Summary
בשיטה זו משתמשת עוברי דג זברה כדי לבדוק ביעילות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים. תאים סרטניים פלורסנט מוזרקים לתוך שק סינוס או חלמון precardiac של עוברים בפיתוח. פלישת תאים סרטניים כלי דם extravasation נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אזור הזנב 24 כדי 96 שעות מאוחר יותר.
Introduction
מחלה גרורתית הוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה מסרטן ומנגנונים רבים המאפשרים הפצת תאים סרטניים להישאר להתגלות 1. על מנת תא סרטני לשלוח גרורות בהצלחה, צריך קודם לפלוש דרך stroma שמקיפה גידול ראשוני, זן (intravasate) לתוך מערכת הדם, לשרוד במעבר, יציאה (extravasate) מהמחזור, ולבסוף להקים מושבת קיימא ליד העוגב באתר 2 הרחוק. Intravasation ו extravasation הם ובכך צעדים מכריעים המפל גרורתי, ובכל זאת כל תא סרטני הוא לא מיומן מטבעו לשבש נודדות דרך צומת אנדותל 3. למעשה, יש שורה של לחצי מבחר ייחודיים מקיפי פלישת כלי דם תאים סרטניים ואת התהליך יכול להיות מושפע יותר על ידי מגוון של גורמי אנדוגני אקסוגניים 4. מסיבות אלה, טכניקות לחקור את ההתנהגות האגרסיבית של סרטן בשלב מתקדם לעתים קרובות להתמקד נascular יכולת פולשנית כאמצעי לחיזוי התפשטות גרורתית.
מערכות מודל שונות קיימות כדי להקל על המחקר של פלישת כלי דם תאים סרטניים במבחנה. לכל היותר בשימוש מבחני חוץ גופייה לכלול הן מערכות transwell להעריך נדידת תאים סרטניים באמצעות מחסום אנדותל 5 או תא-המצע חשמלי חישת עכבה (ECIS) בטכנולוגיה כדי לפקח על השיבוש בזמן האמת של monolayer שלם אנדותל ידי תאים סרטניים 6. מבחנים אלו בדרך כלל חסרים את הדינמיקה של נוזלים וגורמים סטרומה שאחרת להשפיע מצורפים תאים סרטניים לקיר האנדותל. בעיה זו לעקוף במידה מה על ידי רשתות כלי דם perfusable שעולות מן תרבות 3D של endothelia עם תאים תומכים סטרומה, ומערכות microfluidic 3D אלה מהוות כיום בחזית האפשרויות הנוכחיות במבחנת 7,8. ובכל זאת, גישות אלה להשמיט את המיקרו-הסביבה החזקה של מערכת דם פונקציונליתולכן רק תחליף חלק עבור מודלים in vivo.
הנפוץ ביותר במודל vivo של פלישת כלי דם היא של העכבר, שבו מבחני גרורות ניסיוני מבוצעים בדרך כלל משום שהם מתרחשים על לוחות זמנים יחסית קצרים מעידים בדרך כלל יכולת גרורתי 9. מבחנים אלו כרוכים הזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור ולכן מודל בשלבי הסיום של גרורות, כלומר תא extravasation וסרטן קולוניזציה של איברים. מבחני גרורות ניסיוני משתנים בהתאם באתר הזרקת תאים סרטניים האיברים בסופו מנותחים. בסוג assay הראשון, תאים סרטניים מוזרקים לוריד הזנב של עכברי זריעת תאי סרטן הריאות מנוטרים 10,11. את assay השנייה כוללת ביצוע זריקות intracardiac לכוון זריעת גרורתי לכיוון המיקרו-סביבה העצם 12-14, אבל גם 15 המוח. ב assay שלישי, ג סרטןאמות מוזרקות לתוך הטחול על מנת לאפשר קולוניזציה של הכבד 16 ואילו מסלול המשלוח הרביעי לעורק תרדמת נושאת תאים סרטניים למוח 17,18. בלי לשים לב את שיטת מסירת התאים הסרטניים, קולוניזציה האיברים היא נקודת הסיום הניסיון קבל והוא נקבע בדרך כלל באמצעות הארה, היסטולוגיה, או טכניקות מבוססות PCR. למרות היתרונות הפיסיולוגיים של ניצוח מבחני גרורות הניסיונות בתוך שורה בעכברים, ניסויים אלה עדיין דורשים שבועות עד חודשים כדי להשלים ולנתח.
