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Cancer Research

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish ( doi: 10.3791/55007 Published: November 3, 2016

Summary

Questo metodo utilizza zebrafish embrioni per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali. le cellule tumorali fluorescenti sono iniettati nel precardiac seno o il sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. invasione vascolare delle cellule tumorali e stravaso è valutata mediante microscopia a fluorescenza della regione di coda 24-96 ore più tardi.

Introduction

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La malattia metastatica è una delle principali cause di mortalità per cancro e molti meccanismi che consentono la diffusione delle cellule tumorali rimangono da scoprire 1. Al fine di una cellula tumorale a metastatizzare con successo, deve prima di invadere attraverso lo stroma che circonda un tumore primario, entra (intravasate) nel sistema circolatorio, sopravvivere in transito, uscita (stravaso) dalla circolazione, e, infine, stabilire una colonia vitale presso il sito organo lontana 2. Intravasation e stravaso sono quindi una tappa fondamentale verso la cascata metastatica, eppure ogni cellula tumorale non è intrinsecamente abili a interrompere e la migrazione attraverso giunzioni endoteliali 3. In realtà, ci sono una serie di pressioni selettive uniche che circondano invasione vascolare delle cellule tumorali e il processo può essere ulteriormente influenzata da una varietà di fattori endogeni ed esogeni 4. Per queste ragioni, le tecniche che analizzano il comportamento aggressivo di cancro in fase avanzata spesso si concentrano su vascular capacità invasiva come un mezzo per prevedere diffusione metastatica.

Vari sistemi modello esistono per facilitare lo studio di invasione vascolare delle cellule tumorali in vitro. Il più utilizzato in vitro coinvolgono sia sistemi transwell per valutare la migrazione delle cellule tumorali attraverso una tecnologia elettrica Cell-substrato impedenza di rivelazione (ECIS) barriera endoteliale 5 o per monitorare l'interruzione in tempo reale di un monostrato endoteliale intatto dalle cellule tumorali 6. Questi test in genere non hanno la dinamica dei fluidi e fattori stromali che altrimenti un impatto attaccamento delle cellule tumorali ad una parete endoteliale. Questo problema è in qualche modo aggirato da reti vascolari perfusable che nascono dalla cultura 3D di endoteli con il supporto di cellule stromali, e questi sistemi microfluidici 3D ora rappresentano la prima linea di corrente in vitro opzioni 7,8. Tuttavia, questi approcci omettono microambiente robusta di un sistema circolatorio funzionantee quindi solo in parte sostituto per modelli in vivo.

Il più utilizzato nel modello vivo di invasione vascolare è il mouse, in cui saggi metastasi sperimentali sono comunemente eseguiti perché si verificano in tempi relativamente brevi e sono generalmente indicativi di capacità metastatica 9. Questi test comportano l'iniezione diretta delle cellule tumorali in circolazione e quindi modellare le fasi finali della metastasi, cioè stravaso e delle cellule del cancro della colonizzazione degli organi. I saggi metastasi sperimentali variano a seconda del sito di iniezione delle cellule tumorali e gli organi infine analizzati. Nel primo tipo di saggio, cellule tumorali vengono iniettate nella vena della coda di topi e semina delle cellule del cancro ai polmoni è monitorata 10,11. Il secondo saggio comprende l'esecuzione di iniezioni intracardiaci per dirigere semina metastatico verso il microambiente del midollo 12-14, ma anche il cervello 15. Nel terzo test, il cancro cells vengono iniettati milza per permettere la colonizzazione del fegato 16 mentre il quarto percorso di consegna nella carotide trasporta cellule tumorali al cervello 17,18. Indipendentemente dal metodo di consegna delle cellule tumorali, la colonizzazione organo è il punto finale sperimentale accettato e viene generalmente determinato tramite luminescenza, istologia, o tecniche di PCR-based. Nonostante i vantaggi fisiologici di condurre test di metastasi sperimentali all'interno di un host murino, questi esperimenti richiedono ancora settimane o mesi per completare e analizzare.

