Summary
هذه الطريقة تستخدم الأجنة الزرد لاختبار كفاءة القدرة الغازية الأوعية الدموية للخلايا السرطانية. يتم حقن الخلايا السرطانية الفلورسنت في الجيوب الأنفية أو أمام القلب الكيس المحي من الأجنة النامية. ويتم تقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية والتسرب عن طريق الفحص المجهري مضان من منطقة الذيل في وقت لاحق 24-96 ساعة.
Introduction
المرض المنتشر هو سبب رئيسي لوفيات السرطان والعديد من الآليات التي تمكن من نشر الخلايا السرطانية ولا يزال يتعين اكتشافها 1. من أجل خلية السرطانية metastasize بنجاح، يجب أن غزو أولا من خلال سدى الذي يحيط الورم الرئيسي، أدخل (intravasate) في نظام الدورة الدموية، والبقاء على قيد الحياة في العبور، الخروج (يتسرب) من التداول، وإقامة أخيرا مستعمرة قابلة للحياة في موقع الجهاز البعيد 2. دخول الوعاء والتسرب وبالتالي فهي خطوات حاسمة في تتالي النقيلي، ولكن كل الخلايا السرطانية ليست بارعة بطبيعتها على تعطيل والهجرة من خلال تقاطعات البطانية 3. في الواقع، هناك سلسلة من الضغوط اختيار الفريدة التي تحيط الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية وعملية يمكن زيادة يتأثر بمجموعة من العوامل 4 الداخلية والخارجية. لهذه الأسباب، التقنيات التي تحقيق في السلوك العدواني من السرطان مرحلة متقدمة غالبا ما تركز على الخامسascular القدرة الغازية كوسيلة للتنبؤ انتشار النقيلي.
توجد أنظمة نموذج مختلف لتسهيل دراسة الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية في المختبر. الأكثر استخداما في فحوصات المختبر ينطوي إما أنظمة transwell لتقييم هجرة الخلايا السرطانية من خلال حاجز غشائي 5 أو التكنولوجيا الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS) لمراقبة اضطراب في الوقت الحقيقي من أحادي الطبقة البطانية سليمة من الخلايا السرطانية 6. هذه المقايسات تفتقر عادة ديناميات السوائل والعوامل اللحمية التي من شأنها أن تؤثر على خلاف ذلك مرفق الخلية السرطانية إلى جدار البطانية. وتحايلت هذه المسألة إلى حد ما عن طريق شبكات الأوعية الدموية perfusable التي تنشأ عن الثقافة 3D من بطائن مع دعم خلايا انسجة، وهذه النظم ميكروفلويديك 3D تمثل الآن طليعة الخيارات الحالية في المختبر 7،8. ومع ذلك، هذه النهج حذفت المكروية قوية لنظام الدورة الدموية وظيفيةوبالتالي فقط في بديل جزئي لنماذج في الجسم الحي.
الأكثر استخداما في نموذج الجسم الحي من غزو الأوعية الدموية هو الفأر، الذي يتم تنفيذ المقايسات الانبثاث التجريبية عادة لأنها تحدث على فترات زمنية قصيرة نسبيا وتدل عموما من قدرة النقيلي 9. وتشمل هذه المقايسات الحقن المباشر للخلايا السرطانية في الدورة الدموية وبالتالي نموذج المراحل النهائية من ورم خبيث، وهي التسرب والخلايا السرطانية الاستعمار الأعضاء. تختلف المقايسات الانبثاث التجريبية القائمين على الموقع من حقن الخلايا السرطانية وأجهزة تحليلها في نهاية المطاف. في أول نوع الفحص، يتم حقن الخلايا السرطانية في الوريد ذيل الفئران والبذر الخلايا السرطانية في الرئتين ويتم رصد 10،11. الفحص الثاني القيام الحقن داخل القلب لتوجيه البذر المنتشر نحو المكروية العظام 12-14، ولكن أيضا للدماغ (15). في مقايسة الثالث، سرطان جيتم حقن ملتعلمي اللغة اإلنكليزية في الطحال للسماح الاستعمار الكبد 16 في حين أن الطريق تسليم الرابع في الشريان السباتي يحمل خلايا السرطان إلى الدماغ 17،18. بغض النظر عن طريقة التسليم الخلايا السرطانية والاستعمار الجهاز هو نقطة النهاية التجريبية المقبولة ويتم تحديد عموما عبر التلألؤ، الأنسجة، أو التقنيات التي تعتمد PCR. على الرغم من المزايا الفسيولوجية إجراء فحوصات الانبثاث التجريبية ضمن مجموعة الفئران، وهذه التجارب لا تزال بحاجة إلى أسابيع أو أشهر لاستكمال وتحليل.