דג הזברה (Danio rerio) המודל התפתח לאחרונה מערכת חדשה ללמוד התקדמות סרטן 19,20, ו מאפשר ההערכה של פלישת כלי דם תאי הסרטן בתוך מערכת דם תפקודית על לוח זמנים קצר בהרבה בהשוואה לעכברים 21-24. השיטה משתמשת זן דג הזברה שקוף אשר endothelia שלה מתויג עם fluo ירוק שונית אלמוגיםכתב חלבון rescent מונע על ידי אמרגן kdrl, הקולטן דג הזברה עבור פקטור גדילה של אנדותל כלי דם 25. ב assay, תאים סרטניים מסומנים בטוש ניאון אדום והזריקו לתוך הסינוס precardiac של עוברים ישנים 2-יום. בכל מקום בין 48 כדי 96 שעות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים כי פלשו מתוך כלי הדם ולתוך באזור של עבר הזנב יכולים להיות בקיע ביעילות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו ליישם את הטכנולוגיה על פנל של שורות תאי סרטן השד אנושיות הנפוץ להפגין הבדלים מוחלטים ביכולת פולשני כלי הדם שלהם. יתר על כן, אנו מראים כי שינוי הזריקה אל שק העובר חלמון מאפשר לחקר אינטראקציות תא הטרוגנית, כמו אוכלוסיות תאים סרטניים יכולים להיות מתויג באופן דיפרנציאלי עם צבעי ניאון והזריקו לתוך עוברי דג הזברה חסר כלי הדם ניאון. ב assay זה האחרון, תאים סרטניים פלשו החלמון intravasated לתוך vasculaturדואר הם הבקיע באזור הזנב 24 עד 48 שעות לאחר ההזרקה. בהתאם ליעילות והנוחות של מודל זה, דג הזברה מועסקת ויותר לבדוק במהירות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים תחת הגדרה פיזיולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: עוברי דג זברה נוצרו על פי פרוטוקול IACUC אושר. ניסויים אלה בוצעו בהתאם להמלצות ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'טאון ושימוש.
1. ארגן עובר להזרקה צור פתרונות מניות
- צור זחלי דג זברה הנדרשים להעריך פלישת כלי דם תאים סרטניים.
- גדר מנת לסחור בצורה חכמה או קבוצה נגדית הזדווגות עם Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; דגי b140 ednrb1.
הערה: יצרנו Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 דג הזברה b140, על ידי חציית Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, המבטאים שונית ירוק חלבון אלמוגים ניאון בתאי האנדותל, עם קו חסר תאי פיגמנט, mitfa b692; ednrb1 b140, שפותח במרכז המשאבים הבינלאומי דג הזברה. - שיתוףביצי llect, נקיים, ולהסיר עוברים מופרים או מעווים למחרת 22.
- דגירה עוברים על 28.5 ° C עד מוכן להזרקה עם תאים סרטניים, להתרחש כאשר עוברי דג הזברה הם 2 ימים לאחר ההפריה (2 DPF).
- גדר מנת לסחור בצורה חכמה או קבוצה נגדית הזדווגות עם Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; דגי b140 ednrb1.
- הפוך צלחות הזרקה.
- ממיסים 25 מ"ל של agarose 1.5% ב DH 2 O עבור כל צלחת.
- יוצקים 12 מ"ל של agarose לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ ולתת לו להתקשות.
- Re-להמיס ואז לשפוך את agarose שנותרו בצלחת.
- מיד למקם עובש קריסטל (3 מ"מ x 7.2 ס"מ רוחב X 7.5 ס"מ), כך שזה בזווית של 30 מעלות ביחס agarose וממוקמים במרכז הצלחת.
הערה: פעולה זו תיצור תלול 60 ° קיר ו -30 ° שיפוע נוטה. - קלטתי את תבנית זכוכית במקום ולתת להקשיח agarose.
- הוצא בעדינות את תבנית הזכוכית להיזהר שלא לקרוע את agarose.
הערה: תבניות ניתן לאחסן ב DH 2 O ב 4 ° C.
- לאזן צלחת הזרקה במי דגים (מלח ים 0.3 גר '/ ל).
- צלחת לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים.
- לאזן צלחת על ידי הוספת 10 מ"ל של מים ודגים לצלחת ומניחים על שייקר במשך 10 דקות.
- לאזן צלחת בשנית עם מים ודגים.
- פיצול 2 ימים לאחר הפריה (DPF) עובר לקבוצות הזרקה באמצעות העברת לתוך במאכלים המכילים דגי מים 22.
