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Cancer Research

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트 doi: 10.3791/55007 Published: November 3, 2016

Summary

이 방법은 효율적으로 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 피쉬 배아를 이용한다. 형광 암세포 개발 배아 precardiac 부비동 또는 난황 낭에 주입된다. 암 세포 혈관 침윤 및 혈관 외 유출은 24-96 시간 후 꼬리 영역의 형광 현미경을 통해 평가된다.

Introduction

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전이성 암 사망률과 암세포의 확산을 가능하게 한 것을 발견 할 많은 유지기구의 주요 원인이다. 성공적으로 전이하는 암 세포에 대한 위해서는, 먼저 순환 시스템으로 (intravasate)를 입력, 기본 종양 주위의 기질을 통해 침입한다, 순환에서 통과, 출구 (extravasate)에서 살아 남기, 그리고 마지막으로 가능한 식민지를 구축 먼 장기 사이트 2에서. Intravasation 및 혈관 외 유출 따라서 전이성 폭포에서 중요한 단계이며, 아직 모든 암 세포는 파괴와 내피 접합 (3)를 통해 마이그레이션에 본질적으로 숙달되지 않습니다. 사실, 암세포의 혈관 침입을 둘러싸고 처리가 상기 내인성 및 외인성 인자 4 다양한 영향을받을 수있는 유일한 선택 압력의 시리즈가있다. 이러한 이유로, 고급 단계 암의 공격적인 행동을 조사 기법은 종종 V에 초점전이성 확산을 예측하는 수단으로서 기능 침습 ascular.

다양한 모델 시스템은 시험 관내에서 암세포의 침윤, 혈관의 조사를 용이하게하기 위해 존재한다. 대부분의 시험 관내 분석에서 사용하는 암 세포 (6)에 의한 손상 내피 단층 실시간 중단을 모니터링하는 내피 장벽 5 또는 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS) 기술을 통해 암 세포의 이동을 평가하기 위해 하나 트랜스 웰 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 일반적으로 그렇지 내피 벽 암세포 부착에 영향을 줄 것 인 유체 역학 및 간질 인자 부족하다. 이 문제는 다소 기질 세포를 지원하여 내피 세포의 3 차원 배양에서 발생 관류 혈관 네트워크가 회피되고, 이러한 3D 미세 유체 시스템은 지금 체외에서 현재 옵션 7,8의 선두를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 기능성 순환계의 견고한 미세 생략따라서 단지 생체 내 모델에 대한 부분을 대신한다.

가장 널리 혈관 침범 생체 내 모델에서 사용은 상대적으로 짧은 시간 척도 발생 및 전이 능력 9 일반적 나타내는 때문에 실험 전이 분석은 일반적으로 수행되는 마우스이다. 이러한 분석은 순환에 암 세포를 직접 주입을 수반하기 때문에 전이 기관, 즉 혈관 외 유출 및 암 세포 집락의 말기 모델. 실험 전이 분석은 암세포 주사 부위에 따라 다를 상기 기관은 궁극적으로 분석 하였다. 제 분석 유형에있어서, 암세포가 폐에 마우스와 암세포 시드의 꼬리 정맥에 주입은 10, 11을 모니터링한다. 두 번째 분석은 뼈쪽으로 미세 12-14 전이성 시드를 직접 심장 내 주사를 수행 할뿐만 아니라 뇌 (15) 포함한다. 제 분석에서, 암 C학습 학생은 경동맥 내로 넷째 전달 경로 (17, 18)은 뇌에 암 세포를 전달하는 반면, 간 (16)의 정착을 허용하기 위해 비장에 주입된다. 관계없이 암 세포 전달 방법의 장기 집락은 허용 실험적 포인트이며, 일반적으로, 발광, 조직학, 또는 PCR 계 기술을 통해 결정된다. 쥐 호스트 내에서 실험 전이 분석을 수행의 생리적 인 장점에도 불구하고,이 실험은 아직 완료하고 분석 개월 주를 필요로한다.

