir çok fazla basınç unutmayın.
- OCM ile Larvaların Aşamaları (L2 ve L3) de Drosophila Optik Görüntüleme
NOT: kalp tüpü geniş bir lümen fo olabilirund larva aşamasında A8 A5 arasındaki segmentlerinde yer alan (Şekil 1). enine OCM M-mod görüntüleri (2D + zaman) sistolik ve diyastolik analizi kolaylaştırmak için her larva için kalp tüpü A7 segmentinde elde edildi.- objektif lens aşağıdan yukarıya bakacak şekilde sırt tarafında ile y-enine yönde OCM sisteminin ayarlanabilir numune aşamasında monte larva yerleştirin. Numune aşamasında küçük bir delik sahne uçağı ile temasını önlemek için larva yerleştirmek için gereklidir.
- meyve kalp tüpü görüntüleme ışının odak düzlemine sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Kolayca A7 segmenti bulmak için gerçek zamanlı görüntü elde etme yazılımı kesitsel OCM görüntüleri ile kalp tüpü arka bölgesini bulmak. A7 segmenti görünür kadar ileri sahneye taşımak.
- Set B-tarama başına 100 A-taramaları (çerçeve), 100 B-taramalar için görüntü elde etme yazılımı parametreleri ve scanneR gerilimi ~ 0.28 X-enine yönde mm, ve y enine yönde 0 V kapsayacak. Karanlık bir bezle örnek ışın yolunu bloke ederek arka çıkartma için arka plan gürültü verilerini elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın.
Not: 100 kare 3 geri çıkarma için de kullanılabilir. - B-tarama başına 128 A-taramaları, 4096 B-taramalar ve tarayıcı gerilimine veri toplama yazılımı Set parametreleri y-enine yönde x-enine yönde ~ 0.28 mm ve 0 V kapsayacak. Yaklaşık 30 saniye boyunca 0.28 x 0.57 mm 2 kapsayan bir bölge üzerinde sinek kalp tüpü A7 segmenti boyunca enine M-mode görüntüleri elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın.
- görüntüleme ışığa sinek kalbin uzun maruz kalmasını önlemek için veri kaydetme işlemi sırasında karanlık bir bez kullanarak görüntüleme ışını engelleyin.
- Kalp eğlenceli güvenilir ölçüm almak için 5 kez tekrarlayın ölçümüction.
- B, tarama başına 400 A taramalar, 800 B tarama ve tarayıcı gerilimine görüntü elde etme yazılım parametrelerinin ayarlanması X-enine doğrultuda ~ 1.7 mm kapak, ve y enine yönde yaklaşık 4 mm. tüm meyve sineği görüntülü olabilir sağlamak için her iki yönde de sahne taşıyın. 3 boyutlu meyve sineği görüntüler elde etmek için bir veri kümesi elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın. Not: 3D sinek yapısı Amira 3D yazılımı kullanılarak kılınabilir
- Ölçülen sinek nemlendirin ve yavaşça cam slayt çıkarmak için ıslak yumuşak bir fırça kullanın. Sürekli gelişim için ayrı bir tüp içine taşıyın. Bir sonraki gelişim aşamalarında uzunlamasına çalışma için tüp etiketleyin.
- Pupa Aşamaları Image Drosophila
NOT: Tüm meyve sinekleri PD1 gelen PD5 için görüntüleme için dışarı alındı. Şekil 1b larva şemada gösterildiği gibi, geniş bir lümen th A8 kesimlerine A5 kalırPD1 kadar e kalp tüpü. PD2 itibaren, bir konik bölme A4 kesimlerine A1 arasında gelişmeye başlar. Tutarlı görüntüler elde ve kalp analizini kolaylaştırmak için, enine M-mod görüntüleri PD1 A7 segmentinden elde edildi ve Şekil 1b işaretli olarak, PD2 sonra A1 segmentten.- PD1 Image Drosophila
NOT: Drosophila kısa bir süre pencere için bir beyaz puparium olacak - PD1 sırasında (0 1 saat). Bu zaman pencere yüksek şeffaflık OCM görüntüleme için yüksek ışık penetrasyon neden çünkü erken pupa optik görüntüleme gerçekleştirmek için idealdir.- Onlar pupa olunca meyve sinekleri tüp duvarında bulunan gibi, ıslak yumuşak bir fırça ile PD1 de görüntüleme için bireysel tüplerden pupa kaldırmak ve vücuda yapışmış gıda varsa fırça ile pupa temizleyin.
