Summary
这种方法利用斑马鱼的胚胎以有效地测试癌细胞的血管侵袭能力。荧光癌细胞注射到发育中的胚胎的precardiac窦或卵黄囊。癌细胞血管浸润和渗出通过尾部区域的荧光显微镜24至96小时后评估。
Introduction
转移性疾病是癌症死亡率和许多机制，使癌细胞传播有待发现1的一个主要原因。为了使癌细胞成功转移，它首先必须通过围绕一个原发肿瘤中，输入（intravasate）进入循环系统基质侵入，生存在从循环中转，出口（渗出），最后建立一个可行的菌落在远处器官的网站2。血管内和外渗因此在转移级联关键步骤，但每一个癌细胞是不是破坏，并通过内皮连接3迁移本身娴熟。事实上，有一系列的周围癌细胞的血管侵袭和方法可以通过多种4内源性和外源性因素的进一步影响独特的选择压力。由于这些原因，该探头的晚期癌症的攻击行为技术通常专注上的vascular浸润能力作为一种手段来预测转移扩散。
各种模型系统中，以方便癌细胞血管浸润的体外研究。 在体外测定法中最常用的涉及任一的transwell系统通过内皮屏障5或电动细胞-基底阻抗传感（ECIS）技术评估癌症细胞迁移并监控由癌细胞6完整内皮单层的实时中断。这些测定通常缺乏流体动力学和基质因素，否则将影响癌细胞附着到内皮壁上。这个问题在某种程度上被从内皮细胞的三维培养与出现支持基质细胞perfusable血管网络规避，而这些3D微流体系统现在代表目前在体外选项7,8前列。尽管如此，这些方法省略官能循环系统的鲁棒微因此只在体内模型中部分替代品。
最广泛使用的血管浸润的体内模型是鼠标，其中因为它们发生在相对短的时间尺度，并且一般指示转移能力9实验性转移测定法，通常进行。这些分析包括直接注入肿瘤细胞进入流通，因此转移，器官即外渗和癌细胞定植结束阶段模型。实验转移测定不同根据肿瘤细胞注射的部位和器官，最终分析。在第一测定类型，癌症的细胞注射到小鼠和癌细胞播种在肺部尾静脉监视10,11。第二测定涉及执行腔内注射直接朝向骨微环境12-14转移性播种，而且脑15。在第三个实验中，癌症Ç厄尔注入脾脏以允许肝脏16的定植而第四传送路径进入颈动脉进行癌细胞到大脑17,18。无论癌细胞交货方式，器官殖民化是接受实验的端点，一般是通过发光，组织学，或基于PCR的技术来确定。尽管小鼠主机中进行实验测定转移的生理优势，这些实验仍然需要几个星期到几个月才能完成和分析。
斑马鱼（ 斑马鱼 ）模型最近出现的一个新的系统来研究癌症进展19,20，并允许癌细胞血管浸润过短得多的时间尺度的功能循环系统内的评估时，小鼠相比，21-24。该方法利用有其内皮标记有一个绿色的珊瑚暗礁FLUO透明斑马鱼品系rescent蛋白报告由kdrl启动子，血管内皮生长因子25的斑马鱼受体驱动。在测定中，癌细胞被标记有红色荧光标记物，并注入2日龄胚胎precardiac窦。间48到96小时的任何地方的注射后，即已经侵入了脉管的和成胚胎的尾部区域癌细胞可以有效地在荧光显微镜评分。在这里，我们采用的技术中常用的人乳腺癌细胞系组成的小组，证明他们的血管侵袭能力明显的差异。此外，我们证明，改变注射部位的胚胎卵黄囊允许异质细胞相互作用的研究，如癌症的细胞群可以用荧光染料进行差异标记，并注射入缺乏荧光脉管斑马鱼的胚胎。在后一种测定法中，已经侵入蛋黄和癌细胞intravasated入vasculaturE分别打进尾区域24注射后48小时。由于该模型的有效性和方便性，斑马鱼日益用于快速测试下一个生理设置癌细胞的血管侵袭能力。
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Protocol
伦理学声明：根据经批准的协议IACUC产生了斑马鱼的胚胎。这些实验是在遵守进行与由乔治城大学动物护理和使用委员会的建议。