제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 모델은 최근 암의 진행 (19, 20)을 연구하는 새로운 시스템으로 부상하고 마우스 21-24에 비해 훨씬 짧은 시간 척도를 통해 기능 순환 시스템 내에서 암세포 혈관 침윤의 평가를 할 수있다. 이 방법은 내피 세포가 녹색 암초 산호 FLUO 태그 한 투명 제브라 피쉬의 변형을 이용하여kdrl 촉진제, 혈관 내피 성장 인자 (25)에 대한 수용체 제브라 구동 rescent 단백질 리포터. 상기 분석에서, 암 세포는 적색 형광 마커로 표지되며,이 일된 태아의 precardiac 부비동 주입. 외부에서 48 시간 내지 96 사이에 주입 한 후, 혈관에서 배아의 꼬리 영역으로 침범 암 세포는 형광 현미경을 효율적으로 획득 할 수있다. 여기서 우리는 혈관 침입 능력 뚜렷한 차이를 보여주기 위해 일반적으로 사용되는 인간 유방암 세포주의 패널 기술을 적용한다. 더욱이, 우리는 암세포 집단이 차분 형광 염료로 표지 된 형광 혈관 부족 제브라 피쉬 배아 내로 주입 될 수있는 배아 난황낭로 주사 부위를 변경하는 이종 세포 상호 작용의 연구를 허용 함을 입증. 이 후자의 분석에서, 노른자를 침공 한 암 세포는 vasculatur에 intravasated전자는 주사 후 48 시간에 꼬리 영역 (24)에 득점있다. 이에 모델의 효율성 및 편의에 제브라 점점 빠르게 생리 학적 환경 하에서 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 사용된다.

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Protocol

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윤리 정책 : 승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 Zebrafish의 배아를 생성 하였다. 이 실험은 조지 타운 대학 동물 관리 및 사용위원회의 권고 사항을 준수하여 수행 하였다.

1. 주입을 위해 배아를 구성 및 증권 솔루션 만들기

  1. 암 세포 혈관 침공을 평가하기 위해 필요한 제브라 피쉬 애벌레를 생성합니다.
    1. mitfa b692; ednrb1의 B140 물고기 (grcfp kdrl) ZN1의 Tg와의 교차 결합 쌍대 또는 그룹을 설정합니다.
      참고 : 우리는 Tg가 생성 (kdrl : grcfp) ZN1을, mitfa b692, ednrb1의 B140의 제브라 피쉬를, Tg는 (kdrl : grcfp) 교차에 의해 색소 세포가 부족 라인, mitfa으로, 내피 세포에서 산호의 형광 단백질 녹색 암초를 표현 ZN1 (25), b692하며 Zebrafish의 국제 자원 센터에서 개발 ednrb1 B140.
    2. 공동llect 계란, 깨끗하고, 미 수정 또는 변형 배아 다음날 (22)를 제거합니다.
    3. 제브라 피쉬 배아가 2 일 때 발생하는 암 세포 주입을위한 준비가 될 때까지 28.5 ° C에서 배아를 품어 후 수정 (2 DPF).
  2. 분사 판을 확인합니다.
    1. 각 플레이트에 대한 DH 2 O에서 1.5 % 아가로 오스 25 ml의 용융.
    2. 100mm X 15mm 페트리 접시에 아가로 오스 12 ml에 붓고하고 강화 할 수 있습니다.
    3. 다시 용융 접시에 남아있는 아가로 오스를 부어 다음.
    4. 이 아가로 30도 각도로 상기 플레이트의 중심에 위치하도록 즉시 절단 유리 형 (x 세로 7.5 cm 길이 3mm X 7.2 cm)에 위치.
      참고 :이 가파른 60도 벽과 30 ° 경 사진 진입로를 생성합니다.
    5. 대신에, 유리 몰드 테이프 아가 경화하자.
    6. 조심스럽게 유리 몰드를 제거하고 아가로 오스가 찢어지지 않도록주의하십시오.
      참고 : 금형은 4 ° C에서 DH 2 O에 저장 될 수있다.
  3. 물고기 물 (0.3 g / L의 바다 소금)와 분사 판을 평형.
    1. 두 번 증류수로 씻어 접시.
    2. 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트 대신에 생선을 물 10ml를 첨가하여 판 평형.
    3. 판에게 물고기 물과 두 번째 평형.
  4. 물고기 물 (22)을 포함하는 요리로 전송하여 주입 그룹으로 2 일 후 수정 (DPF) 배아를 분할합니다.
  5. 주사 후 활용할 수있는 각 그룹에 대한 복구 요리를 준비합니다. 복구 요리 10 ml의 물고기 물, 플러스 페니실린 (25 μg의 / ㎖) 및 스트렙토 마이신 (/ ㎖ 50 μg의)가 포함되어 있는지 확인합니다.
  6. 물고기 물 플러스 페니실린과 스트렙토 마이신 50ml로 버퍼 tricaine의 재고 (4 ㎎ / ㎖, 10 mM 트리스, pH가 7) 4 ml를 추가하여 2 배 tricaine 솔루션을 준비합니다.
  7. imagin 라이브 배아를 고정하는 장착 마취 매체를 생성하기 위해 2 배 tricaine 용액 10ml에 15 mg의 저 융점 아가로 오스를 녹여지.
    참고 : 설치 매체는 1.5 % 아가로 오스로 구성되어 있습니다.
  8. 미세 주사 바늘을 빼냅니다.
    1. 수직 피펫 풀러에 유리 모세관 튜브를 놓습니다. 20 MAMP 전류와 2 코일 발열체를 이용하여 긴 테이퍼 피펫 당겨.