وقد ظهرت (دانيو rerio) نموذج الزرد مؤخرا نظاما جديدا لدراسة سرطان التقدم 19،20، وتتيح لتقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية في نظام الدورة الدموية وظيفية على مدى زمني أقصر بكثير بالمقارنة مع الفئران 21-24. طريقة تستخدم سلالة الزرد شفافة الذي بطائن لها الموسومة مع فلوو الشعاب المرجانية الخضراءrescent البروتين مراسل مدفوعا المروج kdrl، ومستقبلات الزرد لبطانة الأوعية الدموية عامل النمو 25. في الفحص، وصفت الخلايا السرطانية مع علامة فلوري الحمراء وحقنها في الجيوب الأنفية أمام القلب من الأجنة القديمة 2-اليوم. في أي مكان بين 48-96 ساعة بعد الحقن، والخلايا السرطانية التي غزت من الأوعية الدموية وفي المنطقة الذيلية من الأجنة يمكن سجل بكفاءة على المجهر الفلورسنت. نحن هنا تطبيق هذه التقنية لفريق من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية تستخدم عادة لإظهار الفوارق الصارخة في قدرة الغازية الأوعية الدموية الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على تغيير موقع الحقن إلى كيس الجنين صفار يسمح لدراسة التفاعلات الخلية غير متجانسة، والسكان الخلايا السرطانية يمكن أن توصف بشكل مختلف مع الأصباغ الفلورية وحقنها في أجنة الزرد تفتقر الأوعية الدموية الفلورسنت. في هذا الاختبار الأخير، الخلايا السرطانية التي غزت صفار البيض وintravasated في vasculaturوسجل الإلكترونية في المنطقة الذيلية 24-48 ساعة بعد الحقن. نظرا لفعالية وراحة من هذا النموذج، ويعمل الزرد على نحو متزايد لاختبار بسرعة قدرة الغازية الأوعية الدموية من الخلايا السرطانية في ظل وضع فيزيولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تم إنشاؤها الأجنة الزرد وفقا لبروتوكول IACUC المعتمدة. وقد أجريت هذه التجارب في الامتثال لتوصيات لجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة جورج تاون.
1. تنظيم الأجنة لحقن وخلق الحلول المالية
- توليد المطلوبة اليرقات الزرد لتقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية.
- اقامة الزوج الحكيم أو مجموعة في عبر التزاوج مع تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1، mitfa b692، ednrb1 B140 الأسماك.
ملاحظة: نحن ولدت تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1، mitfa b692، ednrb1 B140 الزرد، عن طريق عبور تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1 25، التي تعبر عن الشعاب المرجانية الخضراء المرجانية بروتين فلوري في الخلايا البطانية، مع الخط الذي يفتقر إلى الخلايا الصبغية، mitfa b692، ednrb1 B140، وضعت في مركز الزرد الدولي للموارد. - شاركالبيض llect، نظيفة، وإزالة أجنة غير مخصبة أو المشوهة في اليوم التالي 22.
- احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية لتصبح جاهزة للحقن الخلايا السرطانية، لتحدث عند الأجنة الزرد هي 2 يوما بعد الإخصاب (2 DPF).
- اقامة الزوج الحكيم أو مجموعة في عبر التزاوج مع تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1، mitfa b692، ednrb1 B140 الأسماك.
- جعل لوحات الحقن.
- تذوب 25 مل من 1.5٪ الاغاروز في DH 2 O لكل لوحة.
- صب 12 مل من الاغاروز إلى 100 ملم × 15 ملم طبق بتري والسماح لها تتصلب.
- إعادة تذوب ثم صب الاغاروز المتبقية في اللوحة.
- وضع على الفور قالب قطع الزجاج (3 ملم × 7.2 سم واسعة × 7.5 سم طويلة) بحيث تكون في زاوية 30 درجة إلى الاغاروز وضعه في وسط اللوحة.
ملاحظة: هذا سيخلق حاد 60 درجة الجدار و30 درجة منحدر منحدر. - الشريط القالب الزجاج في المكان والسماح للتتصلب الاغاروز.
- إزالة بلطف العفن والزجاج، ويجب الحرص على عدم المسيل للدموع الاغاروز.
ملاحظة: قوالب يمكن تخزينها في DH 2 O في 4 درجات مئوية.
- تتوازن لوحة حقن مع أسماك المياه (0.3 جم / لتر ملح البحر).
- لوحة شطف مرتين مع الماء المقطر.
- تتوازن لوحة بإضافة 10 مل من الماء الأسماك إلى لوحة ومكان على شاكر لمدة 10 دقيقة.
- تتوازن لوحة للمرة الثانية مع أسماك المياه.
- تقسيم 2 يوما بعد الإخصاب (DPF) الأجنة إلى مجموعات حقن بتحويلها إلى أطباق تحتوي على أسماك المياه 22.