- Doğrudan ıslak fırça ile küçük bir cam slayt meyve sineği takın ve yukarı bakacak dorsal yüzü tutmak (Şekil 1a
- sinek Vücut yandan aşırı su çıkarmak.
- üstünde meyve sineği tutmak, OCM sisteminin örnek sahnede cam slayt koyun. Larva ölçümü açıklanan aynı stratejiyi kullanan sinek kalp A7 segmentinin açık gerçek zamanlı görüntüyü bulun.
- bölüm 3.2 gibi veri toplama yazılımı aynı parametreleri ayarlamak ve görüntü A7 segmentinde kalp atışları enine M-mod ve 3 boyutlu görüntüler elde etmek için.
- görüntüleme sonra sürekli geri kültür tüpüne pupa cam slayt yerleştirmek için bir cımbız kullanın.
- PD5 Aşamaları için PD2 Image Drosophila
Not: Örnek daha opak pupa aşamalarında olur için, görüntüleme sisteminin nüfuz etme derinliği azalacaktır.- dikkatlice cam s kaldırmak için cımbız kullanınlide görüntüleme için tüpten PD2 de sinek ile monte edilebilir. PD2 anda, numune kabuk sararır ve vücut PD1 (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında daha az şeffaf hale gelir.
- OCM sisteminin örnek sahnede slayt yerleştirin.
- OCM sisteminin görüntüleme ışınının odak düzlemi sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Gerçek zamanlı kesit OCM görüntü kalp tüpün anterior ucunu Bul. kalp tüpü A1 segmenti bulmak için geri posterior yönde ~ 50 mikron taşıyın.
NOT: Kalp geliştirme (PD2) Bu noktada, konik odası çok küçük olacak ve dayak olmayabilir. - önceki gelişim evreleri aynı yöntemi kullanarak enine A1 segmentinden M-mode veri setleri yanı sıra 3D veri toplamak.
- Sürekli kültürü için dikkatle tüp geri slayt koydu.
NOT: PD3 anda, kabuk numunenin rengi PD2 aşamasında daha koyu. PD4 aşamada, siyah şeritler can örneklerin kabuğun içinde görülmektedir. Diğerleri PD5 dönüşecektir Bazı sinekler, ertesi gün bu aşamada yetişkin dönüşecek. PD5 aşamada, siyah şeritler daha açıkçası meyve sinekleri görülür bulunmaktadır. Bu sinekler ertesi gün yetişkin haline gelecektir.
- PD1 Image Drosophila
- Yetişkin Sahne Image Drosophila
NOT: yetişkin aşamada, kadın ve erkek sineklerin vücudun büyüklüğü ve alt karın rengine göre ayırt edilebilir. erkekler daha küçük ve koyu renkli alt karında ise kadın yetişkinden daha büyük bir boyutu var.- Meyve sineği bir yetişkin haline geliştiğinde inkübatör tüpü dışarı atın ve yetişkin bir ~ 45 ml boş şişeye sinek aktarın.
- Anestezi içine bir değnek emici ucunu (~ 1 cm uzunluğunda, ~ 3 mm çapında) Dip şişenin içine değnek koymak ve sadece takılı pamuk altında ve anestezik ucunu tutmak için bir pamuk küme ile tüp fiş anes3 dakika boyunca sinek thetize. anestezi süresi anında büyüklüğüne bağlıdır ve en az 3,5-2,5 arasında değişebilir (örneğin: min 3 kadın, en az 2.5 erkek veya 3.5).
- çift taraflı bant parçası ile bir cam slayt hazırlayın.
- sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yumuşak bir fırça kullanarak cam slayt üzerine anestezi sinek taşıyın.
- Bir cımbız kullanarak kanatları ayırın ve sinek düzeltmek ve görüntüleme için kalp bölgesini ortaya çıkarmak için bir mikroskop altında kasete kanatları sopa.
- Görüntü sinek kalp A1 segmentinden sinek (Şekil 1). Deneyin sonunda, uçucu feda edilebilir.