Il modello di zebrafish (Danio rerio) ha recentemente emerso come un nuovo sistema per studiare la progressione del cancro 19,20, e permette per la valutazione di invasione vascolare delle cellule tumorali all'interno di un sistema circolatorio funzionale su un arco di tempo molto più breve se confrontato con i topi 21-24. Il metodo utilizza un ceppo zebrafish trasparente che ha la sua endoteli etichettato con una barriera verde fluo corallinagiornalista proteine fluore- guidato dal promotore kdrl, il recettore zebrafish per endoteliali fattore di crescita vascolare 25. Nel saggio, le cellule tumorali sono etichettati con un marcatore fluorescente rosso e iniettato nel seno precardiac di 2 giorni embrioni. Ovunque tra 48 a 96 ore dopo l'iniezione, le cellule tumorali che hanno invaso fuori del sistema vascolare e nella regione caudale embrioni possono essere lanciati in modo efficiente su un microscopio a fluorescenza. Qui si applica la tecnica di un panel di linee di cellule umane di cancro al seno comunemente usati per dimostrare forti differenze nella loro capacità invasiva vascolare. Inoltre, abbiamo dimostrato che cambiare il sito di iniezione al sacco embrionale tuorlo permette per lo studio delle interazioni cellulari eterogenee, come le popolazioni di cellule del cancro possono essere etichettati con differenziale coloranti fluorescenti e iniettate in embrioni di zebrafish prive di vascolarizzazione fluorescente. In quest'ultimo test, le cellule tumorali che hanno invaso il tuorlo e intravasated nella vasculature sono segnato nella regione caudale 24-48 ore dopo l'iniezione. A causa l'efficacia e la convenienza di questo modello, zebrafish sono sempre più impiegati per testare rapidamente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali in un ambiente fisiologico.

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Protocol

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Etica Dichiarazione: zebrafish embrioni sono stati generati secondo un protocollo IACUC approvato. Questi esperimenti sono stati effettuati in conformità con le raccomandazioni del comitato di cura degli animali e Usa Georgetown University.

1. Organizzare embrioni per iniezione e creare soluzioni di riserva

  1. Generare requisito larve di zebrafish per valutare invasione vascolare delle cellule tumorali.
    1. Impostare coppia-saggio o di un gruppo in croce accoppiamento con Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; B140 ednrb1 pesce.
      NOTA: Abbiamo generato Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; ednrb1 B140 zebrafish, attraversando Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, che esprimono barriera verde proteina fluorescente corallo nelle cellule endoteliali, con una linea che manca di cellule pigmentate, mitfa B692, B140 ednrb1, sviluppato presso il Centro risorse Zebrafish International.
    2. couova llect, pulita, e rimuovere gli embrioni non fecondate o deformate il giorno successivo 22.
    3. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C fino al momento per l'iniezione di cellule tumorali, che si verificano quando gli embrioni di zebrafish sono 2 giorni dopo la fecondazione (2 DPF).
  2. Fare piastre di iniezione.
    1. Fate sciogliere 25 ml di 1,5% agarosio in DH 2 O per ogni piatto.
    2. Versare 12 ml di agarosio in un x 15 mm piastra di Petri 100 mm e lasciarlo indurire.
    3. Re-melt quindi versare i restanti agarosio nella piastra.
    4. posizionare immediatamente uno stampo di vetro tagliate (3 mm x 7,2 cm di lunghezza di larghezza x 7,5 cm) in modo che sia a un angolo di 30 gradi rispetto al agarosio e posizionato al centro della piastra.
      NOTA: Questo creerà una ripida parete di 60 ° e una rampa inclinata di 30 °.
    5. Nastro lo stampo di vetro al suo posto e lasciare indurire agarosio.
    6. Rimuovere delicatamente lo stampo di vetro e fare attenzione a non strappare l'agarosio.
      NOTA: Stampo può essere memorizzato in dH 2 O a 4 ° C.
  3. Equilibrare piatto iniezione con pesci d'acqua (0,3 g / L di sale marino).
    1. Piastra Sciacquare due volte con acqua distillata.
    2. Equilibrare plate aggiungendo 10 ml di acqua pesci alla piastra e posto su agitatore per 10 min.
    3. Equilibrare piatto una seconda volta con acqua i pesci.
  4. Split post-fecondazione (DPF) di embrioni di 2 giorni in gruppi di iniezione trasferendoli in piatti a base di pesce contenenti acqua 22.
  5. Preparare i piatti di recupero per ogni gruppo di utilizzare dopo l'iniezione. Assicurarsi che il piatto di recupero contiene acqua 10 ml di pesce, più penicillina (25 mcg / ml) e streptomicina (50 mg / ml).
  6. Preparare la soluzione tricaine 2x con l'aggiunta di 4 ml di tricaine tamponata magazzino (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) a 50 ml di acqua i pesci più penicillina e la streptomicina.
  7. Disciogliere 15 mg a basso punto di fusione agarosio in 10 ml di soluzione tricaine 2x per generare un mezzo di montaggio anestetico che immobilizza embrioni vivi per imaging.
    NOTA: Mezzo di montaggio consiste di 1,5% agarosio.
  8. Tirare aghi microiniezione.
    1. Mettere in vetro tubo capillare in un estrattore pipetta verticale. Tirare le pipette lungo conici con 20 corrente mAmp e un elemento riscaldante 2-coil.