- הכינו מאכלים התאוששות עבור כל קבוצה לנצל לאחר ההזרקה. ודא כי המאכל התאוששות מכיל 10 מ"ל מים דגים, בתוספת פניצילין (25 מיקרוגרם / מ"ל) ו סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
- הכן פתרון tricaine 2x ידי הוספת 4 מ"ל של המניה tricaine שנאגרו (4 מ"ג / מ"ל, 10 מ"מ טריס, pH 7) 50 מ"ל מים דגים בתוספת פניצילין סטרפטומיצין.
- ממיסים 15 מ"ג נמוך ההיתוך agarose-טעם 10 מ"ל של תמיסת tricaine 2x ליצור מדיום הרדמה הרכבה אשר לשתק עוברים לחיות עבור imaginז.
הערה: הרכבה בינונית מורכב agarose 1.5%. - משוך מחטים microinjection.
- מניח צינורות זכוכית נימים ב חולץ פיפטה אנכי. משוך ארוך טפטפות קונים באמצעות 20 נוכחי MAMP ו גוף חימום 2-סליל.
2. תאים סרטניים סימון lipophilic פלורסנט דיי
- שמור על תאים סרטניים בתנאי התרבות המומלצות.
הערה: שורות אלה נשמרו DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, מד"א- MB-231, מד"א- MB-468, ו SK-BR-3. קווים אלה נשמרו RPMI + 10% FBS: HCC 1806 T-47D. כל שורות תאים נשמרו על 37 מעלות צלסיוס ו 5% CO 2 במהלך הדגירה. - צור השעית תא בודד על ידי dissociating תרבות חסידה של תאים סרטניים.
- ראשון שטף תאים עם PBS ולאחר מכן לטפל עם פתרון 0.05% טריפסין- EDTA.
הערה: זמן חשיפה טריפסין יהיה תלוי הקו הסלולרי. - לנטרל את פתרון טריפסין עם seרום-המכיל התקשורת תרבית תאים לאחר שהתאים לנתק.
- ראשון שטף תאים עם PBS ולאחר מכן לטפל עם פתרון 0.05% טריפסין- EDTA.
- צנטריפוגה השעית התא מנוטרל-טריפסין במשך 5 דקות ב 200 XG, ואז resuspend תא גלול בתקשורת תרבות הטריה ספירת תאים.
- ספירת השעית התא באמצעות מונה אוטומטי ולהכין 1 מיליון תאים ב 200 μl של תקשורת תרבית תאים.
- ודא כדאיות תא עם הדרת צבע כחול trypan לפני הזריקה לתוך עוברי דג זברה.
הערה: רק אוכלוסיות תאי קיימא צריכים להיות מוזרקות לתוך עוברי דג זברה, כמו הזרקת תאים מתים לא תישקף פלישת כלי דם נכונה.
- ודא כדאיות תא עם הדרת צבע כחול trypan לפני הזריקה לתוך עוברי דג זברה.
- הוסף 2 μl של צבע lipophilic אדום ההשעיה תאים סרטניים עבור דילול 1: 100, ומערבבים היטב, ואז דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: ריכוז של הזמן לצבוע וסימון ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה עבור כל קו התא. - לאחר הדגירה, להוסיף 1 מיליליטר של תקשורת הטריה אל הצינור ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב200 x גרם.
- לשטוף צבע פלואורסצנטי שיורית מתאי הסרטן.
- לשאוב supernatant מן התא גלולה, resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות טרי, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 x ז.
- חזור על שלב הכביסה בשנית: לשאוב supernatant, resuspend התא הגלול ב 1 מיליליטר של תקשורת הטריה ולאחר מכן צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 200 גרם x.
- חזור על הפעם השלישית שלב כביסה: לשאוב supernatant, resuspend התא הגלול ב 1 מיליליטר של תקשורת הטריה ולאחר מכן צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 200 גרם x.
- לשאוב supernatant ו resuspend התא הגלול המכיל 1 מיליון תאים סרטניים שכותרתו 500 μl של תקשורת הטריה.
הערה: 0.5 מ"מ EDTA ניתן להוסיף התקשורת כדי למנוע clumping התא.
3. תאי סרטן ההזרקה לתוך הסינוס טרום הלב של עוברי דג הזברה
- צרף מערכת לוותר microinjection למקור אוויר דחוס ולהדליק המקור כוח מערכת לוותר דואר microinjection.
- לחץ בדיקה על-ידי לחיצה על דוושת הרגל. דופק קצר של אוויר צריך לפלוט מבעל המחט.
- לאזן את צלחות הזרקת פעמים עם פתרון 2x tricaine.
- לכל שלב איזון, להוסיף 20 מיליליטר של תמיסת tricaine 2x לצלחת ההזרקה ומניח על שייקר במשך 10 דקות.