- إعداد أطباق انتعاش لكل مجموعة للاستفادة من بعد الحقن. ضمان أن الطبق الانتعاش يحتوي ماء 10 مل الأسماك، بالإضافة إلى البنسلين (25 ميكروغرام / مل)، والستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل).
- يعد حل تريكين 2X بإضافة 4 مل من الأسهم تريكين مخزنة (4 ملغ / مل، 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7) إلى 50 مل من الماء الأسماك بالإضافة إلى البنسلين والستربتومايسين.
- حل 15 ملغ انصهار منخفضة نقطة الاغاروز في 10 مل من 2X حل تريكين لتوليد المتوسطة مخدر متزايدة من شأنها أن شل الأجنة الحية لIMAGINز.
يتكون تركيب المتوسط من 1.5٪ الاغاروز: ملاحظة. - سحب microinjection الإبر.
- وضع الزجاج الشعرية أنابيب في مجتذب ماصة العمودي. سحب الماصات مدبب طويل باستخدام 20 MAMP الحالية وعنصر التدفئة 2 لفائف.
2. خلايا السرطان وصفها مع محبة للدهون صبغ نيون
- الحفاظ على الخلايا السرطانية في ظروف ثقافة الموصى بها.
ملاحظة: تم الحفاظ على هذه الخطوط في DMEM + 10٪ FBS: BT-474، قدم مكعبة-7، MDA-MB-231، MDA-MB-468، وSK-BR-3. واستمرت هذه السطور في RPMI + 10٪ FBS: HCC 1806 و T-47D. تم الحفاظ على جميع خطوط الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 أثناء الحضانة. - تولد وحيدة الخلية تعليق من قبل النأي ثقافة ملتصقة الخلايا السرطانية.
- غسل الخلايا أولا مع برنامج تلفزيوني وثم التعامل مع 0،05٪ حل التربسين-EDTA.
ملاحظة: وقت التعرض التربسين سوف تعتمد على خط الخلية. - تحييد الحل التربسين مع ذاتهوسائل الإعلام ثقافة الخلية بعد فصل الخلايا التي تحتوي على الروم.
- غسل الخلايا أولا مع برنامج تلفزيوني وثم التعامل مع 0،05٪ حل التربسين-EDTA.
- الطرد المركزي تعليق خلية التربسين تحييد لمدة 5 دقائق في 200 x ج، ثم resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام ثقافة جديدة للعد الخلايا.
- عد تعليق الخلية باستخدام عداد الآلي وإعداد 1000000 الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- تحقق بقاء الخلية مع التريبان الاستبعاد الزرقاء صبغ قبل الحقن في الأجنة الزرد.
ملاحظة: يجب أن يتم حقنه السكان خلية قابلة للحياة فقط في الأجنة الزرد، وحقن الخلايا الميتة لن تعكس غزو الأوعية الدموية صحيح.
- تحقق بقاء الخلية مع التريبان الاستبعاد الزرقاء صبغ قبل الحقن في الأجنة الزرد.
- إضافة 2 ميكرولتر من صبغ محبة للدهون الأحمر إلى وقف الخلايا السرطانية عن التخفيف 1: 100، وتخلط جيدا، ثم احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: تركيز الوقت صبغ ووضع العلامات قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية. - بعد الحضانة، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام جديد لأنبوب ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في200 × ز.
- يغسل صبغة الفلورسنت المتبقية من الخلايا السرطانية.
- نضح طاف من الخلية بيليه، resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
- كرر الخطوة غسل مرة ثانية: نضح طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة وثم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
- تكرار غسل الخطوة مرة الثالثة: ونضح طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة وثم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
- نضح طاف و resuspend بيليه الخلية التي تحتوي على 1 مليون خلية السرطان المسمى في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة.
ملاحظة: 0.5 ملي EDTA يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام لمنع تكتل الخلية.
3. خلايا السرطان عن طريق الحقن في الجيب قبل القلب من الزرد الأجنة
- نعلق نظام الاستغناء عن حقن مكروي مصدر الهواء المضغوط وتشغيل عشرالبريد حقن مكروي مصدر طاقة النظام الاستغناء.
- ضغط الاختبار بالضغط على دواسة القدم. ونبضة قصيرة من الهواء يجب أن تنبعث من حامل الإبرة.
- تتوازن لوحات الحقن مرتين مع الحل 2X تريكين.
- لكل خطوة موازنة، إضافة 20 مل من 2X حل تريكين لوحة حقن ومكان على شاكر لمدة 10 دقيقة.
- استخدام ماصة بلاستيكية لنقل مجموعة من الأجنة إلى صحن صغير يحتوي الحل 2X تريكين.