1.组织胚胎注射和创建库存解决方案
- 生成必要的斑马鱼来评估癌细胞血管浸润。
- 设置成对或组交叉交配与TG（kdrl：grcfp）的Zn1; mitfa b692; ednrb1 B140鱼。
注：我们产生的Tg（kdrl：grcfp）的Zn1; mitfa b692; ednrb1 B140斑马鱼，通过杂交的Tg（kdrl：grcfp）的Zn1 25，表达绿色礁珊瑚荧光蛋白在血管内皮细胞，与缺乏色素细胞线，mitfa b692; ednrb1 B140，在斑马鱼国际资源中心开发的。 - 有限公司llect鸡蛋，清洁，清除未受精或胚胎畸形22的第二天。
- 孵育28.5℃，胚胎直到准备注射癌细胞，发生在斑马鱼的胚胎是2天受精后（2 DPF）。
- 设置成对或组交叉交配与TG（kdrl：grcfp）的Zn1; mitfa b692; ednrb1 B140鱼。
- 使注射板。
- 熔体25毫升1.5％琼脂糖在卫生署2 O每个板。
- 倾12毫升琼脂糖成100毫米×15毫米培养皿中，并让它变硬。
- 再融化，然后倒入盘剩余的琼脂糖。
- 所以，它是在一个30度角的琼脂糖和定位在板的中心立即放置一个切玻璃模具（3毫米×7.2厘米宽×7.5cm的长）。
注意：这将创建一个陡峭的60°墙和一个30°的倾斜坡道。 - 胶带代替玻璃模具和让琼脂糖变硬。
- 轻轻地取出玻璃模具，小心不要撕破琼脂糖。
注：模具可在4℃保存在卫生署2 O。
- 平衡注射板鱼水（0.4克/升海盐）。
- 漂洗板用蒸馏水两次。
- 通过加入10ml鱼水到板并置于摇床进行10分钟平衡板。
- 平衡板的第二时间与鱼的水。
- 他们转移到含有鱼水22菜肴拆分2天受精后（DPF）的胚胎成注射液组。
- 准备恢复菜肴为每个组注射后利用。确保恢复培养皿含有10毫升鱼水，加青霉素（25微克/毫升）和链霉素（50微克/毫升）。
- 通过加入4毫升缓冲三卡因库存（4毫克/毫升，10毫摩尔Tris，pH 7）中的50毫升鱼水加青霉素和链霉素的制备2倍三卡因溶液。
- 溶解15mg的低熔点琼脂糖在10毫升的2×三卡因溶液以生成将固定为IMAGIN活胚胎的安装麻醉介质G。
注意：安装介质由1.5％琼脂糖。 - 拉显微注射针。
- 将玻璃毛细管垂直吸管拉马。拉，用20毫安的电流和一个2线圈的加热元件长锥形移液器。
2.标签癌细胞与亲脂性荧光染料
- 维持癌细胞推荐的培养条件。
注意：这些系在DMEM中维持+ 10％FBS：BT-474，MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，和SK-BR-3。这些系维持在RPMI + 10％FBS：肝癌1806和T-47D。所有细胞系培养过程中维持在 37℃和5％ 的 CO 2。 - 产生由解离的癌细胞的贴壁培养的单细胞悬浮液。
- 第一洗涤细胞用PBS，然后用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液处理。
注：胰蛋白酶的曝光时间将取决于细胞系。 - 中和本身具有的胰蛋白酶溶液细胞培养基细胞分离后含朗姆酒。
- 第一洗涤细胞用PBS，然后用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液处理。
- 离心胰蛋白酶中和的细胞悬浮液5分钟，在200 xg离心，然后重新悬浮于细胞计数在新鲜培养基中的细胞沉淀。
- 使用自动计数器计数细胞悬液，并在200微升的细胞培养基的制备1百万个细胞。
- 验证与注入斑马鱼胚胎前，台盼蓝染色细胞活力。
注：只有活细胞群应注入斑马鱼胚胎，注射死细胞不会反映真实血管侵犯。