- השתמש פיפטה פלסטיק להעביר קבוצה של עובר לצלחת קטנה המכילה את פתרון 2x tricaine.
- למילוי מחט זריקת microinjection עם תאים סרטניים באמצעות קצה pipet ג'ל טעינה.
- מניח את המחט בתוך צנצנת אחסון אלקטרודה עם הקצה המחודד פונה כלפי מטה כך תאים להתיישב ליד הקצה.
- העביר 20 - 30 עוברים הרדימו צלחת הזרקה ידי איסוף עובר עם שפע של tricaine 2x ב פיפטה פלסטיק.
- אפשר עובר להתיישב קצה פיפטה.
- ג'ֶנטֶלמֶןly לגרש עוברים לתוך השוקת של צלחת זריקה, להפיץ את העוברים לאורך השוקת.
- יישר עובר עם ראשים כלפי מעלה ובטנם מול הקיר התלול של השוקת.
הערה: פתרון Tricaine צריך לכסות הוא את אורך השוקת לבין משטח agarose השטוח, עם עוברים המתגוררים רק בשוקת. עובר כעת מוכנים להזרקה.
- להזריק 50 - 100 תאים סרטניים (2 - 5 NL) לתוך הסינוס precardiac של עוברי דג הזברה באמצעות מערכת לוותר microinjection.
- צרף את המחט אל בעל מחט של micromanipulator.
- מקם את צלחת הזריקה מתחת סטריאוסקופ עם קיר 60 מעלות שמאלה ולהתמקד העובר העליון בהגדלה 25x.
- מקם את micromanipulator כך, כאשר מורחב, המחט תהיה לחדור את העובר.
- הארך את המחט על ידי העין עד כמעט נוגע העובר.
- מחפש מתחת למיקרוסקופ, ליישר את המחט כך tכובע זה יהיה לחדור את העובר על הארכה נוספת.
- פירס העובר דרך שק החלמון הצבת קצה בדיוק, אבל לא, הסינוס טרום הלב.
- להזריק תאים על ידי לחיצה על דוושת הרגל. הכח של הזריקה מגרש את התאים לתוך הסינוס הלב. לחזור בו מחט.
- באמצעות יד ימין, להאריך ו לחזור בו מחט הזריקה. עם יד שמאל, לבצע התאמות בסדר למקם העובר הבא.
- מחזירים את המחט אל קנקן האלקטרודה בעת הגדרת להזריק עוד צלחת.
- מעביר את העוברים כדי בצלחת ההתאוששות לאחר הצלחת כולה מוזרקת.
- הטה את צלחת ההזרקה לרכז את העוברים בתחתית, רחץ כל עוברים הנותרים מתוך השוקת, ואיסוף אותם עם פיפטה הפלסטיק.
- אפשר העוברים להתיישב התחתון של פיפטה.
- מעבירים את העוברים כדי בצלחת התאוששות בהיקף מינימלי של tricaine.
- אינקובטוריםte צלחת התאוששות ב 28 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- עוברי דג הזברה קיימא נפרדים מעוברים מתים ופסולת אחרת.
- דגירת צלחת ב 33 מעלות צלזיוס עד מוכן ניקוד, בדרך כלל 24 - 96 שעות.
הערה: טמפרטורה זו נקבעת כפשרה בין 37 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור תאים סרטניים, ו -28.5 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור דג זברה.
4. ניקוד extravasation
- להרדים את אצווה של עוברים כדי להיות הבקיע ידי הצבת אותם בצלחת עם פתרון tricaine.
- הוסף זחלים הרדימו בשקופית מיקרוסקופ דיכאון בטיפת tricaine.
- זחלי אוריינט רוחבי עבור הדמיה אופטימלית של אזור הזנב.
- ספירת תאים סרטניים פלשו בהצלחה מתוך כלי הדם על ידי התמקדות מעלה ומטה באמצעות באזור הזנב להבחין בתאים שלמים בבירור.
הערה: זה הכי טוב שיש לפחות שני אנשים מעורבים tהתהליך שלו, שבו הפרט הבקיע את הדג עיוור תנאי הניסוי מוערך.- ציון זחלים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם עם העדשה האובייקטיבית 10x. השתמש אובייקטיבי 20x עבור שיחות כלשהן קשות.
5. עוברים הרכבה על שקופיות ו דימות פלואורסצנטי לאחר
- ממיסים 1.5% agarose / tricaine פתרון ומביאים 37 ° C.
- להרדים את העובר להיות צילמו על ידי הצבת אותו פתרון tricaine.