2. Le cellule Etichettatura cancro con lipofila colorante fluorescente

  1. Mantenere le cellule tumorali nelle loro condizioni di coltura raccomandati.
    NOTA: Queste linee sono state mantenute in DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, e SK-BR-3. Queste linee sono state mantenute in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 T-47D. Tutte le linee cellulari sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2 durante l'incubazione.
  2. Generare una cella singola sospensione dissociandosi una cultura aderente di cellule tumorali.
    1. Lavare le cellule prima con PBS e poi trattare con soluzione di tripsina-EDTA 0,05%.
      NOTA: tempo di esposizione Tripsina dipenderà dalla linea cellulare.
    2. Neutralizzare la soluzione tripsina con sérum contenenti terreni di coltura cellulare dopo che le cellule si staccano.
  3. Centrifugare la sospensione cellulare tripsina-neutralizzato per 5 minuti a 200 xg, quindi risospendere il pellet cellulare in mezzi di coltura fresco per il conteggio delle cellule.
  4. Conta la sospensione cellulare utilizzando un contatore automatico e preparare 1 milione di cellule in 200 ml di mezzi di coltura cellulare.
    1. Verificare la vitalità delle cellule con trypan colorante esclusione blu prima iniezione in embrioni di zebrafish.
      NOTA: le popolazioni di cellule vitali solo devono essere iniettate in embrioni di zebrafish, come l'iniezione di cellule morte non rifletterà vera invasione vascolare.
  5. Aggiungere 2 ml di colorante lipofile rosso alla sospensione cellulare di cancro per una diluizione 1: 100, mescolare bene, e poi incubare la miscela a 37 ° C per 20 min.
    NOTA: Concentrazione del tempo tintura e etichettatura può essere necessario ottimizzate per ciascuna linea cellulare.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di mezzi freschi al tubo e centrifugare per 5 min a200 x g.
  7. Lavare via colorante fluorescente residuo dalle cellule tumorali.
    1. Aspirare il supernatante dal pellet cellulare, risospendere il pellet in 1 ml di terreni di coltura fresco, e centrifugare per 5 min a 200 x g.
    2. Ripetere la fase di lavaggio una seconda volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g.
    3. Ripetere la fase di lavaggio terza volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g.
  8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare contenente 1 milione di cellule tumorali marcate in 500 ml di mezzi freschi.
    NOTA: 0,5 mM EDTA può essere aggiunto ai media per evitare grumi cellule.