- 验证与注入斑马鱼胚胎前，台盼蓝染色细胞活力。
- 添加2微升的红色亲脂性染料的癌症细胞悬浮液以1：100稀释，拌匀，然后在37℃孵育该混合物20分钟。
注：的染料和标记时间浓度可能需要对每个细胞系进行优化。 - 继温育后，加入1毫升的新鲜培养基的试管中，然后离心5分钟200×g的。
- 从肿瘤细胞洗去残留荧光染料。
- 抽吸从细胞沉淀上清，重悬在1ml新鲜培养基的沉淀，并离心，在200×g下5分钟。
- 再次吸出上清液，重悬细胞沉淀在1ml新鲜的培养基，然后离心机在200×g下5分钟：重复洗涤步骤的第二时间。
- 再次吸出上清液，重悬细胞沉淀在1ml新鲜的培养基，然后离心机在200×g下5分钟：重复洗涤步骤三次。
- 吸出上清液，重悬含有百万标癌细胞于500μl新鲜培养基的细胞沉淀。
注：0.5mM EDTA的可以被添加到媒体，以防止细胞聚集。
3.注射癌细胞进入斑马鱼胚胎的预心脏窦
- 附上显微注射配制系统到加压空气源和打开第Ë显微注射配送系统电源。
- 通过压下脚踏板测试压力。空气的简单脉冲应持针器发射。
- 与2X三卡因液平衡注射板的两倍。
- 对于每一个平衡步骤，加入20毫升2×三卡因溶液的注入板和地点上摇动10分钟。
- 用塑料吸管一组胚胎转移到含有2个三卡因溶液一小碟。
- 回填显微注射注射针与使用凝胶加载吸管尖癌细胞。
- 放置针与朝下使细胞定居尖端尖端的电极存储罐。
- 转移20 - 30麻醉胚胎到注入板通过收集用大量2X三卡因的胚在一个塑料吸管。
- 允许胚胎在吸管尖沉降。
- 根特LY驱逐胚胎进入注入板的槽，沿所述槽的长度传播的胚胎。
- 对准朝上对着槽的陡壁头和肚子的胚胎。
注：三卡因溶液应包括两个槽长度和平坦琼脂糖的表面上，胚胎仅居住在低谷。现在胚胎准备注射。
- 注入50 - 100癌细胞（2 - 5 NL）到使用显微注射配制系统的斑马鱼胚胎的precardiac窦。
- 针连接到一个显微的针保持器。
- 立体镜下注射板60度墙的左侧位置，并专注于顶级胚胎在25倍的放大倍率。
- 显微操作的位置，这样，当延长，中针会刺破胚胎。
- 由眼延长针，直到它接近触摸胚胎。
- 在显微镜下看，对准针这么牛逼帽子就会刺破后，进一步延伸胚胎。
- 皮尔斯通过卵黄囊胚胎放置尖端刚好在，但不是在中，预心脏窦。
- 通过压下脚踏注入细胞。喷射的力排出该细胞进入心脏窦。退针。
- 使用右手，伸出和缩回的注射针。用左手，进行微调下胚胎定位。
- 返回针电极瓶子储存在设置注入另一个板块。
- 胚胎转移到恢复菜一旦整个板被注入。
- 倾斜喷射板的底部汇集的胚胎，洗涤任何剩余的胚胎出槽，并与该塑料吸管收集它们。
- 允许胚胎在移液管的底部沉降。
- 胚胎转移到恢复盘中三卡因的最小体积。
- Incuba在28℃下1小时TE恢复盘。
- 独立可行的斑马鱼胚胎的死胚等杂物。
- 孵育33°C盘，直到准备进行打分，通常为24 - 96小时。
注意：此温度被确定为37℃，对癌细胞的理想温度，和28.5℃，斑马鱼提供了理想的温度之间的折衷。
4.外渗评分
- 麻醉批次胚胎通过将它们放置在与三卡因溶液菜进行评分。
- 广场上的凹陷显微镜载玻片的麻醉幼虫三卡因的下降。
- 东方幼虫为横向尾地区的最佳成像。
- 算已经成功通过聚焦上下通过尾区域清楚地辨别完整细胞侵入出脉管的癌细胞的数目。
注意：最好是有参与T至少有两个人他的过程，其中个人得分鱼是盲目的实验条件下被评估。- 分数与10倍物镜的复合荧光显微镜的幼虫。使用20倍的目标任何困难的呼叫。
5.安装胚胎到幻灯片和随后的荧光成像
- 熔融1.5％琼脂糖/三卡因溶液，并把到37℃。
- 麻醉胚胎通过将其放置在三卡因溶液进行成像。