- ردم إبرة حقن حقن مكروي مع الخلايا السرطانية باستخدام هلام تحميل طرف الماصة.
- وضع إبرة في جرة التخزين الكهربائي مع نهاية مدببة أسفل حتى الخلايا تستقر بالقرب من الحافة.
- نقل 20 - 30 الأجنة تخدير لوحة حقن من خلال جمع الأجنة مع الكثير من 2X تريكين في ماصة بلاستيكية.
- السماح للأجنة ليستقر في غيض من ماصة.
- شخص مهذبلاي طرد الأجنة في الحوض الصغير من لوحة الحقن، ونشر الأجنة على طول الحوض.
- محاذاة الأجنة مع رؤساء مواجهة والبطون في مواجهة الحائط الحاد في الحوض الصغير.
وينبغي أن يشمل الحل تريكين كل من طول القاع والسطح الاغاروز شقة، مع الأجنة المقيمين فقط في الحوض الصغير: ملاحظة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن.
- حقن 50-100 الخلايا السرطانية (2-5 NL) في الجيوب الأنفية أمام القلب من الأجنة الزرد باستخدام نظام حقن مكروي الاستغناء.
- إرفاق الإبرة إلى حامل إبرة micromanipulator.
- وضع لوحة الحقن تحت المجسام مع الجدار 60 درجة إلى اليسار والتركيز على الجنين كبير في 25X التكبير.
- ضع micromanipulator بحيث، عندما مددت، الإبرة سوف تخترق الجنين.
- تمديد إبرة بالعين حتى أنه لمس ما يقرب من الجنين.
- أبحث تحت المجهر، محاذاة الإبرة حتى رقبعة سيكون اختراق الجنين على تمديد آخر.
- بيرس الجنين من خلال الكيس المحي وضع غيض فقط في، ولكن ليس في والجيوب الأنفية قبل القلب.
- حقن الخلايا بالضغط على دواسة القدم. قوة الحقن يطرد الخلايا في الجيوب الأنفية القلب. سحب الإبرة.
- استخدام اليد اليمنى، ويمتد ويتقلص إبرة الحقن. مع اليد اليسرى، وجعل تعديلات دقيقة لوضع الجنين القادم.
- العودة الإبرة إلى جرة التخزين الكهربائي أثناء إعداد لحقن وحة أخرى.
- نقل الأجنة إلى طبق الانتعاش مرة واحدة يتم حقن وحة كاملة.
- إمالة لوحة حقن لتجميع الأجنة في الجزء السفلي، وغسل أي الأجنة المتبقية من الحوض الصغير، وجمعها مع ماصة بلاستيكية.
- السماح للأجنة ليستقر في الجزء السفلي من ماصة.
- نقل الأجنة إلى طبق الانتعاش في حجم الحد الأدنى من تريكين.
- Incubaطبق الانتعاش الشركة المصرية للاتصالات عند 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- منفصلة الأجنة الزرد قابلة للحياة من الأجنة الميتة وغيرها من الحطام.
- احتضان الطبق عند 33 درجة مئوية لتصبح جاهزة لتصحيحها، عادة 24-96 ساعة.
ملاحظة: يتم تحديد درجة الحرارة هذه كحل وسط بين 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لخلايا السرطان، و 28.5 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لالزرد.
4. يحرز التسرب
- تخدير دفعة من الأجنة إلى أن سجل عن طريق وضعها في طبق مع حل تريكين.
- وضع اليرقات تخدير على شريحة الاكتئاب المجهر في قطرة من تريكين.
- اليرقات توجيه أفقيا للتصوير الأمثل في المنطقة الذيلية.
- إحصاء عدد الخلايا السرطانية التي غزت بنجاح من الأوعية الدموية من خلال التركيز صعودا وهبوطا من خلال المنطقة ذيل لتبين بوضوح خلايا سليمة.
ملاحظة: من الأفضل أن يكون اثنين على الأقل من الأفراد المشاركين في تيعملية له، حيث الفرد يحرز السمك الأعمى إلى حالة تجريبية يجري تقييم.- يسجل اليرقات على المجهر المركب مضان مع عدسة الهدف 10X. استخدام الهدف 20X عن أي مكالمات الصعبة.
5. الأجنة تصاعد على الشرائح واللاحقة التصوير الإسفار
- تذوب 1.5٪ محلول الاغاروز / تريكين وتقديمهم إلى 37 درجة مئوية.
- تخدير الجنين ليتم تصويرها عن طريق وضعها في محلول تريكين.
- نقل الأجنة في قطرة من حل تريكين إلى السطح التصوير. اختياريا استخدام صحن أو شريحة المجهر والزجاج السفلي.
- استخدام ماصة الزجاج لإزالة حل تريكين الزائد، والإبقاء على الجنين على سطح التصوير.
- تراكب قطرة واحدة من الحل الاغاروز ذاب على الجنين.
