Abstract
光热角光散射（PT-AS）是用于测量血液样本的血红蛋白浓度（[血红蛋白]）一种新颖的光学方法。对血红蛋白分子的固有光热响应的基础上，该传感器可实现高灵敏度，[血红蛋白]的无化学计量。 [血红蛋白] 0.12克/分升以上0.35的范围内的极限检测能力 - 17.9克/ dl的先前已证实。该方法可容易地使用便宜的消费电子设备，诸如激光指示器和网络摄像头实现。作为血液容器使用微毛细管还使用纳升规模的血容量和低运行成本的血红蛋白测定。这里，对于对PT-AS光学设置和信号处理程序的详细说明介绍。实验方案和用于贫血的条件血样代表性的结果（[血红蛋白] = 5.3，7.5，和9.9克/分升）也提供，并测量与这些往复相比马血液分析仪。其在实施和操作简单应使其广泛应用在临床实验室和资源有限的环境。
Introduction
验血通常以评估整体的人类健康和检测与某些疾病生物标志物。例如，在血液中的胆固醇浓度用作用于高脂血症的标准，这是密切相关的心血管疾病和胰腺炎。血糖含量应经常测量，如葡萄糖水平与并发症如糖尿病酮症酸中毒和高血糖高渗综合征。严重的疾病，如疟疾，人类免疫缺陷病毒和获得性免疫缺陷综合征是由血液检查确诊，和血液成分，包括红细胞，血小板的量化和白细胞使胰腺和肾脏疾病筛查。
血红蛋白，血的关键组成部分，构成了红细胞的约96％，并输送氧气到人体器官。其质量浓度显著改变（[血红蛋白]）可能表明我tabolic变化，肝胆疾病，和神经，心血管及内分泌紊乱1。 [血红蛋白]因此在常规验血测量。尤其是贫血患者，透析患者和孕妇强烈建议监察[血红蛋白]作为一个重要的任务2。
各种[血红蛋白]检测方法就这样被开发。血红蛋白氰化法，对于[血红蛋白]量化最常用的技术之一，使用氰化钾（KCN）摧毁红细胞3的脂质双层。通过在540nm附近的化学展品高吸收产生的氰化物血红蛋白;因此，[血红蛋白]测量值可以通过比色分析进行。这种方法由于其简单性广泛采用，但所采用的化学品（ 如 ，KCN和dimethyllaurylamine氧化物）是有毒的对人体和环境。血细胞比容方案测量与总血液体积的红血细胞的体积比乌梅通过离心分离;然而，它需要一个相对大的血液量（50-100微升）4。分光光度法测量方法[血红蛋白]正是没有任何的化学物质，但在多个波长和大血容量测量需要5,6。同样，用于测量[血红蛋白]几种光学方法已经提出了包括基于光散射的检测方法，但其测量精度上的理论血模型的准确度在很大程度上取决于。
为了克服这些限制，基于血红蛋白的光热（PT）作用[血红蛋白]检测方法近来已经提出7。血红蛋白，它是由主要是铁的氧化物，在532纳米吸收光的光能量转换成热8-10。这个PT温度增加可以光学地通过测量血液样品的折光指数（RI）的变化来检测。 Yim 等。就业谱域光学相干reflectometry以测量在含有血液室11在PT光路长度变化。虽然该方法能够化学 - 自由和直接[血红蛋白]测定，使用分光计和干涉装置可阻碍其小型化。我们最近提出一种替代[血红蛋白]检测方法，称为光热角光散射（PT-AS）的传感器，它更适合于设备的小型化12。在PT-AS传感器利用了背散射干涉（BSI）的高RI灵敏度测量毛细管内的血液样品的RI PT变化。 BSI已用来测量各种解决方案13-15中RI和监测在自由溶液16生物化学相互作用。该PT-AS传感器采用类似的光学结构为BSI，但结合光热激发的设置来测量血液样本中的RI PT增加。在BSI和PT-AS传感器的工作原理进行了详细的描述别处
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Protocol
与血液样本实验是在遵守有关法律和机构指导进行。的样品已被获取并在该机构的临床试验处理剩余血样。
1. PT-AS光学装置
注意：一个可以利用一个空微毛细管用于初始的PT-AS的设置。
- 装入一个空的微毛细管具有分别为200和330微米，内径和外径，和大于约5厘米的毛细管夹具的长度。市售的纤维夹具可被用作管夹具。
- 安全锚650nm的激光指示器， 即探测光源，照亮毛细管。探测光束应该比毛细管大。将毛细管垂帘听政（ 如白皮书），观察的角度周期性模式。