- מעביר את העובר בטיפת פתרון tricaine אל פני שטח ההדמיה. לחלופין להשתמש שקופית צלחת או מיקרוסקופ זכוכית תחתונה.
- השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את פתרון tricaine העודף, שמירה על העובר על פני שטח ההדמיה.
- Overlay טיפה אחת של פתרון agarose מותכת על העובר.
- במהירות, לפני agarose polymerizes, להשתמש בכלי עדין, כמו מברשת עפעף, כדי לכוון את העובר רוחבי הדמיה, מתן טיפול נוסףכדי להבטיח את העובר בצורה שטוחה על פני שטח ההדמיה.
- להטביע את הירידה agarose polymerized כעת תחת פתרון tricaine.
- נושא עובר דג הזברה לחיות הדמיה מיקרוסקופית.
שינוי 6.: הזרקת תאים סרטניים לתוך שק חלמון של עוברי דג הזברה
- הכן את צלחות מערכת הזרקה לוותר microinjection כפי שתואר לעיל בסעיף (3) של פרוטוקול זה.
- לייבל שתי אוכלוסיות תאים עם מנוגדים צבעי ניאון כפי שתואר לעיל בסעיף (2) של פרוטוקול זה.
- להזריק 5 - 10 nl של 2 x 10 ^ 7 תאים / מ"ל לתוך שק החלמון. שמור קבוע נפח ההזרקה להזריק מספרי תאים זהים (100 - 200 תאים סרטניים) מכל אוכלוסיית תאים
הערה: אפשר להשתמש עוברי דג זברה שקופים חסרי כלי דם ניאון עבור assay זה. כניסה פסיבית של חלקיקים לתוך כלי הדם יכולה להיות נשלטה על ידי הזרקת חרוזי ניאון (<10 מיקרומטר) או, לשנותבאופן מקורי, קו תא שאינו intravsate. - לשחזר את העוברים מוזרקים כפי שתואר לעיל בסעיף (3) של פרוטוקול זה ולאחר מכן להקרין זריקות מוצלחות.
- השתמש סטריאוסקופ למסך ולהעביר עוברים קיימא כי הוזרקו בהצלחה מנה חדשה.
הערה: כל העוברי צריך מסה בגודל עקבי של תאים נמצאים בחלמון. עובר מבוטלים אם גודל המסה שונה או אם תאים כל ממוקמים מחוץ החלמון. - מעבירים את העוברים קיימא מנה חדשה אם התאים הסרטניים נראים בבירור את שק החלמון.
- השתמש סטריאוסקופ למסך ולהעביר עוברים קיימא כי הוזרקו בהצלחה מנה חדשה.
- דגירת צלחת ב 33 מעלות צלזיוס עד מוכן ניקוד, בדרך כלל 24 - 48 שעות.
הערה: טמפרטורה זו נקבעת כפשרה בין 37 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור תאים סרטניים, ו -28.5 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור דג זברה. - להבקיע intravasation, פעל בהתאם להנחיות בסעיף (4) של פרוטוקול זה, אבל במקום לספור את מספר גתאי ancer כי פלשו בהצלחה לתוך כלי הדם של אזור הזנב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן בדקנו את יכולת פולשני כלי הדם של שורות תאי סרטן השד נפוצים מודל עובר דג זברה (איור 1). קריטריונים מחמירים הועסקו extravasation הניקוד עבור שורות תאים שונים אלה, שבו אירועים חיוביים נספרו רק אם התאים הסרטניים לא extravasated בבירור, וזאת נעשה בעיקר כדי להגביל את כל-תוצאות חיוביות שגויות שיכול לנבוע הבקיע פסולת הסלולר.
הניתוח שלנו גילה הבדלים מוחלט בין השורות כאשר הפלישה הוערכה 96 שעות לאחר ההזרקה לתוך הסינוס precardiac (טבלה 1). של שורות תאי 7 נבדק, עוברי דג זברה מוזרקים עם הקו הסלולרי מד"א- MB-231 הציגו את המספר הגדול ביותר של תאים סרטניים extravasated לכל עובר, ממצא העולה בקנה אחד עם אופיו גרורתי המקובל של הקו (איור 2). גם מצאנו כי BT-474 תאים בקלות invaded לאזור הזנב של עוברים, בעוד שורות תאים אחרים, כגון MCF-7, SK-BR-3, ותאי T-47D, היו פולשנית (איור 3). תגלית מסקרן הייתה כמחצית מן עוברי דג הזברה הוזרקו תאי מד"א- MB-468 הייתה בצקת באזור Cardial ואלה לא דורגו. כתוצאה מכך, מספר העוברים מוזרקים עם מד"א- MB-468 תאים שהושלך לפני שמצאנו מספיק דגימות קיימא שאפשר ונרשמות עבור extravasation. למרות ההבדלים לכאורה אלה, וזה ניכר כי extravasation התרחשה כאשר כל קו תאים סרטניים נבדק.