친 유성 형광 염료 2. 라벨링 암 세포

  1. 그들의 추천 배양 조건에서 암 세포를 유지한다.
    참고 :이 라인은 DMEM에서 + 10 % FBS를 유지했다 : BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 SK-BR-3. 이 라인은 RPMI + 10 % FBS 유지했다 : 1806 HCC와 T-47D를. 모든 세포주를 배양 중에 37 O C의 5 % CO 2로 유지 하였다.
  2. 암 세포의 접착 성 배양 해리하여 단일 세포 현탁액을 생성한다.
    1. PBS 먼저 세포를 세척 한 후 0.05 % 트립신 EDTA 용액으로 처리한다.
      참고 : 트립신 노출 시간이 세포주에 따라 달라집니다.
    2. 그 자체로 트립신 용액을 중화럼 함유 세포 분리 후 세포 배양 매체.
  3. 200 XG에서 5 분 동안 트립신 중화 세포 현탁액을 원심 분리 후, 세포 계수를위한 신선한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
  4. 자동 계수기를 사용하여 세포 현탁액을 카운트하고 세포 배양액 200 μL에 100 만 세포를 준비한다.
    1. 제브라 피쉬 배아에 주입하기 전에 트리 판 블루 염색 배제와 세포 생존을 확인합니다.
      참고 : 만 가능한 세포 인구가 true 혈관 침공을 반영하지 않습니다 죽은 세포의 주입, 제브라 피쉬 배아에 주입한다.
  5. 100 희석 잘 혼합 한 후 20 분 동안 37 ℃에서 혼합물을 배양한다 : 1에 대한 암 세포 현탁액 레드 지용성 염료의 2 μL를 추가한다.
    참고 : 염료 및 표시 시간의 농도는 각각의 세포주에 최적화 될 필요가있다.
  6. 인큐베이션 후, 관 신선한 미디어 1ml를 추가 한 후, 5 분의 원심 분리200 × g으로.
  7. 암 세포에서 잔류 형광 염료를 씻어.
    1. 대기음 세포 펠렛으로부터 상등액을 200 x g에서 5 분 동안 신선한 배지 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리.
    2. 200 X g에서 5 분 동안 다시 다음 원심 분리기, 뜨는을 대기음 신선한 매체의 1 ML에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 : 세척 단계를 두 번 반복합니다.
    3. 200 X g에서 5 분 동안 다시 다음 원심 분리기, 뜨는을 대기음 신선한 매체의 1 ML에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 : 세척 단계 세 번째를 반복합니다.
  8. 상등액을 흡인하고, 신선한 매체 500 μL에 100 만 표시된 암 세포를 함유하는 세포 펠렛을 재현 탁.
    주 : 0.5 mM의 EDTA 세포 응집을 방지하기 위해 배지에 첨가 할 수있다.