- بسرعة، قبل أن تتصلب في الاغاروز، استخدم أداة حساسة، مثل فرشاة رمش، لتوجيه الجنين أفقيا للتصوير، وإعطاء مزيد من الحذرلضمان الجنين وسويت بالأرض على طول سطح التصوير.
- غمر انخفاض الاغاروز بلمرة الآن تحت الحل تريكين.
- تعرض الجنين الزرد يعيش التصوير المجهري.
6. تعديل: حقن الخلايا السرطانية في الكيس المحي من الجنين اسماك الزرد
- إعداد النظام وحقن لوحات حقن مكروي الاستغناء كما هو موضح سابقا في الفقرة (3) من هذا البروتوكول.
- تسمية اثنين من سكان الخلية المتناقضة مع الأصباغ الفلورية كما هو موضح سابقا في الفقرة (2) من هذا البروتوكول.
- حقن 5-10 نيكولا لانغ من 2 × 10 ^ 7 خلية / مل في الكيس المحي. الحفاظ على ثبات الحجم حقن لحقن أعداد الخلايا متطابقة (100-200 الخلايا السرطانية) من كل خلية السكان
ملاحظة: يمكن للمرء أن استخدام الأجنة الزرد شفافة تفتقر الأوعية الدموية الفلورسنت لهذا الاختبار. يمكن التحكم دخول السلبي للجسيمات في الأوعية الدموية للعن طريق حقن الخرز الفلورسنت (<10 ميكرون)، أو تغييرأصلا، وهو خط الخلية التي لا intravsate. - استرداد حقن الأجنة كما هو موضح سابقا في الفقرة (3) من هذا البروتوكول وثم كشف عن حقن ناجحة.
- استخدام المجسام لفحص ونقل الأجنة قابلة للحياة التي تم حقنها بنجاح إلى طبق جديد.
ملاحظة: يجب أن يكون لجميع الأجنة كتلة الحجم باستمرار من الخلايا الموجودة في صفار البيض. يتم تجاهل الأجنة إذا اختلف حجم الشامل أو إذا تقع أي الخلايا خارج صفار البيض. - نقل الأجنة قابلة للحياة إلى طبق جديد إذا تم النظر إلى الخلايا السرطانية بشكل واضح في الكيس المحي.
- استخدام المجسام لفحص ونقل الأجنة قابلة للحياة التي تم حقنها بنجاح إلى طبق جديد.
- احتضان الطبق عند 33 درجة مئوية لتصبح جاهزة لتصحيحها، عادة 24-48 ساعة.
ملاحظة: يتم تحديد درجة الحرارة هذه كحل وسط بين 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لخلايا السرطان، و 28.5 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لالزرد. - ليسجل دخول الوعاء، اتبع الإرشادات الواردة في الفقرة (4) من هذا البروتوكول، ولكن بدلا من ذلك الاعتماد على عدد من جخلايا ancer التي غزت بنجاح في الأوعية الدموية في المنطقة الذيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا اختبار القدرة الغازية الأوعية الدموية من خطوط خلايا سرطان الثدي التي يشيع استخدامها في نموذج جنين الزرد (الشكل 1). تم توظيف معايير صارمة في التهديف تسرب لهذه خطوط مختلفة من الخلايا، حيث احصي الأحداث الإيجابية إلا إذا كانت الخلايا السرطانية قد extravasated بشكل واضح، وهذا يجري القيام به بصورة رئيسية للحد من أي ايجابيات كاذبة التي يمكن أن تنشأ من تسجيل الحطام الخلوي.
وكشف تحليل لدينا خلافات حادة بين السطور عندما تم تقييم الغزو 96 ساعة بعد الحقن في الجيوب الأنفية أمام القلب (الجدول 1). من خطوط الخلايا 7 اختبار والأجنة الزرد حقنوا خط الخلية MDA-MB-231 عرضت على أكبر عدد من الخلايا السرطانية extravasated في الجنين، وهو الاكتشاف الذي يتسق مع طبيعة النقيلي المقبولة من الخط (الشكل 2). كما وجدنا أن BT-474 الخلايا بسهولة طnvaded في المنطقة الذيلية من الأجنة، في حين أن خطوط الخلايا الأخرى، مثل MCF-7، والخلايا SK-BR-3، و T-47D، كان الحد الأدنى الغازية (الشكل 3). وكان اكتشاف الغريب أن ما يقرب من نصف الأجنة الزرد حقن الخلايا MDA-MB-468 زيارتها ذمة في المنطقة كارديال وهذه لم تكن وسجل. ونتيجة لذلك، تم تجاهل عدد من الأجنة المحقونة مع MDA-MB-468 الخلايا قبل وجدنا عينات قابلة للحياة بما فيه الكفاية التي يمكن quantitated للتسرب. وعلى الرغم من هذه الاختلافات المزعومة، فمن الجدير بالذكر أن التسرب حدث مع كل سطر الخلايا السرطانية التي تم اختبارها.