- 在三卡因溶液到该成像表面一滴转移胚胎。 （可选）使用玻璃底盘或显微镜载玻片。
- 使用玻璃吸管以除去过量的三卡因溶液，保持在成像表面上的胚胎。
- 叠加在胚胎熔化琼脂糖溶液一滴。
- 很快，琼脂糖聚合之前，用细腻的工具，比如睫毛刷，横向定位胚胎成像，给予额外的照顾以确保胚胎沿着成像表面平坦化。
- 淹没在三卡因溶液聚合现在琼脂糖下降。
- 若使活斑马鱼胚胎显微成像。
6.修改：注射癌细胞进入斑马鱼胚胎卵黄囊
- 如先前在本协议第（3）所述，准备显微注射配送系统和注射板。
- 标签中的两个细胞群与先前在本协议第（2）所述的对比荧光染料。
- 注入5 - 10 NL的2×10 ^ 7个细胞/ ml到卵黄囊。保持注射体积恒定注入相同的细胞数目 - 从每个细胞群体（100 200癌细胞）
注：我们可以用荧光缺乏血管这个实验透明斑马鱼的胚胎。颗粒的被动进入脉管可通过注入荧光珠（<10微米），或者被控制为，改变本身，即不intravsate的细胞系。 - 如前面部分所述（3）此协议中，然后筛选成功注射恢复注射的胚胎。
- 使用立体镜筛选并传送被成功注入了新的活力菜的胚胎。
注：所有的胚胎应该位于卵黄细胞的一贯大小的肿块。如果质量尺寸不同或胚胎被丢弃，如果任何细胞位于卵黄以外。 - 转移存活的胚胎到新的培养皿如果癌细胞在卵黄囊清楚地看到。
- 使用立体镜筛选并传送被成功注入了新的活力菜的胚胎。
- 孵育33°C盘，直到准备进行打分，通常为24 - 48小时。
注意：此温度被确定为37℃，对癌细胞的理想温度，和28.5℃，斑马鱼提供了理想的温度之间的折衷。 - 得分血管内，按照一节所述的指导原则（4）本协议的，而是算数cancer细胞已经成功地侵入到尾区的脉管。
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Representative Results
在这里，我们测试了在斑马鱼胚胎模型常用乳腺癌细胞系（ 图1）的血管侵袭能力。严格的标准在得分外渗被用于这些不同的细胞系，其中，如果癌细胞已经明确外渗积极事件只算的，这之中主要是做以限制可从得分细胞碎片出现的任何误报。
我们的分析显示，该线之间明显的差异时侵入被注入precardiac窦（ 表1）后96小时进行评估。测试了7细胞系，用MDA-MB-231细胞系注射斑马鱼的胚胎显示出的最大数量每个胚胎外渗癌细胞，这一发现是与该行的接受转移性性质（ 图2）一致。我们还发现，BT-474细胞容易我nvaded入胚胎的尾部区域，而其它细胞系，如MCF-7，SK-BR-3和T-47D细胞中，分别为微创（ 图3）。一个奇怪的发现是，大约有一半与MDA-MB-468细胞注射的斑马鱼胚胎中的心肌区域有水肿，这些都没有进球。因此，在我们发现足够可行标本可能被定量为外渗一批具有MDA-MB-468细胞注射的胚胎被丢弃。尽管这些表面上的差异，这是值得注意的外渗发生与测试的每个细胞系。
作为一个变形例的precardiac窦测定中，我们进行了竞争实验，由此，在他们的血管侵袭能力26不同的MDA-MB-231细胞的两个群体被同时注射到发育中的胚胎的卵黄囊。现有汇合培养条件下增殖的MDA-MB-231细胞注射表现出在血管内的减少进入循环，因此不得不在胚胎的尾部区域时得分减少的存在（ 图4）。
| 细胞系 | 平均。每个胚胎＃渗出细胞 | 范围 |
| MDA-MB-231（汇合） | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
表1：斑马鱼乳腺癌细胞的血管侵袭能力的常用的乳腺癌细胞系注射到2日龄斑马鱼胚胎的precardiac窦打进4天后的比较 。癌细胞从血管并进入尾区侵入在每个细胞系10胚胎定量。外渗癌细胞的平均数目与范围一起表示。