4. Görüntüleme Analizi 16
- görüntü dosyaları görüntü elde etme yazılımı ile toplanan 2D ve 3D ikili dosyaları dönüştürmek için Matlab programlarını geliştirmek.
- creat enine M-mode görüntülerde kalp tüpü bölgesini ve bir sihirli değnek algoritması tanımlamak için ImageJ kullanınHer enine M-mod görüntü için kalp bölgenin ea maskesi. Segment maskeli bölge ve sistolik ve diyastolik yerleri belirlemek için bir zirve bulma algoritması kullanır. enine M-mode görüntülerden zamana bağlı kalp çap değişiklikleri hesaplayın.
- edinilen zamana bağlı kalp çapları dayanarak, İK, kardiyak faaliyet döneminde (CAP), uç Diastol çapı (EDD), uç sistol çapı (ESD), uç Diastol alanda (EDA) gibi kardiyak parametreleri hesaplamak ve (sistol alan son ESA). fraksiyonel kısalma (FS) ile hesaplayın
- sinek kalbin yapısal gelişimini görselleştirmek için 3D OCM görüntüleri analiz etmek ImageJ kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
uzunlamasına kardiyak görüntüleme OCM ile oda sıcaklığında 24B-GAL4 / + suşu ile meyve sinekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçümler L2, L3 gerçekleştirilen ve PD4 PD1 8 saat aralıklarla ve yetişkin günlük 1 (AD1) başkalaşım süreci (Tablo 1) izlemek için bulundu. Larva erken Pupa geç pupa ve yetişkin sinek Şekil 1A görüldüğü gibi, cam lam üzerine yerleştirilmiştir. Larva ve ergin sinekler için kalbin segmenti özellikleri Şekil 1B şematik temsiller gösterilmiştir.
Bu gelişimsel çalışmada, 4.096 kare bir meyve sineği kalp atışı izlemek için bizim özel OCM sistemi ile 32 saniyede elde edildi. ölçüm doğruluğunu artırmak için, beş tekrarlanan ölçümler her gelişim aşamasında her numune alındı. 3D veriler de metamorfoz sırasında kalp yapısı değişiklikleri gözlemlemek için elde edilebilir.
Enine M-mod ve 3D görüntüler c vardı Özel Matlab programları ve ImageJ ile reated. Yüz görüntüleri ve eksenel bölümler de Drosophila metamorfoz (Şekil 2) sırasında kalbin yeniden şekillenme sürecini görselleştirmek için elde edilen verilerden inşa edildi tr. meyve sinekleri kalp fonksiyonlarını ölçmek için, kalp bölge otomatik olarak 4096 çerçeveleri özel bir Matlab programını kullanarak segmente edildi. Sinek kalp atım hızı (KAH) enine M-mode OCM görüntülerden sayısal olabilir (Şekil 3a). Pupa aşamalarında, Drosophila kalp bazen 16 yenerek durdurur. Biz toplam görüntüleme süresi bir kalp atışı ile dönemin oranı ölçmek için yeni bir kardiyak fonksiyonel parametre, kardiyak aktivite dönemi (CAP) tanıttı (Şekil 3b). EDD, ESD, EDA, ESA ve FS de Drosophila gelişimi sırasında eksenel ve enine her iki boyutta kalp odası değişiklikleri ölçmek için kullanıldı. 16
larva aşamalarında içerik ">, kalp tüpü daha geniş bir lümen arka karın bölgesi A8 başlar (A5 - A8 Şekil 1B) ve daha dar çaplı (T3 / A1 ile ön sırt kesimi A1 biter - A5 Şekil 1B ). kalp odası medial ve dorsal bulunur ve L2 (Şekil 2 a, B) ya da L3 (Şekil 2 C sırasında büyük büyüdü, d). PD1 girdikten sonra, kalp tüpü, hareket eden havanın üst üzerinde eksenel olarak uzanan gözlenmiştir kabarcık (Şekil 2 e, f) Yaklaşık 10 -. 