3. Cellule Iniettare tumorali nel seno pre-cardiaca di embrioni di zebrafish

  1. Collegare il sistema di erogazione microiniezione a una fonte di aria compressa e accendere °e microiniezione fonte di alimentazione del sistema di erogazione.
    1. Pressione di prova premendo il pedale. Un breve impulso di aria dovrebbe emettere dalla porta-aghi.
  2. Equilibrare le piastre iniezione due volte con la soluzione 2x tricaine.
    1. Per ogni fase di equilibrio, aggiungere 20 ml di soluzione tricaine 2x alla piastra di iniezione e posto su agitatore per 10 minuti.
  3. Utilizzare pipetta di plastica per trasferire un gruppo di embrioni ad un piccolo recipiente contenente la soluzione 2x tricaine.
  4. Backfill l'ago dell'iniezione microiniezione con le cellule tumorali utilizzando una punta della pipetta di gel-caricamento.
    1. Posizionare l'ago in un vaso di stoccaggio elettrodo con l'estremità appuntita rivolta verso il basso in modo da cellule stabilirsi vicino alla punta.
  5. Trasferimento 20 - 30 embrioni anestetizzati ad una piastra di iniezione attraverso la raccolta degli embrioni con abbondanza di 2x tricaine in una pipetta di plastica.
    1. Lasciare embrioni di stabilirsi nella punta della pipetta.
    2. gentiluomoly espellere embrioni nella vaschetta della piastra di iniezione, diffondendo gli embrioni lungo la lunghezza della vasca.
    3. Allineare gli embrioni con le teste verso l'alto e pance di fronte alla ripida parete della vasca.
      NOTA: soluzione Tricaine dovrebbe coprire sia la lunghezza trogolo e la superficie agarosio piatta, con embrioni risiede solo nel trogolo. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione.
  6. Iniettare 50 - 100 cellule tumorali (2-5 NL) nel seno precardiac degli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema di erogazione microiniezione.
    1. Attaccare l'ago al titolare ago di una micromanipolatore.
    2. Posizionare la piastra iniezione sotto lo stereoscopio con la parete 60 gradi a sinistra e mettere a fuoco l'embrione superiore a 25x.
    3. Posizionare il micromanipolatore in modo tale che, se aperto, l'ago trafiggerà l'embrione.
    4. Estendere l'ago a occhio fino a quando non è quasi a contatto con l'embrione.
    5. Guardando al microscopio, allineare l'ago in modo tcappello che trafiggerà l'embrione su ulteriore estensione.
    6. Pierce l'embrione attraverso il sacco vitellino posizionando la punta appena a, ma non in, il seno pre-cardiaca.
    7. Iniettare cellule premendo il pedale. La forza di iniezione espelle le cellule nel seno cardiaca. Ritrarre l'ago.
    8. Usando la mano destra, estendere e ritrarre l'ago di iniezione. Con la mano sinistra, effettuare regolazioni di precisione per posizionare successivo dell'embrione.
    9. Ritorna l'ago al barattolo di stoccaggio degli elettrodi durante l'impostazione di iniettare un altro piatto.
  7. Trasferire gli embrioni al piatto recupero una volta che l'intera piastra viene iniettato.
    1. La piastra di iniezione per unire gli embrioni in basso, lavando le rimanenti embrioni fuori del canale, e della raccolta con la pipetta di plastica.
    2. Lasciare gli embrioni di depositarsi sul fondo della pipetta.
    3. Trasferire gli embrioni al piatto di recupero in un volume minimo di tricaine.
  8. incubaTE recupero piatto a 28 ° C per 1 ora.
    1. Separare zebrafish embrioni vitali da embrioni morti e altri detriti.
  9. Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-96 ore.
    NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish.

4. Punteggio stravaso

  1. Anestetizzare la partita di embrioni per essere segnata mettendoli in un piatto con la soluzione tricaine.
  2. Inserire un larve anestetizzato su un vetrino da microscopio depressione in una goccia di tricaine.
    1. larve Orient lateralmente per l'imaging ottimale della regione caudale.
  3. Contare il numero di cellule tumorali che hanno invaso successo della vascolarizzazione concentrandosi su e giù attraverso la regione di coda di discernere chiaramente cellule intatte.
    NOTA: E 'meglio avere almeno due persone coinvolte in til suo processo, in cui l'individuo segnando il pesce è cieco alla condizione sperimentale in corso di valutazione.
    1. Punteggio larve su un microscopio a fluorescenza mescola con la lente dell'obiettivo 10x. Utilizzare l'obiettivo 20x per le chiamate difficili.