Zebrafish의 태아의 사전 심장 부비동에 3 주입 암 세포

  1. 가압 공기 원에 미세 주입 분배 시스템을 부착하고 일을 켭니다전자 마이크로 인젝션 분배 시스템 전원 장치.
    1. 발 페달을 누름으로써 시험 압력. 공기의 짧은 펄스가 니들 홀더로부터 방출한다.
  2. 2 번 tricaine 용액 회 분사 플레이트 평형.
    1. 각 평형 단계, 10 분 동안 진탕 분사 플레이트와 장소에 2 배 tricaine 용액 20 ㎖를 추가한다.
  3. 2 번 tricaine 용액을 함유하는 작은 접시에 배아의 그룹을 전송하는 플라스틱 피펫을 사용한다.
  4. 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 암세포 마이크로 인젝션 주사 바늘 백필.
    1. 세포가 끝 근처에 정착되도록 아래로 향하게 뾰족한 끝이 전극 저장 항아리에 바늘을 놓습니다.
  5. 전송 (20) - 플라스틱 피펫에 2 배 tricaine 많이 배아를 수집하여 분사 판 (30) 마취 된 배아.
    1. 배아는 피펫의 팁에 정착하도록 허용합니다.
    2. 신사LY는 통의 길이를 따라 배아를 확산, 사출 판의 저점으로 배아를 추방.
    3. 홈통의 가파른 벽에 직면 위를 향하도록 머리와 배와 배아를 맞 춥니 다.
      주 : Tricaine 용액 배아 만 통에 상주하여, 트로프 길이 평탄 아가 표면 모두를 커버한다. 배아는 이제 주입을위한 준비가되어 있습니다.
  6. 마이크로 인젝션 분배 시스템을 이용하여 제브라 피쉬 배아 precardiac 부비동로 - (5- NL 2) 100 암세포 - (50)를 주입한다.
    1. 미세 조작기의 바늘 홀더에 바늘을 연결합니다.
    2. 왼쪽으로 60도 벽과 입체경 아래 사출 접시를 놓고 25 배 배율로 가기 배아에 초점을 맞 춥니 다.
    3. 확장 할 때, 바늘이 배아를 관통 할, 수 있도록 미세 조작기를 놓습니다.
    4. 그것은 거의 배아를 터치 할 때까지 눈으로 바늘을 확장합니다.
    5. 현미경으로 보면, t 그래서 바늘을 맞 춥니 다모자는 더 확장시 배아가 손상 될 수 있 습니 다.
    6. 피어스 단지에서 팁을 배치 난황 통해 배아 아니라에서, 전 심장 동.
    7. 풋 페달 누름으로써 세포를 주입한다. 분사의 힘은 심장 공동으로 세포를 배출한다. 바늘을 철회.
    8. 오른손을 사용하여 확장하고 주사 바늘을 후퇴. 왼쪽 손으로, 다음 배아의 위치를 ​​미세 조정합니다.
    9. 다른 판을 주입하기 위해 설정하는 동안 전극 저장 항아리에 바늘을 돌려줍니다.
  7. 전체 플레이트가 주입되면 복구 접시에 배아를 전송합니다.
    1. 구유 중 남은 배아를 세척하고, 플라스틱 피펫을 수집, 하단에있는 배아를 풀에 주입 판을 기울입니다.
    2. 배아는 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
    3. tricaine의 최소 볼륨에서 복구 접시에 배아를 전송합니다.
  8. Incuba1 시간 동안 28 ° C에서 테 복구 요리.
    1. 죽은 태아, 먼지 분리 가능한 제브라 피쉬 배아.
  9. 96 시간 - 일반적으로 24 득점을위한 준비가 될 때까지 33 ° C에서 접시를 품어.
    주 :이 온도는 37 ° C, 암 세포에 대한 적합한 온도 및 28.5 ° C, 제브라 이상적인 온도 사이의 절충으로서 결정된다.

4. 점수 혈관 외로 유출

  1. 배아의 배치는 tricaine 솔루션을 접시에 배치하여 득점 할 수 마취.
  2. tricaine 한 방울의 우울증 현미경 슬라이드에 마취 애벌레를 놓습니다.
    1. 꼬리 영역의 최적의 이미징을위한 측면 동양 애벌레.
  3. 성공적 분명히 손상 세포를 분별하는 꼬리 영역을 상하 중심으로 혈관에서 침입 한 암 세포의 수를 계산.
    참고 :이 t에 관련된 두 명 이상이하는 것이 가장 좋습니다물고기를 득점 개인이 실험 조건에 블라인드 그의 과정은 평가된다.
    1. 10 배 대물 렌즈와 복합 형광 현미경에 애벌레 점수. 어떤 어려운 통화의 20 배 목표를 사용합니다.