- 对于检测部分，删除任何镜头摄像头可以直接捕捉scatt化工e圈格局。在相对于探测光束方向25-35度的一个角度的毛细管后面的网络摄像头位置。确保由毛细管产生的角度周期性图案可与检测器（ 图1）来测量。观察的角度周期性图案在图像传感器的中间时，图像传感器被正确地定位。
- 一个532纳米PT激发光源来照亮毛细管位置。在PT光源在任何角度，只要该PT激励光与毛细管探测光束重叠，不直接到达探测器的位置。采用高光功率通常血样PT激发改善对PT-AS的灵敏度，因为它会导致在对RI更大的变化。
- 使用采用PT激发光源的最高光功率。此外，确保在PT激励光重叠在毛细管的探测光。使用PT激发光的光束尺寸的至少两倍的探测光来加热整个探头体积。
- 放置一个长通滤波器在探测器的前面以阻止532纳米的光，并测量仅650纳米探测光。
- 照明毛细管之前安装在PT激发光的路径的光学菜刀。光学斩波器被用来调节该PT激发光强度。
2.血液样品制备
- 绘制的6ml新鲜全血中贫血状况入乙二胺四乙酸血液采样管，并充分混合样品井。不需要其他处理。
- 使用提取的24小时内PT-AS传感器，以防止凝血测量血液样本。
3. PT-AS测量协议
- 加载一个微毛细管与血液样品以测量。通过将管进入血液个饱通过毛细作用血液毛细管充足。测定所需的最小样品体积由毛细管的内径和探测光束大小决定。
- 采用管的200微米的内径。探测光束尺寸为2mm中的代表性结果，这表明该测量可以与> 63 NL的样本量来进行。
- 装入毛细管在夹具的指定位置。
- 打开650纳米探针激光照射血装载微毛细管。角周期性图案应与摄像头观察到。
- 打开532纳米的PT激发激光照亮管。
- 运行的光斩波器调制以2Hz该PT激发光的强度。
注：此操作条件的选择的理由讨论和Kim 等人说明。 12。- 在光学斩波器的马达头组件安装斩光轮系统。
- 打开斩波控制箱，并使用该控制旋钮在控制台设定调制频率。
- 通过运行控制旋钮菜刀。
- 记录通过在MPEG-4（MP4）格式的摄像头，持续5秒的波动散射图案。
4.信号处理
注：PT-AS的信号处理被使用实验室开发的MATLAB代码执行。
- 加载视频文件中提取图像。对于每个图像[参见图2（a）为一代表图像]，由沿垂直方向的计算的像素值的平均值获得平均散射图案[ 图2（B，C）。
- 评估的傅立叶变换平均散射图案，并且在峰值空间频率计算的相位。所有录制的图像的所有帧执行这些操作。
- 利用所有图像获得的相位值，绘制时间相位波动〔 如图2（d）]。注意，相位波动在该PT调制频率。取傅立叶在调制频率变换在时域的相位变动的，并且得到的幅度。此信号被称为对PT-AS信号〔 如图2（E）]。
- 由它的PT-AS信号转换成测量血液样品中的[血红蛋白]使用在协议5中获得的校正曲线相应的[血红蛋白。
5. PT-AS校准
- 制备血液样品中，具有[血红蛋白]被均匀地分布在PT-AS传感器的检测范围内的值（ 例如 ，0 - 29克/分升）。
- 校准之前，量化使用参考血液分析仪的样品的[血红蛋白]值。测量样品的PT-AS信号。
- 通过派生进行线性最小二乘法拟合有关[血红蛋白]将PT-AS信号的校正曲线，[血红蛋白] = A [PT-AS信号] + B，该experimenta的升的结果。对于表1中指定的操作条件，间[血红蛋白]和PT-AS信号的关系被认为是[血红蛋白] = 5.13 [PT-AS信号] - 0.09。利用MATLAB代码来执行的线性拟合。
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Representative Results
使用PT-AS传感器被执行的血红蛋白测定法，其测量结果与那些从血细胞分析仪进行了比较。实验用1.4瓦/厘米2，2赫兹的PT调制频率，并测量5秒的时间的一个PT激励光强度进行的。 表1总结了实验条件。探针和PT激发光的光束尺寸分别为5.5和2毫米。摄像头以30 fps的帧速率录制的影像。测量中，采用了三种不同的Hb浓度的贫血的血液样本。在PT-AS测量之前，将样品中的[血红蛋白]值5.3，7.5，和9.9克/由血细胞分析仪dl的首次测量。