5. Embrioni di montaggio su vetrini e la successiva imaging di fluorescenza

  1. Sciogliere 1,5% soluzione di agarosio / tricaine e portare a 37 ° C.
  2. Anestetizzare l'embrione di essere ripreso ponendolo in soluzione tricaine.
  3. Trasferire l'embrione in una goccia di soluzione tricaine alla superficie di formazione dell'immagine. Opzionalmente usare un piatto o vetrino da microscopio con fondo di vetro.
  4. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione in eccesso tricaine, mantenendo l'embrione sulla superficie di formazione dell'immagine.
  5. Sovrapponi una goccia di soluzione di agarosio fuso sopra l'embrione.
  6. Rapidamente, prima che l'agarosio polimerizza, utilizzare uno strumento delicato, come un pennello ciglia, per orientare l'embrione lateralmente per l'imaging, dando particolare attenzioneper assicurare l'embrione viene appiattito lungo la superficie di formazione dell'immagine.
  7. Immergere la goccia di agarosio ora polimerizzato sotto soluzione tricaine.
  8. Sottoporre il zebrafish vivo per l'imaging microscopico.

6. Modifica: iniezione di cellule tumorali nel tuorlo Sac di embrioni di zebrafish

  1. Preparare il sistema e di iniezione piastre microiniezione di erogazione come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo.
  2. Etichettare due popolazioni di cellule con contrasto coloranti fluorescenti come precedentemente descritto nel paragrafo (2) del presente protocollo.
  3. Iniettare 5 - 10 nl di 2 x 10 ^ 7 cellule / ml nel sacco vitellino. Mantenere il costante volume di iniezione per iniettare il numero di cellule identiche (100 - 200 le cellule tumorali) da ciascuna popolazione cellulare
    NOTA: Si può utilizzare embrioni di zebrafish trasparente privi vascolare fluorescente per questo test. ingresso passivo di particelle nel sistema vascolare può essere controllato per iniettando perline fluorescenti (<10 micron) o, alternativamente, una linea cellulare che non intravsate.
  4. Recuperare gli embrioni iniettati come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo e quindi lo screening per le iniezioni di successo.
    1. Utilizzare uno stereoscopio per lo screening e trasferire gli embrioni vitali che sono stati iniettati con successo ad un nuovo piatto.
      NOTA: tutti gli embrioni devono avere una massa di dimensioni sempre di cellule situate nel tuorlo. Gli embrioni vengono scartati se la dimensione di massa è diversa o se le cellule si trovano al di fuori del tuorlo.
    2. Trasferire gli embrioni vitali per un nuovo piatto se le cellule tumorali si vedono chiaramente nel sacco vitellino.
  5. Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-48 ore.
    NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish.
  6. A segnare intravasation, seguire le linee guida descritte nel paragrafo (4) del presente protocollo, ma invece contare il numero di ccellule ancer che hanno invaso con successo nel sistema vascolare della regione caudale.

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Representative Results

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Qui abbiamo testato la capacità invasiva vascolare comunemente utilizzate linee di cellule di cancro al seno in un modello di zebrafish (Figura 1). criteri rigorosi sono stati impiegati nel punteggio stravaso per queste diverse linee cellulari, dove gli eventi positivi sono stati contati solo se le cellule tumorali avevano chiaramente uscito dai vasi, questo essere fatto principalmente per limitare eventuali falsi positivi che potrebbero derivare da segnando detriti cellulari.

La nostra analisi ha rivelato forti differenze tra le righe quando l'invasione è stata valutata 96 ore dopo l'iniezione nel seno precardiac (Tabella 1). Delle 7 linee cellulari testate, zebrafish embrioni iniettati con la linea cellulare MDA-MB-231 esposti il maggior numero di cellule tumorali travasata per embrione, una constatazione che è coerente con la natura metastatica accettata della linea (Figura 2). Abbiamo anche trovato che BT-474 cellule prontamente invaded nella regione caudale embrioni, mentre altre linee cellulari, come MCF-7, cellule SK-BR-3, e T-47D, erano minimamente invasiva (Figura 3). Una scoperta curiosa era che circa la metà degli embrioni di zebrafish iniettati con le cellule MDA-MB-468 ha avuto un edema nella regione cardiale e questi non sono stati segnati. Di conseguenza, un numero di embrioni iniettati con MDA-MB-468 cellule sono state scartate prima abbiamo trovato campioni vitali sufficienti che potrebbero essere quantificata per stravaso. Nonostante queste differenze apparenti, è da notare che lo stravaso si è verificato con ogni linea di cellule di cancro testati.