슬라이드 및 후속 형광 이미징 상 5. 설치 태아

  1. 1.5 % 아가로 오스 / tricaine 솔루션을 용융 및 37 ° C에 가져다.
  2. 배아를 마취하는 tricaine 용액에 배치하여 촬상한다.
  3. 촬상면에 tricaine 용액의 드롭 배아를 옮긴다. 선택적으로 유리 바닥 접시 또는 현미경 슬라이드를 사용합니다.
  4. 촬상면의 배아를 유지하면서 과량 tricaine 용액을 제거하기 위해 유리 피펫을 사용한다.
  5. 배아을 통해 용융 아가로 오스 솔루션의 한 방울을 오버레이.
  6. 신속, 아가로 오스는 중합 전에, 속눈썹 브러시처럼 섬세한 도구를 사용하여 특별한주의를주고, 이미징 측면 배아 방향을배아 있도록 촬상면 함께 평탄화된다.
  7. tricaine 솔루션에서 지금 중합 아가로 오스 드롭 잠수함.
  8. 현미경 이미징 라이브 제브라 피쉬 배아를 대상.

6. 수정 : Zebrafish의 태아의 노 른 골목 속으로 주입 암 세포

  1. 이전에이 프로토콜의 부 (3)에 설명 된대로 미세 주입 분배 시스템 및 사출 접시를 준비합니다.
  2. 이전에이 프로토콜의 부 (2)에 설명 된대로 형광 염료를 대조되는 두 개의 세포 집단 레이블.
  3. 난황에 2 × 10 ^ 7 세포 / ml의 10에서 nl - 5 주입. 각 세포 집단에서 - (200 암세포 100) 동일한 세포 수를 주입하는 주입 부피를 일정하게 유지
    참고 : 하나는이 분석을 위해 형광 혈관이 결여 투명 제브라 피쉬의 배아를 사용할 수 있습니다. 혈관에 입자의 수동 항목 또는 형광 구슬 (<10 μm의) 주입에 의해 제어 될 수 있으며, 변경기본적으로, intravsate하지 않는 세포주.
  4. 이전에 (3)이 프로토콜의 다음 성공적인 주사에 대한 화면 섹션의 설명에 따라 주입 된 배아를 복구 할 수 있습니다.
    1. 화면 성공적으로 새로운 요리에 주입 된 실행 가능한 배아를 전송하는 입체경을 사용합니다.
      참고 : 모든 배아는 노른자에있는 세포의 일관 크기의 질량이 있어야합니다. 모든 세포는 노른자의 외부에 위치하는 경우 태아는 질량 크기가 다른 경우 폐기 또는됩니다.
    2. 암 세포가 명확하게 난황에서 볼 수 있습니다 경우 새 접시에 가능한 배아를 전송합니다.
  5. 48 시간 - 일반적으로 24 득점을위한 준비가 될 때까지 33 ° C에서 접시를 품어.
    주 :이 온도는 37 ° C, 암 세포에 대한 적합한 온도 및 28.5 ° C, 제브라 이상적인 온도 사이의 절충으로서 결정된다.
  6. intravasation 점을, (4)이 프로토콜의 대신 (c)의 수를 계산 섹션에 설명 된 지침을 따르십시오성공적으로 꼬리 영역의 혈관에 침입 한 ancer 세포.

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Representative Results

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여기서 우리는 제브라 피쉬 배아 모델에서 일반적으로 사용되는 유방암 세포주 (도 1)의 혈관 침입 능력을 시험 하였다. 엄격한 기준은 암 세포가 분명히 extravasated 않았다면 포지티브 이벤트 만 계산 된 서로 다른 세포주에 대한 채점 넘쳐에서 세포 파편을 처치에서 발생할 수있는 거짓 양성을 제한하기 위해 주로 수행이 존재을 사용 하였다.