ونتيجة لتعديل مقايسة أمام القلب الجيوب الأنفية، أجرينا تجربة المنافسة حيث تم حقن اثنين من السكان من MDA-MB-231 الخلايا التي تختلف في قدرتها الغازية الأوعية الدموية من 26 في وقت واحد في كيس الصفار من الأجنة النامية. الخلايا MDA-MB-231 نشر في ظل ظروف ثقافة متكدسة السابقة لحقن عرضت انخفاضا في دخول الوعاء إلى الدورة الدموية، وبالتالي كان لها وجود انخفاض في المنطقة الذيلية من الأجنة على التهديف (الشكل 4).
| الخط الخلوي | متوسط # خلايا Extravasated في جنين | نطاق |
| MDA-MB-231 (Subconfluent) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| قدم مكعبة-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
ه = "1"> الجدول 1: مقارنة بين القدرة الأوعية الدموية الغازية من خطوط خلايا سرطان الثدي في الزرد يشيع استخدامها تم حقن خطوط خلايا سرطان الثدي في الجيوب الأنفية أمام القلب من 2 يوما الأجنة الزرد القديمة وسجل 4 أيام. تم quantitated الخلايا السرطانية الغازية من الأوعية الدموية وفي المنطقة الذيلية في 10 الأجنة في خط الخلية. يشار إلى أن متوسط عدد الخلايا السرطانية extravasated جنبا إلى جنب مع مجموعة.
الشكل 1. ملخص مرئي للخلية الزرد سرطان تسرب الفحص. وفي هذا الاختبار، وصفت الخلايا السرطانية مع صبغة الفلورسنت وحقنها في الجيوب الأنفية أمام القلب من 2 يوما الأجنة الزرد القديمة، التي وضعت من قبل مراسل فلوري المتناقضة الأوعية الدموية. بعد 2-4 أيام إضافية، والخلايا السرطانية التي غزت في المنطقة الذيلية للجنين هيوسجل ويمكن تركيبه في المتوسط الاغاروز مخدر للتصوير لاحق. كل خطوة وصفت في هذا يتوافق التخطيطي لقسم من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صورة فسيفساء من الأجنة الزرد بعد 4 أيام حقن مع MDA-MB-231 خلايا. Brightfield (A) وفلوري (ب) الفسيفساء هو مبين. وصفت الصور الفلورسنت مثل إسقاط الحد الأقصى لض المكدس، الذي اللون الأخضر يدل على الأوعية الدموية واللون الأحمر يدل على الخلايا السرطانية. شريط الحجم، 200 ميكرون. (C) هو تضخيم المنطقة الذيلية الجنين لإظهار الخلايا السرطانية extravasated. وينظر منقط وضع العلامات الفلورية على MAGNIFICAنشوئها. شريط النطاق، 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مثال على النتائج التجريبية، وهنا يتجلى التسرب في الجنين حقنها بخلايا سرطانية BT-474 ولكن ليس في الجنين حقنوا قدم مكعبة-7، SK-BR-3، و T-47D الخلايا السرطانية. النصال دلالة خلايا extravasated. شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. دخول الوعاء من بالسكان خلية MDA-MB-231 2 أيام بالعربيةثالثا الكيس المحي حقن. (A) صفار كيس مع الأخضر (الغازية) والأحمر (أقل الغازية) وصفت الخلايا 231 MDA-MB. (ب) المنطقة الذيلية مع MDA-MB-231 الخلايا التي غزت الأوعية الدموية ليصل إلى الذيل المنطقة (C) عدد الأجنة الزرد مع intravasated MDA-MB-231 الخلايا في المنطقة الذيلية 2 أيام بعد الحقن 26. الحانات الحجم، 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية تستخدم نموذج الزرد لاختبار كفاءة القدرة الغازية الأوعية الدموية لخلايا السرطان (انظر الشكل 1). نحن هنا تطبيق هذه التقنية لفريق من خطوط خلايا سرطان الثدي من أجل توفير قاعدة على الذي المحققين الآخرين ويمكن بعد ذلك بناء الدراسات الخاصة بها (انظر الجدول 1؛ الأرقام 2-3). إن الملاحظة التي MDA-MB-231 الخلايا غزت بسهولة في المنطقة الذيلية من الأجنة الزرد جعل هذا الخط خلية مثالية لاختبار العوامل التي قد تحول دون غزو الأوعية الدموية. خطوط الخلايا نسبيا أقل الغازية، مثل HCC1806 أو MDA-MB-468 الخلايا على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم لدراسة العوامل التي من شأنها تحفيز خلاف ذلك غزو الأوعية الدموية. إذا كانت هذه الأنواع من التجارب تتطلب إدراج المخدرات، ثم واحد لديه طريقين متميزة من التسليم، اعتمادا على ما إذا كان من المتوقع أن تكون دائمة تأثير العلاج. الخلايا السرطانية يمكن سابقة التجهيز مع الدواء قبل الحقن فيالأجنة أو الدواء يمكن أن تضاف مباشرة إلى الماء والإسكان الأجنة حيث أنها سوف تؤثر على الخلايا السرطانية عن طريق الانتشار.