13 saat sonra, kabarcık puparium oluşumundan sonra kayboldu ve ön kalp tüpü ventral bulunduğu yana oldu dışa dönük geniş lümen, bütün kalp tüpü posterior bölgesi hariç görünmez oldu. OCM görüntüleri ~ puparium oluşumundan sonra 12 saat sonra PD2 sırasında, kalp odası yavaş yavaş dorsal karın boyunca hizalanmış ve arka kısmı (A6 - A8). kalbin elendi (Şekil 2 g, h) 42,43. Bir konik odası ~ A1 geliştirmeye başladı - PD2 sırasında A4 segmenti ve yetişkin aşamasında (Şekil 2 i - m) kadar boyutu büyüdü.yapısal değişiklikler gözlemlemenin yanı sıra, pek çok fonksiyonel değişiklikler kardiyak yeniden sırasında da bulunmuştur. Şekil 3'te gösterildiği M-mod görüntüleri kalp atışı pupa aşamasına larva aşamasında önemli ölçüde yavaşladı, sonra da yetişkin pupa önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Önemli İK değişiklikler yaşam döngüsü (Şekil 4a) sırasında gözlendi. Ayrıca, kardiyak aktivite süresi (CAP) AD1 (Şekil 4b) L2 ölçülen tüm örnekler için analiz edildi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, sıcak L2 ve L3 için dakika başına ° 'de 277 (bpm) tutar. Erken pupa aşamalarında girdikten sonra İK ve CAP belirgin bir azalma var. İK PD1 başında 86 ± 11 bpm azalır ve e 26 ± 8 bpm azalmaya devam ediyorPD1 of nd nihayet erken PD2 tam bir durdurmak için gelen. Bir ilginç keşif PD2 sahne etrafında gözlenen kardiyak yazıcının uzun dönemdir (~ 24 saat - puparium oluşumundan sonra 48 saat), kardiyak gelişimsel diastalsis 16 anılacaktır. PD2 sonunda yavaş aralıklı dayak (CAP 5 ± 2 ile 6 ± HR 17 bpm) devam eder. PD3 ve PD4, İK ve CAP artış yetişkin aşamasında ilk gününde 392 ± 32 bpm ve 95 ±% 3 ulaşıncaya kadar (5 gün sonra pupa aşamasına başlayan) boyunca.
Şekil Farklı Aşamaları ve Kalp Metamorphosis şematik Temsilciliği Drosophila 1. montajı. (a) larva, pupa ve montajı, ve yetişkin WT (24B-GAL4 / +) cam slaytlar uçar. (b) kalp başkalaşım şematik gösterimi. larva ve ergin schemati Kırmızı oklarsırasıyla PD1 24 saat kadar OCM M-mod görüntüleme yerleri göstermek ve daha sonraki zaman noktalarında için c. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Drosophila Kalp Morfolojik değişiklikler Şekil. Yüz ve (a, b) L2 elde edilen bir WT Drosophila eksensel kesit OCM görüntü (c, d) L3 (e, f) PD1 (G, H) Pd2 (I, L) PD4 ve (k, m), yetişkin En aşamaları. Drosophila kalp M-mode görüntüleri PD1 kadar ve daha sonraki aşamalarda A1 segmentten A7 segmentten elde edilmiştir. Yüz ve eksenel kesit görüntüleri 200 um ve 500 mikron, r göstermek tr ölçekli çubuklarespectively. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Drosophila Kalp Fonksiyonel Değişiklikleri Şekil. (a) yaşam döngüsü boyunca İK değişiklik gösteren farklı gelişim aşamalarında M-mod görüntüler. (b) kardiyak aktivite dönemi (CAP) hesaplama gösteren örnekler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fonksiyonel Kardiyak Parametre Şekil 4. Kantitatif AnalizWT s L2, L3, 8 saat aralıklarla Pupa Aşamaları ve AD1 gibi farklı Gelişim Aşamaları, en Sinekler. (a) İnsan. (b) CAP. her bir grubun hata çubuğu, standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| gelişim Aşaması | |||||||||||||||||
| L2 | L3 | PD1 | PD2 | PD3 | PD4 | AD1 | |||||||||||
| 8 saat | 16 saat | 24 saat | 32 saat | 40 saat | 48 saat | 56 saat | 64 saat | 72 saat | 80 saat | 88 saat | |||||||
| numune sayısı | 21 | 17 | 13 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 18 | 17 | 18 | 9 | 25 | |||
WT Meyve Tablo 1. Sayı Kardiyak Gelişimsel Çalışması Çeşitli Gelişim Evreleri ölçüm Sinekler.
Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 1. İzleme ve z Yönetmenliği (eksenel doğrultuda) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim L2 uçarlar. Kalp sabit bir oranda göreceli hızlı çarpıyordu. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.) p>
Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 2. İzleme ve z Yönetmenliği (eksenel doğrultuda) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD1 uçarlar. İK azalmaya başlamıştır. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 3. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD2 uçarlar. Kalp süre içinde tamamen yenerek durdurdu. çizilen Z çaplı salınım görüntüleme gürültü nedeniyle olmuştur. target = "_ blank"> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Bir WT Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 4. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çapı Değişim PD4 uçarlar. PD2 sonra İK ve CAP artmaya başladı. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
AD1 bir WT Fly Zamansal Boyut boyunca Heartbeat Video 5. İzleme ve z Yönetmenliği (Eksenel Yönü) boyunca Sorumlu Kalp Odası Çap Değişikliği. İK tüm aşamalarda en yüksek ve CAP neredeyse% 100 idi.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (indirmek için sağ tıklatın.)
Bir larva sinek Video 6. 3D yapısal render. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Larva ve ergin dönemlerinde 400 bpm civarında maksimum HR Drosophila hızlı kalp atışı, kalp diastoles ve systoles (tecrübelerine dayanarak en az 80 kare / sn) gidermek için yüksek görüntüleme hızı gerektirir. Nedeniyle küçük kalp odası büyüklüğü ve mikron ölçekli kalp duvar kalınlığına (5-10 um), yüksek uzamsal çözünürlük (2 um daha iyi) kalp tüpü yapılarının çözülmesi için gereklidir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü ve ultra hızlı OCM sistemi ızgara 600 satır / mm şanzıman ile bir spektrometre ve 2048 piksel hat-tarama kamerası kullanıldı nerede geliştirildi. 20 kHz bir a-tarama hızı satır tarama kamerası tarafından sağlanır. 128 kare kare hızı / sn L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 ve yetişkin olmak üzere çok sayıda gelişim evreleri, Drosophila kalp atışı yakalamak için yeterince hızlı. ışık kaynağı ~ 800 nm ve merkezi bir dalga boyu ve bant genişliği ile geniş bir bant genişliği supercontinuum ışık kaynağı oldu220 nm, sırasıyla ve dokuda ~ 1.3 um'lik bir eksenel çözünürlük elde edilmiştir. 10X objektif 3.9 um aralığında bir enine çözünürlük elde etmek için Örnek kolu kullanılmıştır. Drosophila kalp tüpü yaklaşık 200 mikron dorsal yüzeyinin altında olduğundan, mikron metre yüzlerce bir görüntüleme derinliği gereklidir. 45 ° çubuğu aynası halka şeklinde bir örnek ışın oluşturur ve numune 44 odak derinliği genişletmek için kullanılabilir. duyarlılık ve 3 dB roll-off ~ 9 mW örnek kol gücü ile sırasıyla 96 dB ve 600 mikron olduğu tespit edilmiştir. Özel bir bilgisayar programı ölçümleri OCM sistemini kontrol etmek ve yürütmek için kullanılmıştır. Kardiyak yapısal görüntüleri ve elde edilen fonksiyonel parametreler kantitatif onun bütün yaşam döngüsü boyunca Drosophila kalp morfolojisi ve fonksiyonunu karakterize etmek OCM kullanarak uygulanabilirliğini göstermek.
Günümüzde, bir çok başka teknikler de görüntü küçük için kullanılırhayvan kalp yapısı veya fonksiyon, örneğin bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve ultrason gibi. OCM ince yapıları ve hayvan kalpleri hızlı dinamikleri görselleştirme sağlayan bu tekniklerin daha yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük sağlar. Mikroskopisi başka yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir, ancak düşük görüntü nüfuz ve görüntüleme kontrast maddelerin talep canlı hayvanlarda uygulamaları sınırlamak. Nispeten OCM yüksek hız ve küçük hayvanlarda non-invaziv hızlı kalp dinamiklerini görselleştirmek için etiket ücretsiz görüntülenmesine olanak sağlar. Ancak, yine de OCM sınırlamalar vardır. ultrason 10 cm'ye kadar nüfuz derinlikleri olan Örneğin, OCM tarafından sağlanan görüntü derinliği dokusunda yaklaşık 1 mm birkaç yüz mikronluk ışık saçılımı ile sınırlıdır. konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, OCM yüksek hız ve daha iyi görüntüleme derinliği, ancak daha düşük çözünürlük ve kötü moleküler kontrast vardır. Ayrıca, mevcut OCM sistemi baspektral domain algılama sistemleri sed. OCM 45 süpürüldü-kaynağına göre daha yüksek görüntüleme hızı kalp atışı gibi hızlı dinamikleri daha belirgin görüntüleri sağlayabilir.