图 1. 斑马鱼癌细胞外渗检测的视觉综述。在该测定中，癌细胞被标记有荧光染料，并注入2日龄斑马鱼胚胎的precardiac窦，其脉管由对比荧光报道标记。以下2 - 4额外的天数，已侵入胚胎的尾部区域癌细胞刻痕，并且可被安装在用于随后的成像麻醉琼脂糖介质。在这个示意图对应于该协议的部分描述了每一个步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. MDA-MB-231细胞注射后第4天，斑马鱼胚胎的图像拼接。明场（A）和荧光（B）所示的马赛克。荧光图像被描绘为的z堆栈的最大投影，其中绿色滤色表示脉管和一个红色表示癌细胞。比例尺，200μm以下。（C）中胚胎的尾部区域被放大，以显示外渗癌细胞。在放大倍率点状荧光标记被认为是化。比例尺，50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3 的实验结果的实施例。在这里，外渗是表现在与BT-474肿瘤细胞注射，但不与MCF-7，SK-BR-3和T-47D癌细胞注射胚胎的胚胎。箭头表示渗出细胞。比例尺，100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. MDA-MB-231细胞群的血管内2天AF之三卵黄囊注射剂（A）卵黄囊绿色（侵入）和红色（微创）标记的MDA-MB-231细胞（B）与MDA-MB-231细胞的尾部区域的侵入血管到达尾部区域（C），斑马鱼胚胎intravasated的MDA-MB-231细胞在尾部区域的数目注射26 2天之后。比例尺，250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这种技术利用了斑马鱼模型来有效地测试癌症细胞（参见图1）的血管侵袭能力。在这里，我们采用的技术的乳腺癌细胞系的组，以提供一个基线到其上其他研究者然后可以建立他们自己的研究（ 见表1; 图2 - 3）。该MDA-MB-231细胞很容易地侵入到斑马鱼胚胎的尾部区域观察会使该细胞系适用于测试可能抑制血管浸润剂。相对较少创伤的细胞系，像HCC1806或MDA-MB-468细胞，例如，可以采用以研究，否则使可能血管浸润的因素。如果这些类型的实验需要的药物的包容，则一个具有输送的两个不同的途径，这取决于治疗效果是否预期是耐用。癌细胞可以用药物之前，注入进行预处理胚胎或药物，可直接加入到水容纳胚胎在那里将通过扩散影响癌细胞。
在我们的比较中，我们分析了癌细胞外渗在斑马鱼胚胎尾部注入precardiac窦后96小时。对于MDA-MB-231细胞的竞争测定法中，血管内进入流通被评定卵黄囊注射后48小时。选择用于分析的时间点通常需要为其中对于一些实验中，峰外渗可发生在注射后仅24小时每个细胞系的优化。值得一提的是，斑马鱼胚胎具有功能性先天免疫系统时，他们与癌细胞27，因此，从肿瘤细胞的荧光碎片可能由免疫细胞如巨噬细胞或嗜中性粒细胞吞噬注入。试图得分extravasat时先天免疫系统的活性可因此潜在地创建假阳性荧光标记离子;护理必须给予只得分，在适当的信道稳健地发出荧光的细胞。因为目前的癌症的研究暗示在增强癌症转移28免疫系统，斑马鱼胚胎模型可通过允许对肿瘤细胞和先天免疫系统之间发生的串扰的检查提供了独特的见解这个区域。这种想法是通过几个最近的研究的举例说明。第一这些研究表明，斑马鱼中的VEGFR抑制作用增强嗜中性粒细胞的引发从癌细胞29转移行为的能力。另一项研究表明，CXCR4-CXL12免疫趋化因子信号轴是斑马鱼中完好无损，作为人类癌症细胞上的受体是有能力检测和响应斑马鱼配体30，并与他们的侵袭能力相关CXCR4在肿瘤细胞中的表达动物模型内。此外，有人证明斑马鱼的巨噬细胞exhibi泰德对人类CXCL12趋化反应。斑马鱼胚胎应变与荧光标记的嗜中性粒细胞31，例如，可以利用以进一步探讨与此模型中的免疫系统的癌症细胞的相互作用。