图3（a）示出了调制的PT光照明下的角散射图案的代表性时间推移相位波动。钍是通过取付里叶变换的角度散射图案中，并在峰值空间频率测量时间相位的波动所获得的信息。需要注意的是血样与更高的[血红蛋白]展览较大的相移。相应的PT-AS信号进行了评价，并转换成[血红蛋白]值。十一测量每个样品进行的，并发现，平均[血红蛋白]值是5.46，7.23，和9.85克/分升，分别。吻合使用血液分析仪所获得的结果[ 图3（B）]。在PT-AS传感器的[血红蛋白]的测量精度被认为是<0.89克/分升。这种波动可能会部分地由在探针体积红细胞 - 所用光源的强度波动数波动占。 表2给出对那些从血液分析仪对PT-AS的测量的详细比较。
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图1：示意图PT-AS传感器。从激光指示器650纳米的探测光被引导到血液加载毛细管。光然后由含有血管分散，产生于一摄像头的周期性图案。在用532纳米的光，在该血红蛋白分子显示出高吸收照明，血红蛋白分子吸收光能并将其转换成热量。所得温升改变血液的RI。因为角周期性图案与RI和该管的物理尺寸而变化，[血红蛋白]在血液中，通过测量在角周期性图案此PT移定量。光斩波器被用来实现[血红蛋白]测量具有高信噪比。一个低成本的塑料长通滤波器位于直接在摄像头面前只能检测探测光。K“> 点击此处查看该图的放大版本。
图2：PT-AS 信号处理程序。 （ 一 ）代表网络摄像头的图像与PT激发光和关闭。角散射模式转变，因为血红蛋白分子的PT反应。 （b）每个图像沿垂直（y）方向上，以获得平均模式平均。 （ 三 ）代表与平均PT激励和关闭周期性模式。 （d）本平均周期性图案然后傅立叶变换，并在峰值空间频率的相位被检测作为时间的函数。根据经调制的PT光照射，周期性图案的相位变动的调制频率。 （ 五 ）测得的阶段感ctuation是傅立叶变换，并且其幅度在调制频率进行评价，被称为对PT-AS信号被转换成[血红蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 贫血血样PT-AS的测量。 （a）用于贫血条件三血液样品（[血红蛋白] = 5.3，7.5，和9.9克/分升）测得的角散射图案的代表性相位波动。血样具有较高的[血红蛋白]值产生较大的相位变化。 （ 二 ）[血红蛋白]使用比较与那些从参考血液分析仪的PT-AS传感器测量值。十一PT-AS测量每个样品进行。在犯错或棒表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 实验条件 | |
| PT调制频率 | 2赫兹 |
| PT光强 | 1.4瓦/平方厘米 |
| PT光束大小 | 5毫米 |
| 探测光束尺寸 | 2毫米 |
| 测量时间 | 5秒 |
| 帧采集速率 | 每秒30帧 |
表1：Experimental条件。
| 血液分析仪（克/分升） | PT-AS传感器 | |
| 平均（克/分升） | SD（克/分升） | |
| 5.3 | 5.46 | 0.72 |
| 7.5 | 7.23 | 0.89 |
| 9.9 | 9.85 | 0.84 |
表2：通过对PT-AS传感器与那些由血液分析仪测量的[血红蛋白]比较。
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Discussion
在PT-AS传感器表示能够未处理的血液样本的直接[血红蛋白]测量的全光学方法。的方法，使用在红细胞的血红蛋白分子的内在的PT响应量化[血红蛋白]血液中。下通过532纳米的光照射，血红蛋白分子吸收的光的能量，并产生热量。所得温升改变血样的RI。 BSI的高灵敏度RI被利用来测量血液中这种RI变化。先前，我们表明，在PT-AS传感器使[血红蛋白]测量0.12克/分升以上0.35-17.9克/分升，这与在市场上的商业[血红蛋白]传感器中的范围的检测极限。
在PT-AS传感器的一个显着的特点是，它不需要血液样品或化学品的任何预处理。因此，传感器能直接，快速（<5秒），环境友好的测量。使用基于玻璃的微毛细管作为样品续ainer启用[血红蛋白]分析在低运行成本。在PT-AS传感器的最小样品体积由毛细管的内径和毛细管测量光束大小决定。据估计是在〜代表性结果63 NL。相比在商业仪器所需要的样品体积（ 例如 ，50-200微升为基准血液分析仪），在PT-AS传感器使[血红蛋白]测量用显著减少样品体积。几个快速和低成本的[血红蛋白]检测技术已经报道了11,17,18，但仍需要2-10微升操作的样品体积。