في مقارنة لدينا، قمنا بتحليل تسرب الخلايا السرطانية في ذيل الجنين الزرد 96 ساعة بعد الحقن في الجيوب الأنفية أمام القلب. لMDA-MB-231 فحص المنافسة الخلية، وجرى تقييم دخول الوعاء للتداول 48 ساعة بعد الحقن الكيس المحي. وtimepoints المختارة للتحليل عادة ما تتطلب الأمثل لكل خط الخلية حيث، بالنسبة لبعض التجارب، ويمكن أن تحدث ذروة التسرب فقط 24 ساعة بعد الحقن. ومن الجدير بالذكر أن الأجنة الزرد لديها نظام المناعة الفطري وظيفية عندما يتم حقنها بخلايا سرطانية 27، وبالتالي الحطام الفلورسنت من الخلايا السرطانية قد عصفت بها الخلايا المناعية مثل الضامة أو العدلات. وبالتالي يمكن أن نشاط الجهاز المناعي الفطري يحتمل خلق وضع العلامات الفلورية إيجابية كاذبة عند محاولة تسجيل extravasatأيون. يجب أن تعطى الرعاية ليسجل فقط الخلايا التي يتألق بقوة في القناة المناسبة. منذ أبحاث السرطان الحالي تورط جهاز المناعة في تعزيز سرطان خبيث 28، قد توفر نموذج جنين الزرد رؤى فريدة من نوعها في هذا المجال من خلال السماح للفحص من الحديث المتبادل التي تحدث بين الخلايا السرطانية ونظام المناعة الفطري. ويتمثل هذه الفكرة من قبل اثنين من الدراسات التي أجريت مؤخرا. أولى هذه الدراسات أثبتت أن VEGFR تثبيط داخل الزرد تعزيز قدرة العدلات للحصول السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية 29. وأظهرت دراسة ثانية أن chemokine المناعة CXCR4-CXL12 يشير محور سليمة في الزرد، كما كان على مستقبلات خلايا سرطانية بشرية قادرة على استشعار والاستجابة ليجند الزرد 30، والتعبير عن CXCR4 في خلايا السرطان ترتبط مع قدرتها الغازية في نموذج حيواني. وعلاوة على ذلك، وقد تبين أن الضامة الزرد exhibiتيد استجابة الكيميائي نحو CXCL12 البشري. سلالة الجنين الزرد مع العدلات fluorescently المسمى 31، على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم لاستكشاف التفاعلات الخلايا السرطانية مع نظام المناعة في هذا النموذج.
تتطلب خطوات قليلة في بروتوكول اهتماما خاصا. أولا، من الضروري أن يتم فصل الخلايا السرطانية في تعليق وحيد الخلية من أجل منع انسداد الإبرة خلال الحقن في الأجنة. يمكن المجاميع الخلوية أيضا عرقلة تدفق الدم وتتداخل مع قدرة الخلايا السرطانية على السفر إلى المنطقة الذيلية، مما جعل التحليل. المجاميع الخلوية قد تحفز أيضا الأوعية الدموية للتمزق، وإذا حدث هذا، وسجل القدرة الغازية من الخلايا السرطانية الحية في هذه المناطق ولا يمكن الاعتماد عليها ولا الموصى بها. تتعلق المنطقة مشكلة محتملة أخرى لوصفها الخلايا السرطانية مع صبغة الفلورسنت. في التجارب التي تديرها مختبرنا، وجدنا أن الأصباغ محبة للدهون،مثل الجاذبة على سبيل المثال، تميل إلى إنتاج أفضل العلامات، ولكن مستوى مضان لها يمكن أن تختلف بين خطوط الخلايا. لهذا السبب، يجب أن يكون الأمثل لوضع العلامات الفلورية الخلايا السرطانية قبل حقنها في أجنة من أجل منع الإفراط في وصفها. ومن الأهمية بمكان أن الصبغة وجرفت من الخلايا السرطانية بعد أن يكونوا قد وصفت، وهذا يتحقق من خلال مختلف الخطوات الطرد المركزي هو مبين في قسم العلامات على البروتوكول. قد تبدو هذه الخطوات لزوم لها، لكنها ضرورية للغاية. الكثير من صبغة الفلورسنت يمكن أن تكون سامة للخلايا أو تتسرب إلى مجرى الدم، وإنتاج خلفية الفلورسنت مصطنعة. العديد من هذه القضايا يمكن التحايل عليها من خلال استخدام الخلايا السرطانية معربا عن البروتينات الفلورية، وينصح أن