Come una modifica al dosaggio precardiac sinusale, abbiamo effettuato un esperimento di competizione in cui due popolazioni di MDA-MB-231 cellule che differiscono nella loro capacità invasiva vascolare 26 sono stati simultaneamente iniettate nel sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. cellule MDA-MB-231 propagate in condizioni di coltura confluente precedentiad iniezione mostrato una riduzione intravasation nella circolazione e quindi aveva una presenza ridotta nella regione caudale embrioni upon scoring (Figura 4).

Linea cellulare AVG. # Celle extravasated per Embryo Gamma
MDA-MB-231 (subconfluenti) 4 0-9
BT-474 1.5 0-4
MDA-MB-468 0.7 0-6
MCF-7 0.6 0-2
T-47D 0.3 0-2
HCC1806 0.2 0-1
SK-BR-3 0.1 0-1

Tabella 1: Confronto della Vascolare capacità invasiva delle cellule del cancro al seno Lines in Zebrafish comunemente utilizzate linee di cellule di cancro al seno sono state iniettate nel seno precardiac di 2 giorni antichi embrioni di zebrafish e ha ottenuto 4 giorni più tardi. Le cellule tumorali invadono dalla vascolarizzazione e nella regione caudale sono state quantificate in 10 embrioni per ogni linea cellulare. Il numero medio di cellule tumorali travasata si è indicato con la gamma.

Figura 1
Figura 1. visiva Sintesi della cella Zebrafish Cancer stravaso test. In questo saggio, le cellule tumorali sono etichettati con un colorante fluorescente e iniettato nel seno precardiac di 2 giorni antichi embrioni di zebrafish, il cui sistema vascolare è segnata da un reporter fluorescente a contrasto. Dopo 2 - 4 giorni aggiuntivi, le cellule tumorali che hanno invaso nella regione caudale dell'embrione sonoottenuto e può essere montato in un mezzo agarosio anestetico per la successiva imaging. Ogni passo raffigurato in questo corrisponde schematiche di una sezione del protocollo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Immagine Mosaico di un embrione Zebrafish 4 giorni dopo l'iniezione con MDA-MB-231 cellule. Brightfield (A) e fluorescenti mosaici (B) indicati. immagini fluorescenti sono raffigurati come la sporgenza massima di z-stack, in cui un colore verde indica la vascolarizzazione e un colore rosso indica le cellule tumorali. Barra della scala, 200 micron. (C) regione caudale del dell'embrione viene ingrandita per mostrare le cellule tumorali travasata. marcatura fluorescente puntata è visto su Magnificazione. Barra della scala, 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Esempio di Risultati Sperimentali. Qui stravaso è dimostrato in un embrione iniettati con cellule tumorali BT-474, ma non in un embrione iniettato con MCF-7, SK-BR-3 cellule tumorali, e T-47D. Punte di freccia indicano cellule travasata. Barra della scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. intravasation di MDA-MB-231 popolazioni di cellule 2 giorni after tuorlo Sac iniezione. (A) del sacco vitellino con il verde (invasiva) e rosso (meno invasiva) etichettato MDA-MB-231 cellule. (B) La regione caudale con MDA-MB-231 cellule che ha invaso il sistema vascolare per raggiungere la coda regione. (C) il numero di embrioni di zebrafish con intravasated MDA-MB-231 cellule nella regione caudale 2 giorni dopo l'iniezione 26. Barre di scala, 250 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questa tecnica utilizza il modello zebrafish per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali (vedi Figura 1). Qui abbiamo applicato la tecnica ad un pannello di linee cellulari di cancro al seno, al fine di fornire una base su cui altri ricercatori possono costruire i propri studi (vedi Tabella 1; figure 2 - 3). L'osservazione che MDA-MB-231 cellule prontamente hanno invaso nella regione caudale embrioni di zebrafish renderebbe questa linea cellulare ideale per gli agenti che potrebbero inibire l'invasione vascolare test. linee cellulari relativamente meno invasive, come cellule HCC1806 o MDA-MB-468, per esempio, potrebbero essere impiegati per studiare fattori che altrimenti potenziare invasione vascolare. Se questi tipi di esperimenti richiedono l'inclusione di farmaci, allora si ha due percorsi distinti di consegna, a seconda che l'effetto del trattamento dovrebbe essere durevole. Le cellule tumorali possono essere pretrattati con il farmaco prima dell'iniezione ingli embrioni o farmaco possono essere aggiunti direttamente all'acqua ospita gli embrioni dove inciderà le cellule tumorali per diffusione.