침공이 96 시간 precardiac의 동 (표 1)에 주사 후 평가 때 우리의 분석은 선 사이에 뚜렷한 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 시험 7 세포주는 MDA-MB-231 세포주를 주입 제브라 피쉬 배아 배아 당 extravasated 암세포 가장 많은 선의 허용 전이 특성 (도 2)와 일치하는 소견을 나타내었다. 우리는 또한 발견 BT-474 세포에 쉽게에게 내가이러한 MCF-7과 같은 다른 세포주, SK-BR-3, T-47D 세포 (도 3) 최소 침습 동안, 배아의 꼬리 영역으로 nvaded. 호기심 발견은 MDA-MB-468 세포를 주입 한 제브라 피쉬 배아의 약 절반이 심근 지역에서 부종이 있고이 득점하지 않은 것이 었습니다. 우리가 넘쳐 위해 정량 될 수있는 충분한 실용적 시험편을 발견하기 전에 결과, MDA-MB-468 세포를 주입 배아의 개수는 폐기 하였다. 이 표면적의 차이에도 불구하고, 혈관 외 유출이 각 시험 암 세포주 발생 주목할 만하다.

precardiac의 공동 분석의 변형으로, 우리는 자신의 혈관 침습 능력 (26)에 차이가 MDA-MB-231 세포의 두 집단이 동시에 개발 태아의 난황에 주입 하였다함으로써 경쟁 실험을 수행 하였다. 합류 배양 조건 이전을 아래에 전파 MDA-MB-231 세포주입 순환에 intravasation 감소를 나타냈다 때문에 (도 4)에 따라 채점 배아의 꼬리 영역의 감소 존재했다.

세포주 부근에 있습니다. 배아 당 # Extravasated 세포 범위
MDA-MB-231 (Subconfluent) 4 0-9
BT-474 1.5 0-4
MDA-MB-468 0.7 0-6
MCF-7 0.6 0-2
T-47D 0.3 0-2
HCC1806 0.2 0-1
SK-BR-3 0.1 0-1

표 1 : 일반적으로 유방암 세포주 2 일된 제브라 피쉬 배아 precardiac 부비동 주입 4 일 후 획득 된 사용 제브라 피쉬 유방암 세포주의 혈관 침윤성 능력 비교. 혈관에서와 꼬리 영역에 침입 암 세포는 세포 라인 당 10 배아에서 정량 하였다. extravasated 암세포의 평균 개수의 범위와 함께 표시된다.

그림 1
그림 1. Zebrafish의 암 세포 혈관 외로 유출 분석의 시각적 요약.이 분석에서 암 세포가 형광 염료로 표지되고, 그 혈관 대조 형광 기자로 표시됩니다 2 일된 제브라 피쉬 배아의 precardiac의 동, 주입. 이 다음 - 4 추가적인 일 배아의 꼬리 영역에 침입 한 암세포는얻었 후속 이미징 마취 아가 배지에 장착 될 수있다. 프로토콜의 한 부분이 개략적 인 대응에 묘사 된 각 단계는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
사일 MDA-MB-231 세포에 주입 후 Zebrafish의 배아 그림 2. 이미지 모자이크. 브라이트 (A) 및 형광 (B) 모자이크 도시. 형광 이미지는 녹색의 혈관을 나타내고 적색이 암세포를 표시하는 Z 스택의 최대 투영로서 도시된다. 스케일 바 ~ 200㎛. (C)은 배아의 꼬리 영역 extravasated 암세포를 표시하도록 확대된다. 점상 형광 라벨이 그니에 볼 수있다기. 스케일 바, 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
실험 결과의 3 예. 여기에서 혈관 외 유출이 아닌 MCF-7, SK-BR-3, T-47D 암세포 주입 배아에서 BT-474 암세포 주입 배아에서 입증된다. 화살촉은 extravasated 세포를 나타낸다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. MDA-MB-231 세포 인구의 Intravasation 이일 AF터 노 른 골목 주입. (A) 녹색 (침략)과 빨간색 (덜 침습적)과 난황 주머니 레이블 MDA-MB-231 세포. (B) 꼬리에 도달하기 위해 혈관을 침공 MDA-MB-231 세포와 꼬리 영역 지역. (C) 꼬리 지역에서 intravasated MDA-MB-231 세포와 제브라 피쉬 배아의 수 이일 주사 26 일 후. 스케일 바, 250 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 기술은 효과적으로 암세포 (도 1 참조)의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 모델을 이용한다. (- 3,도 2, 표 1 참조) 여기에서는, 다른 연구자들은 다음 자신의 연구를 구축 할 수가있는 기준을 제공하기 위해 유방암 세포주의 패널 기술을 적용 하였다. MDA-MB-231 세포가 쉽게 제브라 피쉬 배아의 꼬리 영역에 침입 관찰은 혈관 침윤을 억제 할 수 에이전트를 테스트하기 위해이 셀 라인에 적합 할 것. 예를 들어 HCC1806 또는 MDA-MB-468 세포와 같은 비교적 덜 침습적 세포주는 달리 혈관 침략을 강화시킬 것이다 요인을 연구하기 위해 사용될 수있다. 이런 종류의 실험 약물의 포함을 요구할 경우에는 하나의 처리 효과는 내구성이 예상되는지 여부에 따라 전달 두 가지 경로를 갖는다. 암 세포는 약물 주입 이전에 예비 처리 될 수있다배아 또는 약물은 직접 확산에 의해 암 세포에 영향을 미칠 배아를 수용 물에 첨가 될 수있다.