在PT-AS传感器实现的几个特点应注意。应该确保在PT激发光光束的尺寸是，在毛细管的探测光束的至少两倍。两个光束应在毛细管重叠，因为没有或部分重叠在th两个光束的Ë管会导致要么没有或更小的PT-AS响应。人们也应该确保的角度散射图案是不饱和的检测器上。沿水平或垂直方向可能是必要的散射图案取向的调整;否则，所获取的图像应当在信号处理级进行旋转。注532纳米的PT激发光的散射由该管还产生在检测器上的角散射图案。因此，长通滤波器需要阻止的532纳米的光。更大的图像传感器捕捉更加棱角分明，周期模式。角图案的傅里叶变换在相应的空间频率，其允许以更高的精度相测量将由此产生更高的信号。此外，更高的帧速率将通常导致PT-AS测量具有改进的SNR，因为它使相位时间波动的更多的采样。因此，使用一个大的，高速图像传感器的具有高的像素ð密度是有利的。
有些意见也应测量时间，PT调制频率进行。正如Kim 等人描述。 12，在PT-AS信号指的是傅里叶变换在该PT调制频率测得的角散射图案的相位波动的幅度。噪声被定义为傅立叶的峰值幅度的PT激发12之前的相位测量的变换。在PT-AS信号的SNR被由噪声除以该PT-AS信号的大小进行评价。较长的测量时间通常产生具有更高的信噪比测量，但增加了总[血红蛋白]检测时间。测量时间设定为5秒，为<1克/分升的[血红蛋白]血样实现信噪比大于3连。最优PT调制频率可以通过检查对PT-AS传感器的SNR作为PT调制频率的函数被发现。为代表的最佳调制频率余丹丹结果被发现是2赫兹。与PT调制频率小于2赫兹操作没有产生高SNR由于低频噪声比如光学斩波器和振动的过度运动。
在这个演示中，PT-AS传感器在台式配置中使用商用激光指针和摄像头证明。光学装置很简单，而且，因为任何化学物质都参与其中，测量过程很简单。另一方面，应当强调的是，传感器可潜在在紧凑的手持设备被包装。探针和PT激发光源可以通过低成本的激光二极管或发光二极管来代替。内置有计算能力小型化的互补金属氧化物半导体图像传感器也可以用作检测器。在小尺寸集成这些组件将产生[血红蛋白]试验了一种新型便携式，和廉价的无化学品的平台。一世Ñ除了[血红蛋白]测定中，在PT-AS传感器的检测原理可以扩展到感测显示出PT的反应的各种生物标记物和化学品。例如，有机磷酸盐和杀虫剂的PT化验还已经证明19，并且可以与对PT-AS方案中可以容易地实现。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 650 nm laser pointer | LASMAC | LED-1 | Probe light |
| Hollow round glass capillaries | VitroCom | CV2033 | Blood sample container |
| Webcam | Logitech | C525 | CMOS optical sensor |
| Optical chopper system | Thorlabs | MC2000-EC | Optical chopper |
| Plastic long-pass filter | Edmund Optics | #43-942 | To reject 532-nm PT excitation light |
| Fiber clamp | Thorlabs | SM1F1-250 | Capillary tube fixture |
| EDTA coated blood sampling tube | Greiner Bio-One | VACUETTE 454217 | Blood sampling & anticoagulating |
| Hematology analyzer | Siemens AG | ADVIA 2120i | Reference hematology analyzer |
References
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