כשינוי אל assay סינוס precardiac, ביצענו ניסוי תחרות לפיה שתי אוכלוסיות של תאים מד"א- MB-231, הנבדלים זה מזה היכולת פולשני כלי הדם שלהם 26 הוזרקו בו זמנית לתוך שק החלמון של עוברים בפיתוח. מד"א- MB-231 תאים המופצים בתנאי תרבות והמחוברת לפני הזריקה הציג ירידה intravasation למחזור הדם ולכן יש לו נוכחות מופחתת באזור הזנב של העוברים על הניקוד (איור 4).
| שורת תאים | ממוצע. # תאי Extravasated לכל עובר | טווח |
| מד"א- MB-231 (subconfluent) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| מד"א- MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
e = "1"> טבלת 1: השוואה בין יכולת דם פולשנית של שורות תאי סרטן השד אצל זברה נפוצה שורות תאי סרטן השד הוזרקו סינוס precardiac של עוברי דג זברה בן 2-יום וכבש כעבור 4 ימים. תאים סרטניים פולשים מן כלי הדם ולתוך באזור הזנב היו ונרשמים ב 10 עובר לכל קו תא. המספר הממוצע של תאים סרטניים extravasated מותווה יחד עם המגוון.
איור 1. סיכום חזותי של תאי סרטן דג הזברה extravasation Assay. ב assay זה, תאים סרטניים מסומנים עם צבע פלואורסצנטי והזריקו לתוך הסינוס precardiac של עוברי דג הזברה בן 2-יום, כלי הדם אשר מסומן על ידי כתב ניאון מנוגדים. בעקבות 2 - 4 ימים נוספים, תאים סרטניים פלשו לאזור הזנב של העובר הםכבש יכול להיות מותקן בתוך מדיום agarose הרדמת ההדמיה הבאה. כל שלב המתואר מקביל סכמטי זה קטע של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונת פסיפס של עובר 4 ימי דג זברה לאחר הזרקה עם מד"א- MB-231 תאים. Brightfield (א) ו פלואורסצנטי (ב ') פסיפסים לראות. תמונות פלורסנט מתוארות ההשלכה המרבית של Z- מחסנית, שבו צבע ירוק מציין את כלי הדם ואת צבע אדום מעיד על התאים הסרטניים. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. (ג) באזור הזנב של העובר מוגדל להראות תאים סרטניים extravasated. תיוג פלורסנט punctate נתפס על Magnification. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דוגמה של תוצאות הניסוי. Extravasation כאן מודגם בעובר הוזרקו תאים סרטניים BT-474 אבל לא בעובר הזריקו MCF-7, SK-BR-3, ו- T-47D תאים סרטניים. ראשי חץ מציינים תאי extravasated. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. intravasation של מד"א- MB-231 נייד אוכלוסיות 2 ימים after שק חלמון הזרקה. (א) שק חלמון עם ירוק (פולשנית) ואדום (פחות פולשני) שכותרתו מד"א- MB-231 תאים. (ב) באזור הזנב עם תאים מד"א- MB-231 שפלשו בכלי הדם להגיע הזנב באזור. (ג) מספר עוברי דג הזברה עם תאים מד"א- MB-231 intravasated באזור הזנב 2 ימים לאחר ההזרקה 26. ברי סולם, 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה זו מנצלת את מודל דג הזברה ביעילות על מנת לבחון את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים (ראה איור 1). כאן אנו להחיל את הטכניקה בפני פנל של שורות תאי סרטן השד על מנת לספק בסיס שעליו חוקרים אחרים אז יכולים לבנות מחקרים משלהם (ראה טבלה 1; איורים 2 - 3). התצפית כי מד"א- MB-231 תאים פלשו בקלות לאזור הזנב של עוברי דג זברה תגרום אידיאלי שורות תאים לבדיקת סוכנים שעשויים לעכב פלישת כלי דם. יחסית פחות שורות תאים פולשניים, כמו HCC1806 או מד"א- MB-468 תאים למשל, יכולות להיות מועסקות על מנת ללמוד גורמים שאחרת להגביר פלישת כלי דם. אם אלו סוגים של ניסויים דורשים הכללת תרופות, אז יש אחד שני מסלולים נפרדים של משלוח, תלוי אם השפעת הטיפול צפוי להיות עמיד. תאים סרטניים יכולים להיות pretreated עם התרופה לפני ההזרקה לתוךהעוברים או את התרופה ניתן להוסיף ישירות למי הדיור העוברים שבו יהיה השפעתו על התאים הסרטניים על ידי דיפוזיה.