우리의 비교에서는, 96 h 삭제 precardiac 상악동으로 주사 후 제브라 피쉬 배아 꼬리 암세포의 혈관 외 유출을 분석 하였다. MDA-MB-231 셀 경쟁 분석의 경우, 순환에 intravasation는 난황 주입 후 48 시간을 평가 하였다. 분석을 위해 선택된 시점들은 일반적으로 어떤 실험 피크 혈관 외 유출이 주입 바로 다음 24 시간이 발생할 수 있으며, 각각의 세포주에 대한 최적화를 필요로한다. 그것은 그들이 따라서, 암세포에서 형광 부스러기 식세포 또는 호중구 등의 면역 세포에 의해 잠겼 수 암세포 (27)와, 주입 될 때 제브라 피쉬 배아 기능 선천 면역을 가지고 주목할 가치가있다. extravasat을 득점 할 때 선천성 면역 체계의 활동 따라서 잠재적으로 위양성 형광 라벨을 만들 수 있습니다이온; 치료 만 견고 적절한 채널에서 형광 세포 점수를 부여해야합니다. 현재 암 연구 암전 28을 향상 면역계 연루되기 때문에, 제브라 피쉬 배아 모델 암세포 선천성 면역계 사이에 발생하는 크로스 토크의 검사를 허용하여이 영역에 고유의 식견을 제공 할 수있다. 이 아이디어는 최근 연구의 몇 가지들 수있다. 이러한 연구의 첫번째 제브라 내의 VEGFR 억제가 암세포의 전이 (29) 동작을 유도하는 호중구의 능력을 강화하는 것이 보였다. 두 번째 연구는 인간 암 세포의 수용체가 감지 및 지브라 피쉬 리간드 (30)에 응답하고, 그 침입 능력과 상관 암세포 CXCR4 발현 할 수 있다는 축 시그널링 CXCR4-CXL12 면역 케모카인은 제브라 내에 그대로되었습니다 동물 모델에서. 또한, exhibi 그 제브라 피쉬 대 식세포를 증명했다테드 인간의 CXCL12 향해 화성 응답. 형광 표지 호중구 31와 제브라 배아 균주, 예를 들면, 상기 모델에서의 면역 체계와 암세포 간의 상호 작용을 조사하기 위해 이용 될 수있다.