在协议中的一些步骤需要特别注意。首先，它是必不可少的癌细胞中，为了防止注射到胚胎中堵塞针离解成单细胞悬浮液。细胞聚集也可以阻止血液流动，并与癌细胞对行进到尾区，从而扭曲分析中的能力。细胞聚集还可能诱发血管破裂，并且如果这种情况发生时，进活的癌细胞的这些区域中的侵袭能力既不可靠也不推荐。另一个潜在的问题区域涉及用荧光染料标记的癌细胞。在由我们的实验室中进行实验，我们已经发现亲脂性染料，像的DiI例如，往往会产生最佳的标记，但其荧光水平可细胞系之间变化。出于这个原因，癌细胞的荧光标记应注入胚胎之前，以防止过贴标优化。至关重要的是，过量的染料洗涤从癌细胞离开它们被标记后，并且这是通过在该协议的标签部分所指示的各个离心步骤实现;这些步骤可能是废话，不过他们是绝对必要的。太多的荧光染料可以是细胞毒性或泄漏进入血液，产生一个人为的荧光背景。许多的这些问题可以通过使用表达荧光蛋白的癌细胞被规避，并建议，这些系统以代替荧光色素可以使用可能时。最后，得分为癌症外渗胚胎时，必须应用一致的标准，所有条件。我们发现第在得分步骤涉及至少两个个体有助于保持科学严谨：一个个体的任务是准备幻灯片和记录结果，而其他个体呈现外渗判决并保持盲目的条件进行评估。得分时，可以既定量外渗癌细胞在尾部区域或为便于比较，创建二进制标准。荧光染色癌细胞产生点状标签，就可以在非常高的放大倍数（ 图2c）可见，尽管全细胞更容易在较低的放大倍率（ 图3），以辨别，被推荐用于得分其中后者。判断外渗的更模糊的情况下可通过在共焦显微镜，其中定量外渗如在尾部区域的所有细胞的百分比可以控制为不相等的加载癌细胞进入胚胎采集光学片来辅助。
哟LK囊注射途径是从precardiac窦不同，因为它允许更高数量的细胞，因此，更好的适应的细胞群内的异质性。如在图4中所示，若干差异化标记的细胞群，可以同时注入卵黄囊比较其侵袭能力和图案。注射细胞的管腔形成能力和增强的血管的募集可以便于癌细胞进入尾区，但该方面尚未进行分析。从技术上讲，卵黄囊注射相比，是容易precardiac窦注射虽然执行，另一方面，卵黄囊是一种营养丰富的环境中，可能会阻碍癌细胞的出口。它也可能是注射邻近血管中的蛋黄可能过早地引入癌细胞进入循环，因此，必须仔细筛选拙劣注射和射门省略这些胚胎。最后，重要的是吨Ø注意，蛋黄微环境是有点人为的，因为它没有在小鼠或人类类似的主站点。
寻求预测肿瘤转移的各种模型系统并不是没有自己的优势和劣势，以及斑马鱼外渗法也不例外。作为一个主要的优势，此法允许的血管侵袭能力的功能循环系统内的评估和实验的问题可以经过短短几天来回答。给定的快速周转时间，这样的系统可被用来探测不仅建立的细胞系的攻击行为，而且新鲜分离自人癌患者的样品。主要缺点是，这种模式由单纯注重血管侵犯省略转移级联的最早和最晚的事件。此外，注入这些斑马鱼胚胎的人类癌细胞显然不是在同基因和环境相互作用的一些与T运营他基质可能因此丢失。尽管存在这些限制，斑马鱼胚胎模型在基础和转化癌症研究当之无愧的地方，因为我们采用它显示了河马一个角色在癌症的侵袭性血管能力，信号通路26和角蛋白相关蛋白32 5-5细胞。因此，这种模式有帮助的晚期癌症的关键转移性特点的调查的潜力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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