يتم توظيف هذه الأنظمة بدلا من صبغة الفلورسنت عندما يكون ذلك ممكنا. وأخيرا، عندما سجل الأجنة لتسرب السرطان، لا بد من تطبيق معايير ثابتة لجميع الظروف. نجد عشرإلى إشراك اثنين على الأقل من الأفراد في خطوة التهديف يساعد في الحفاظ على الدقة العلمية: يتم تكليف شخص واحد مع إعداد الشرائح وتسجيل النتائج، في حين أن شخص آخر يجعل الحكم التسرب ويتم الاحتفاظ أعمى للحالة التي يتم تقييمها. عندما سجل، يمكن للمرء إما quantitate الخلايا السرطانية extravasated في منطقة الذيل أو إنشاء معايير الثنائية لسهولة المقارنة. Fluorescently صبغ الخلايا السرطانية تنتج العلامات منقط التي من شأنها أن تكون واضحة في عالية جدا التكبير (الشكل 2C)، على الرغم من الخلايا الكاملة هي أسهل للتمييز في أقل التكبير (الشكل 3)، فمن المستحسن وهذه الأخيرة التي لالتهديف. الحكم على الحالات الأكثر غموضا من التسرب قد ساعد على اكتساب شرائح الضوئية على المجهر متحد البؤر، حيث quantitating تسرب كنسبة مئوية من جميع الخلايا في منطقة الذيل قد سيطرة على تحميل غير المتكافئ للالخلايا السرطانية في الجنين.
يوLK كيس طريق حقن يختلف عن الجيب أمام القلب لأنها تسمح لعدد أكبر من الخلايا وبالتالي أفضل يستوعب عدم التجانس بين السكان الخلية. كما هو مبين في الشكل (4)، العديد من السكان الخلية المسمى تفاضلي يمكن حقن في وقت واحد في الكيس المحي للمقارنة قدرتها الغازية ونمط. القدرة عائية من حقن الخلايا وتعزيز توظيف الأوعية الدموية قد تسهل دخول الخلايا السرطانية في منطقة الذيل ولكن لم يتم تحليل هذا الجانب. من الناحية الفنية، صفار حقن SAC هي أسهل للأداء من حقن أمام القلب الجيوب الأنفية على الرغم، من ناحية أخرى، فإن الكيس المحي هي بيئة غنية بالعناصر المغذية التي قد تعيق خروج من الخلايا السرطانية. ومن الممكن أيضا أن حقن قرب الأوعية الدموية في صفار البيض قد يعرض قبل الأوان الخلايا السرطانية في الدورة الدموية، وبالتالي، لا بد من فحص بعناية لحقن فاشلة وتغفل هذه الأجنة من التهديف. وأخيرا، فإنه من المهم رس ملاحظة أن المكروية صفار مفتعلة إلى حد ما، كما أنها تفتقر إلى الموقع الأساسي مماثل في الفئران أو البشر.
نظم نموذج المختلفة التي تسعى إلى التنبؤ سرطان خبيث لا تخلو من مزاياها وعيوبها، وتسرب فحص الزرد ليست استثناء. كما ميزة كبيرة، هذا الاختبار يسمح لتقييم قدرة الغازية الأوعية الدموية في نظام الدورة الدموية وظيفية والأسئلة التجريبية يمكن الإجابة بعد بضعة أيام فقط. ونظرا للوقت التحول السريع، ويمكن استخدام هذا النظام للتحقيق في السلوك العدواني من خطوط الخلايا أنشئت فحسب، ولكن أيضا المعزولة حديثا عينات من مرضى السرطان البشري. العيب الرئيسي هو أن هذا النموذج يغفل أقرب وقت وآخر الأحداث من تتالي المتنقل من خلال التركيز فقط على غزو الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا السرطانية البشرية تحقن هذه الأجنة الزرد من الواضح لا تعمل في الوسط مسانج وبعض التفاعل مع تيانه سدى قد بالتالي تضيع. وعلى الرغم من هذه القيود، ونموذج جنين الزرد لديه مكان جدارة في كل من البحوث الأساسية ومتعدية السرطان، ولقد استخدمنا أن تظهر دور للفرس النهر إشارات الطريق 26 ويرتبط بروتين الكيراتين 5-5 32 في قدرة الغازية الأوعية الدموية من السرطان الخلايا. ومن هنا، وهذا النموذج لديه القدرة على مساعدة التحقيق في سمة مميزة النقيلي الرئيسية لسرطان مرحلة متقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