Nel nostro confronto, abbiamo analizzato stravaso di cellule di cancro in coda zebrafish 96 ore dopo l'iniezione nel seno precardiac. Per il saggio di competizione cellule MDA-MB-231, intravasation in circolazione è stata valutata 48 ore dopo l'iniezione sacco vitellino. I punti temporali scelti per l'analisi in genere richiedono l'ottimizzazione per ciascuna linea cellulare in cui, per alcuni esperimenti, picco stravaso può verificarsi solo 24 ore dopo l'iniezione. Vale la pena notare che gli embrioni zebrafish hanno un sistema immunitario innato funzionale quando vengono iniettati con cellule tumorali 27 e, conseguentemente, detriti fluorescente dalle cellule tumorali può essere inghiottito da cellule immunitarie come macrofagi o neutrofili. Attività del sistema immunitario innato può quindi potenzialmente creare marcatura fluorescente di falsi positivi quando si tenta di segnare extravasationico; la cura deve essere somministrato a segnare solo le cellule che robusto fluorescenti nel canale appropriato. Dal momento che la ricerca sul cancro corrente è che coinvolgono la sistema immunitario nel migliorare le metastasi del cancro 28, il modello zebrafish può fornire intuizioni uniche in questo settore, consentendo di esame del crosstalk che si verificano tra le cellule tumorali e del sistema immunitario innato. Questa idea è esemplificata da una coppia di studi recenti. Il primo di questi studi hanno dimostrato che l'inibizione VEGFR all'interno zebrafish migliorato la capacità dei neutrofili di suscitare un comportamento metastatico dalle cellule tumorali 29. Un secondo studio ha mostrato che la chemochina immunitario CXCR4-CXL12 segnalazione asse è intatto zebrafish, come il recettore sulle cellule tumorali umane era in grado di rilevare e rispondere al ligando zebrafish 30, e l'espressione di CXCR4 in cellule tumorali correlata con la loro capacità invasiva nel modello animale. Inoltre, è stato dimostrato che i macrofagi zebrafish mostreTed una risposta chemiotattica verso CXCL12 umana. Un ceppo zebrafish con neutrofili fluorescente 31, per esempio, potrebbe essere utilizzato per esplorare ulteriormente le interazioni di cellule di cancro con il sistema immunitario in questo modello.