לשם השוואה שלנו, ניתחנו extravasation תא סרטני בזנב העובר דג הזברה 96 שעות לאחר ההזרקה לתוך הסינוס precardiac. עבור assay התחרות תא מד"א- MB-231, intravasation למחזור הוערכה 48 שעות לאחר ההזרקה שק חלמון. Timepoints נבחר לניתוח בדרך כלל דורש אופטימיזציה עבור כל קו תא שבו, עבור בניסויים מסוימים, extravasation השיא יכול להתרחש רק 24 שעות לאחר ההזרקה. ראוי לציין כי עוברי דג הזברה יש מערכת חיסון מולדת פונקציונלית כאשר הם הוזרקו תאי סרטן 27, וכתוצאה מכך, פסולת פלורסנט מתאי הסרטן עלול להיבלע על ידי תאי מערכת חיסון כמו מקרופאגים או נויטרופילים. פעילות של מערכת החיסון המולדת ולכן עלולה ליצור תיוג פלורסנט חיובי שגוי כאשר מנסה להבקיע extravasatיוֹן; הטיפול חייב להינתן לזרוח רק להבקיע תאים בגבריות בתוך הערוץ המתאים. מאז חקר הסרטן הנוכחי השלכות על המערכת החיסונית בשיפור גרורות סרטן 28, המודל העובר דג הזברה עשויה לספק תובנות ייחודיות בתחום זה בכך שהוא מאפשר לבדיקה של crosstalk המתרחשים בין תאים סרטניים ואת מערכת החיסון המולדת. רעיון זה בא לידי ביטוי על ידי כמה מחקרים שנעשו לאחרונה. הראשון מבין מחקרים אלה הראו כי עיכוב VEGFR בתוך דג הזברה משופרת היכולת של נויטרופילים כדי לעורר התנהגות גרורתי מתאי סרטן 29. מחקר נוסף הראה כי chemokine החיסונית CXCR4-CXL12 איתות ציר שלם בתוך דג הזברה, בשם רצפטור על תאים אנושיים של סרטן היה מסוגלת לחוש ולהגיב ליגנד דג הזברה 30, ואת הביטוי של CXCR4 בתאי סרטן בקורלציה עם יכולת פולשני שלהם בתוך במודל חיה. יתר על כן, הוכח כי מקרופאגים דג הזברה תערוכהטד תגובה chemotactic לכיוון CXCL12 האדם. זן עובר דג זברה עם נויטרופילים שכותרתו fluorescently 31, למשל, יכול להיות מנוצל להמשיך לחקור אינטראקציות תאים סרטניים עם מערכת החיסון במודל זה.
כמה צעדים בפרוטוקול דורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, זה חיוני כי תאים סרטניים להיות ניתק לתוך ההשעיה תא בודד על מנת למנוע סתימת המחט במהלך ההזרקה לתוך עוברי. אגרגטים הסלולר יכולה גם לחסום את זרימת הדם ואת להפריע ליכולת של תאים סרטניים לנסוע לאזור הזנב, ובכך שתשבש את הניתוח. אגרגטים הסלולר עלולים גם לגרום לקריעה של כלי דם, ואם זה קורה, הבקיע את היכולת פולשנית של תאים סרטניים חיים באזורים אלה הוא לא אמינים ולא מומלצים. תחום נוסף בעיה פוטנציאלית נוגע תיוג התאים הסרטניים עם צבע פלואורסצנטי. בניסויים מנוהלים על ידי המעבדה שלנו, מצאנו כי צבעי lipophilic,כמו DiI למשל, נוטה לייצר את התיוג הטוב ביותר, ובכל זאת רמת הקרינה שלה יכולה להשתנות בין שורות תאים. מסיבה זו, תיוג פלורסנט של תאים סרטניים צריך להיות מותאם לפני ההזרקה לתוך עובר כדי למנוע תיוג מעל. זה קריטי, כי עודפי הצבע הוא נשטף מתאי הסרטן לאחר שהם סומנו בתווית, וזה מושג על ידי הצעדים צנטריפוגה השונים המצוין בסעיף התיוג של הפרוטוקול; צעדים אלה אולי נראה מיותר, אבל הם נחוצים לחלוטין. צבע פלואורסצנטי יותר מדי יכול להיות רעיל לתאים או לדלוף לתוך זרם הדם, ייצור רקע ניאון artifactual. רבים של בעיות אלה ניתן לעקוף באמצעות שימוש בתאי סרטן המבטאים חלבוני ניאון, ומומלץ כי מערכות