프로토콜에서 몇 단계는 특별한주의가 필요합니다. 먼저, 암 세포는 배아에 주입하는 동안 바늘 막힘을 방지하기 위해, 단일 세포 현탁액 내로 해리되는 것이 필수적이다. 세포 응집체는 혈액의 흐름을 차단하고, 따라서 분석 비틀림 꼬리 영역으로 여행하는 암 세포의 능력을 방해 할 수있다. 이 경우 셀룰러 집계도 믿을 수없고 추천도이 지역에 살고있는 암세포의 침습 기능을한다 득점, 혈관이 파열 유도하고있다. 또 다른 잠재적 인 문제 영역은 형광 염료로 암 세포를 라벨에 관한 것이다. 우리의 실험실에 의해 실행 실험에서 우리가 발견 한 친 유성 염료가,예 DII 같은 가장 라벨을 생성하는 경향이 아직 형광 레벨은 세포주 사이에서 다양 할 수있다. 이 때문에, 암 세포의 형광 표지가 위에 라벨링을 방지하기 위해 이전의 수정란 내로 주입 최적화되어야한다. 그들이 라벨링 한 후 과량의 염료 멀리 암세포에서 세척되고,이 프로토콜의 라벨링 부에 표시된 각종 원심 분리 단계에 의해 달성되는 것이 중요하다; 다음 단계는 불필요한 것처럼 보일 수 있지만, 그들은 절대적으로 필요하다. 너무 많은 형광 염료는 세포에 독성 또는 인공적인 형광 배경을 생산, 혈류로 누출 할 수 있습니다. 이러한 많은 문제는 형광 단백질을 발현하는 암 세포의 사용을 통해 피할 수 있고, 이는 가능하면 이러한 시스템은 형광 염료 대신에 사용하는 것을 추천합니다. 암 혈관 외 유출에 대한 배아를 기록 할 때 마지막으로, 모든 조건에 일치하는 기준을 적용하는 것이 필수적이다. 우리는 일 찾기득점 단계에서 두 명 이상을 포함에서 과학적 엄격 성을 유지하는 데 도움이 : 한 개인이 슬라이드를 준비하고 그 결과를 기록하는 임무입니다, 다른 개인이 혈관 외 유출 평결을 렌더링하고 조건에 블라인드가 평가되고 유지된다. 기록 할 때, 하나의 꼬리 영역 extravasated 암세포 정량 또는 비교의 용이성을 위해 이진 기준을 만들 수 있습니다. 전체 세포 낮은 배율 (그림 3)에서 분별하기가 더 쉽습니다하지만 형광 암 세포를 염색하는 것은, 매우 높은 배율 (그림 2C)에서 볼 수 점상 라벨을 생산, 후반 득점을 권장합니다. 혈관 외 유출의 더 모호한 경우를 판단하는 것은 꼬리 영역에있는 모든 세포의 비율로 혈관 외 유출을 정량하는 것은 배아에 암 세포의 불평등 로딩 제어 할 수있는 공 초점 현미경에 광학 조각의 취득에 의해 도움을받을 수있다.

요그것은 세포의 더 많은 수를 허용하고, 따라서 더은 세포 집단 내에서 이질성을 수용로 주입 경로는 SAC LK precardiac 부비동 다르다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 몇몇 차별적 표지 세포 집단 동시에 그들의 능력 침입 패턴을 비교 난황에 주입 될 수있다. 주입 된 세포의 혈관 신생 능력과 혈관 확장 모집 꼬리 영역으로 암세포 항목을 용이하게 할 수 있지만,이 형태는 아직 분석되지 않았다. 기술적 SAC 주사 비록 precardiac 부비동 주입보다 쉽게 ​​수행 할 노른자 한편, 난황은 암세포의 이탈을 저해 할 수있는 영양이 풍부한 환경이다. 노른자 혈관 근처 주입 조기에 순환 암 세포를 도입 할 수 있으며, 따라서, 하나의 신중 것이지 주사 스크리닝해야 채점에서 이러한 배아를 생략하는 것도 가능하다. 마지막으로, 그것은 중요 t이다O는 쥐 또는 인간의 유사한 기본 사이트 부족으로 노른자의 미세 환경이 다소 인공 있음을 유의하십시오.

암 전이를 예측하고자 다양한 모델 시스템은 장점과 단점이없는 것은 아니다 및 지브라 피쉬 혈관 외 유출 분석도 예외는 아니다. 큰 장점으로,이 분석은 기능 순환 시스템 내에서 혈관 침습 능력의 평가를 허용하고 실험 질문은 몇 일 후에 답변을 얻을 수 있습니다. 빠른 처리 시간을 감안할 때, 이러한 시스템들은 단지 주화 세포 라인의 적극적인 행위를 조사하기 위해 사용될뿐만 아니라, 신선 인간 암 환자로부터 샘플을 분리 할 수있다. 가장 큰 단점은이 모델이 혈관 침공에만 초점을 맞춤으로써 전이성 캐스케이드의 초기 및 최신 이벤트를 생략한다는 것입니다. 또한, 이러한 피쉬 배아 주입 인간 암세포 분명 동계 환경과 상호 t 일부에서 동작하지그는 결과적으로 손실 될 수 있습니다 기질. 우리가 암의 혈관 침습 능력 통로 (26)와 각질 관련 단백질 5-5 (32) 시그널링 하마의 역할을 보여 고용 한 이러한 한계에도 불구하고, 제브라 피쉬 배아 모델은 모두 기본 및 번역 암 연구의 자격이 자리하고있다 세포. 따라서,이 모델은 진행된 유방암의 주요 특징 전이성의 조사를 돕기위한 가능성이있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100 mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

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Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)
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Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).More

Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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