A pochi passi del protocollo richiedono particolare attenzione. Innanzitutto, è essenziale che le cellule tumorali sono dissociate in una cella singola sospensione per impedire intasamento dell'ago durante l'iniezione in embrioni. aggregati cellulari possono anche bloccare il flusso di sangue e interferire con la capacità delle cellule tumorali a viaggiare nella regione caudale, inclinazione così l'analisi. aggregati cellulari possono anche indurre i vasi sanguigni e la rottura, se questo si verifica, segnando la capacità invasiva delle cellule tumorali vivono in queste regioni è né affidabili né raccomandato. Un'altra area potenziale problema riguarda etichettare le cellule tumorali con il colorante fluorescente. In esperimenti condotti dal nostro laboratorio, abbiamo scoperto che i coloranti lipofile,come DII per esempio, tendono a produrre la migliore etichettatura, ma il livello di fluorescenza può variare tra linee cellulari. Per questo motivo, la marcatura fluorescente delle cellule tumorali deve essere ottimizzata prima dell'iniezione negli embrioni per evitare un eccesso di etichettatura. È fondamentale che il colorante in eccesso viene lavato via dalle cellule tumorali dopo che sono stati etichettati, e questo si ottiene dalle varie fasi di centrifugazione indicati nella sezione etichettatura del protocollo; questi passaggi possono sembrare superfluo, ma sono assolutamente necessarie. colorante fluorescente troppo può essere tossico per le cellule o perdite nel flusso sanguigno, producendo uno sfondo fluorescente artefatta. Molti di questi problemi possono essere aggirato tramite l'uso di cellule tumorali che esprimono proteine ​​fluorescenti, e si raccomanda che questi sistemi essere impiegati al posto di colorante fluorescente quando possibile. Infine, il punteggio gli embrioni per stravaso cancro, è indispensabile applicare criteri uniformi a tutte le condizioni. Troviamo °a coinvolgere almeno due soggetti nella fase di incisione aiuta a mantenere rigore scientifico: un individuo è incaricato di preparare le diapositive e registrare i risultati, mentre l'altro individuo rende il giudizio stravaso e viene mantenuto ciechi alla condizione oggetto di valutazione. Quando segnando, si può quantificare sia le cellule tumorali travasata nella regione coda o creare criteri di binari per facilitare il confronto. Fluorescenza tintura delle cellule tumorali produce etichettatura puntata che sarà visibile ad ingrandimento molto alto (figura 2c), anche se le cellule intere sono più facili da discernere con ingrandimento inferiore (figura 3), l'ultima delle quali è raccomandato per segnare. A giudicare i casi più ambigui di stravaso può essere aiutata con l'acquisizione di fette ottici su un microscopio confocale, in cui quantificazione stravaso come percentuale di tutte le cellule nella regione coda può controllare per il carico diseguale delle cellule tumorali in un embrione.

il yolk sac percorso iniezione è diverso dal seno precardiac quanto permette un maggior numero di cellule e quindi migliore accoglie l'eterogeneità all'interno di una popolazione di cellule. Come mostrato in figura 4, diverse popolazioni cellulari differenzialmente etichettati possono essere simultaneamente iniettati nel sacco vitellino di confrontare la capacità ed il modello invasivo. La capacità angiogenica delle cellule iniettate e una maggiore assunzione di vasi sanguigni possono facilitare l'ingresso delle cellule del cancro nella regione coda, ma questo aspetto non è stato ancora analizzato. Tecnicamente, tuorlo iniezioni sac sono più facili da eseguire che un'iniezione precardiac sinusale però, d'altra parte, il sacco vitellino è un ambiente ricco di sostanze nutritive che possono ostacolare l'uscita delle cellule tumorali. E 'anche possibile che l'iniezione nei pressi di vasi sanguigni nel tuorlo può prematuramente introdurre le cellule tumorali in circolo e, di conseguenza, si deve accuratamente lo screening per le iniezioni pasticciate e omettere questi embrioni di segnare. Infine, è importante to notare che il microambiente tuorlo è un po 'artificiale, in quanto manca un sito primario analogo nei topi e nell'uomo.

I vari sistemi modello che cercano di prevedere metastasi del cancro non sono senza i loro vantaggi e svantaggi, e il saggio stravaso zebrafish non fa eccezione. Come un grande vantaggio, questo test permette la valutazione della capacità invasiva vascolare all'interno di un sistema circolatorio funzionale e domande sperimentali può essere risolta dopo pochi giorni. Dato il tempo di consegna rapida, un tale sistema potrebbe essere utilizzato per sondare il comportamento aggressivo di linee cellulari non solo affermati, ma anche freschi campioni di pazienti affetti da cancro umano isolato. Lo svantaggio principale è che questo modello omette i primi e gli ultimi eventi della cascata metastatica, concentrandosi esclusivamente sulla invasione vascolare. Inoltre, le cellule tumorali umane iniettate in embrioni di zebrafish questi sono, ovviamente, non operano in un ambiente singenici e qualche interazione con tegli stroma può di conseguenza essere perso. Nonostante questi limiti, il modello zebrafish ha un posto meritato sia nella ricerca di base e traslazionale cancro, come abbiamo impiegato che mostrano un ruolo per l'Hippo percorso di segnalazione 26 e cheratina-proteina associata 5-5 32 nella capacità invasiva vascolare del tumore cellule. Quindi, questo modello ha il potenziale per aiutare le indagini di una chiave caratteristica metastatico del cancro in fase avanzata.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100 mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

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Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)
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Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).More

Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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