OCM'de ile Drosophila kalp atışı uzunlamasına bir çalışma gerçekleştirmek için, protokol birçok kritik adımlar vardır. sinekler Deneyin her aşamasında çok ince ele alınması gerekir. Aşağıdaki gelişim aşamalarında kalp yapısı ve fonksiyonu etkileyebilir larva, zarar kolaydır çünkü larva yönetme özellikle nazik olmalıdır. sinekler kapak cam ve çok hassas görüntüleme sahnede yerleştirilmelidir. Kötü yerleştirilmiş sinekler zor kaliteli görüntüler elde etmek ve çarpık yapısal ve işlevsel kalp parametre değerleri neden olabilir yapacaktır. Ayrıca, transfer yetişkin başka bir tüp uçar ve pamuk takmayı tüpten kendi kaçmasını önlemek için çok hızlı olmalıdır.
Farklı çalışmalarDrosophila kalp geliştirme protokolü değiştirerek yapılabilir. Sinekler kültüre olan sıcaklık artışı veya kalp gen ifade seviyesini değiştirebilir ve sinek geliştirme süresini değiştirmek için 25 ° C'den azaltılabilir. örneğin hindistan cevizi yağı ya da standart gıda ATR gibi maddeler ekleyerek, kalp gelişimi değiştirilebilir. Belirli çalışmalar, vahşi tip veya transgenik sinekler gerçekleştirilebilir. uzunlamasına meyve sineği kalp gelişimini incelenirken, farklı zaman aralıklarında, örneğin OCM ölçümler yapmak için kullanılabilir, 8 saat aralığı pupa aşamalarında kullanılabilir. Nedeniyle bizim OCM sisteminin sınırlı hassasiyeti, düzgün benek çok gürültü zor doğru Matlab programları ile kalp kasılma sinyallerini tespit ve veri analizi etkinliğini azaltmak için yapabilirsiniz enine M-mode görüntülerde, bulunur. Duyarlılık OCM sisteminin hizalama geliştirerek arttırılabilir. Optimize edilmiş filtreleme algoritmalarıbenekler bir kısmını kaldırmak için tavsiye edilir.
Açıklanan protokol, insan sirkadiyen ortologlar, Drosophila dCry ve dClock bağlı kalp kusurları sessizliği incelemek için uygulanmıştır. Azalmış RO larva, pupa ve yetişkin 15,16 dahil olmak üzere farklı gelişimsel aşamalarında gözlenmiştir. Kalp gelişiminde sirkadiyen genlerin rolü kardiyovasküler bozukluklar ve sirkadiyen ritim ilgili etkinlik modelleri arasındaki ilişkiyi açıklayabilir, ortaya çıktı. Yüksek yağlı-diyet (YYD) bağlı kalp hastalıkları da YYD 15 ile beslenen meyve sineklerinin kalp fonksiyonel değişiklikleri analiz tarafından incelenmiştir. Bu çalışmalar, kalp yapısı ve fonksiyonu gelişimsel çalışmada güçlü bir araç değil, aynı zamanda doğumsal ve doğum sonrası insan hastalıklarının anlamada kardiyak uzunlamasına çalışmanın önemi olarak sadece Drosophila gösterdi. OCM platformu gelecek çalışmalara geniş bir yelpazede sağlayacak in geni insan kalp hastalığı ile ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
References
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
- Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
- Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
- Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
- Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
- Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
- Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
- Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
- Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
- Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
- Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
- Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
- Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
- Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
- Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
- Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
- Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
- Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
- Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
- Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
- Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
- Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
- Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
- Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
- Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
- Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
- Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
- Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
- Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).