אלו יועסקו במקום צבע פלואורסצנטי במידת האפשר. לבסוף, כאשר הבקיעו את העוברים עבור extravasation הסרטן, זה הכרחי כדי להחיל קריטריונים עקביים לכל התנאים. אנו מוצאים הבבית שכלל אנשים שני לפחות בשלב הניקוד מסייע לשמור קפדנות מדעית: אדם אחד הוא המוטל עם הכנת שקופיות והקלטה התוצאות, ואילו אדם אחר הופך את פסק הדין extravasation והוא כל הזמן עיוור למצב נבדקים. כאשר הבקיע, אפשר גם לכמת תאים סרטניים extravasated באזור הזנב או ליצור קריטריונים בינארי, כדי להקל על ההשוואה. Fluorescently צביעת התאים הסרטניים מייצרת תיוג punctate כי יהיה גלויה בכתובת (איור 2 ג) גדלה גבוהה מאוד, אם כי תאי שלמים קלים יותר להבחין בהגדלה נמוכה (איור 3), האחרון שבם מומלץ עבור ניקוד. אם לשפוט מקרים יותר עמומים של extravasation ניתן שנעזר רכישת פרוסות אופטיות על מיקרוסקופ confocal, שבו quantitating extravasation כאחוז מכלל התאים באזור הזנב יכול לשלוט לטעינה שוויונית של תאים סרטניים לתוך העובר.
יוLK צק מסלול הזרקה שונה הסינוס precardiac שכן היא מאפשרת מספר גבוה יותר של תאים ולכן טובים יותר להכיל את ההטרוגניות בתוך אוכלוסיית תאים. כפי שניתן לראות בתרשים 4, מספר שכותרתו דיפרנציאלי אוכלוסיות תאים ניתן להזריק בו זמנית לתוך שק החלמון להשוות היכולת דפוס פולשנית שלהם. יכולת angiogenic של תאים מוזרקים והגיוס משופר של כלי דם עשויה להקל על כניסת תאי סרטן לאזור הזנב אבל היבט זה שטרם נותח. מבחינה טכנית, חלמון זריקות שק קלים יותר לביצוע מאשר הזרקת סינוס precardiac אם כי, מצד שני, שק החלמון היא סביבה תזונתי עשיר שעשויים לעכב את יציאתם של תאים סרטניים. אפשר גם כי הזריקו ליד כלי דם בתוך החלמון עשוי בטרם עת להציג תאים סרטניים למחזור הדם, ולכן, אחד חייב מסך בזהירות זריקות הכושלת ולהשמיט עובר אלה את השער. לבסוף, חשוב to לב במיקרו-סביבה של חלמון היא מלאכותית במקצת, כפי שהיא חסרה האתר הראשי מקביל בעכברים או בני אדם.
מערכות המודל השונות המבקשות לחזות גרורות סרטן אינן ללא יתרונות והחסרונות, ואת assay extravasation דג הזברה היא לא יוצא מן כלל. כתוצאת יתרון עיקרי, assay זה מאפשר ההערכה של יכולת פולשני כלי דם בתוך מערכת דם פונקציונלית שאלות ניסיוניות ניתן לענות רק לאחר כמה ימים. בהינתן זמן אספקה המהיר, מערכת כזו יכולה להיות מנוצלת כדי לחקור את ההתנהגות התוקפנית של שורות תאים הוקמו לא רק, אלא גם דגימות טריות מבודדות חולי סרטן אנושיים. החסרון העיקרי הוא כי מודל זה משמיט האירועים המוקדמים האחרונים של המפל גרורתי על ידי התמקדות אך ורק על פלישת כלי דם. יתר על כן, התאים הסרטניים האנושיים מוזרקים לתוך עוברי דג זברה אלו הם ללא ספק לא הפועלות בסביבת syngeneic גומלין חלקם עם tהוא stroma יכול וכתוצאה מכך יאבד. למרות מגבלות אלה, המודל עובר דג הזברה יש מקום ראוי הוא במחקר הסרטן בסיסי translational, כפי שכבר מועסק זה מעיד על תפקיד עבור היפו במסלול איתות 26 וחלבון הקשורים קרטין 5-5 32 ביכולת פולשני כלי הדם של הסרטן תאים. לפיכך, המודל הזה יש פוטנציאל לסייע בחקירה של סימן ההיכר גרורתי המפתח של סרטן בשלב מתקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
