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Cancer Research

Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra ( doi: 10.3791/55007 Published: November 3, 2016

Summary

Este método utiliza embriones de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva de células de cáncer vascular. células de cáncer fluorescentes se inyectan en el seno precardiaco o saco vitelino de embriones en desarrollo. células de cáncer de invasión vascular y la extravasación se evalúa a través de microscopía de fluorescencia de la región de la cola 24 a 96 horas más tarde.

Introduction

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La enfermedad metastásica es la causa principal de mortalidad por cáncer y muchos mecanismos que permiten la difusión de células de cáncer aún no se han descubierto 1. A fin de que una célula de cáncer de metástasis con éxito, debe invadir primero a través del estroma que rodea a un tumor primario, introduzca (intravasate) en el sistema circulatorio, sobrevivir en tránsito, salida (extravasate) de la circulación, y, por último establecer una colonia viable en el sitio de órgano distante 2. Intravasación y extravasación son, pues, los pasos cruciales en la cascada metastásica, sin embargo, cada célula de cáncer no es inherentemente adeptos a interrumpir y migrar a través de uniones endoteliales 3. De hecho, hay una serie de presiones de selección únicos que rodean la invasión vascular de células de cáncer y el proceso puede ser influenciada además por una variedad de factores endógenos y exógenos 4. Por estas razones, las técnicas que prueban la conducta agresiva de cáncer en etapa avanzada a menudo se centran en vascular capacidad invasora como un medio para predecir la propagación metastásica.

Existen diversos sistemas de modelos para facilitar el estudio de la invasión vascular de células de cáncer in vitro. El más utilizado en ensayos in vitro incluyen ya sea sistemas Transwell para evaluar la migración de células de cáncer a través de una barrera endotelial 5 o la tecnología eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM) para controlar la interrupción en tiempo real de una monocapa endotelial intacta por las células cancerosas 6. Estos ensayos suelen carecer de la dinámica de fluidos y los factores estromales que de otra manera afectar a la unión de células de cáncer a una pared endotelial. Este problema es algo eludirse mediante redes vasculares perfusable que surgen a partir del cultivo de endotelio 3D con el apoyo a las células del estroma, y estos sistemas de microfluidos 3D ahora representan la vanguardia de las actuales opciones in vitro 7,8. Sin embargo, estos enfoques omiten el microambiente robusta de un sistema circulatorio funcionaly por lo tanto sólo en parte sustituto para los modelos in vivo.

El más ampliamente utilizado en el modelo in vivo de la invasión vascular es el ratón, en el cual ensayos de metástasis experimentales se realizan comúnmente debido a que ocurren en escalas de tiempo relativamente cortos y generalmente son indicativas de la capacidad metastásica 9. Estos ensayos implican la inyección directa de células cancerosas en circulación y por lo tanto modelar las etapas finales de la metástasis, es decir, la extravasación de células cancerosas y colonización de órganos. Los ensayos de metástasis experimentales difieren según el lugar de la inyección de células de cáncer y en última instancia, los órganos analizados. En el primer tipo de ensayo, se inyectan células de cáncer en la vena caudal de los ratones y la siembra de células de cáncer en los pulmones se monitoriza 10,11. El segundo ensayo implica la realización de inyecciones intracardiacas para dirigir la siembra metastásica hacia el microambiente de la médula 12-14, sino también el cerebro 15. En la tercera ensayo, cáncer de cells se inyectan en el bazo con el fin de permitir la colonización del hígado 16 mientras que la cuarta ruta de entrega en la arteria carótida transporta las células cancerosas en el cerebro 17,18. Independientemente del método de entrega de células de cáncer, la colonización de órganos es el punto final experimental aceptado y se determina generalmente por medio de luminiscencia, histología, o técnicas basadas en PCR. A pesar de las ventajas fisiológicas de la realización de ensayos de metástasis experimentales dentro de un huésped murino, estos experimentos aún requieren semanas o meses para completar y analizar.

El modelo de pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un nuevo sistema para estudiar la progresión del cáncer 19,20, y permite la evaluación de la invasión vascular de células cancerosas dentro de un sistema circulatorio funcional sobre una escala de tiempo mucho más corto en comparación con los ratones 21-24. El método utiliza una cepa de pez cebra transparente que tiene su endotelios etiquetadas con un arrecife de coral verde fluoreportero proteína rescent dirigido por el promotor kdrl, el receptor de pez cebra para el factor de crecimiento endotelial vascular 25. En el ensayo, las células cancerosas se marcan con un marcador fluorescente rojo y se inyectan en el seno precardiaco de embriones de 2 días. En cualquier lugar entre 48 a 96 horas después de la inyección, las células cancerosas que han invadido fuera de la vasculatura y en la región caudal de embriones pueden ser marcados de manera eficiente en un microscopio de fluorescencia. Aquí aplicamos la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama humano comúnmente utilizados para demostrar grandes diferencias en su capacidad invasiva vascular. Además, se demuestra que el cambio de la zona de inyección al saco embrionario yema permite el estudio de las interacciones celulares heterogéneas, como las poblaciones celulares de cáncer pueden ser diferencialmente marcadas con colorantes fluorescentes y se inyectan en embriones de pez cebra que carecen de vasculatura fluorescente. En este último ensayo, las células cancerosas que han invadido la yema y intravasated en el vasculature se anotó en la región caudal de 24 a 48 horas después de la inyección. Debido a la eficacia y la comodidad de este modelo, el pez cebra se emplean cada vez más para probar rápidamente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas bajo un entorno fisiológico.

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Protocol

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Declaración de Ética: embriones de pez cebra fueron generados de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC. Estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.

1. Organizar embriones para inyección y crear stock Soluciones

  1. Generar larvas de pez cebra requisito para evaluar la invasión vascular de células de cáncer.
    1. Establecer por pares o grupos en forma cruzada de acoplamiento con Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peces.
      NOTA: Hemos generado Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; b140 pez cebra ednrb1, mediante el cruce de Tg (kdrl: grcfp) Zn1 25, que expresan los arrecifes de la proteína verde fluorescente de coral en las células endoteliales, con una línea que carece de células pigmentarias, mitfa b692; ednrb1 b140, desarrollado en el Centro de recursos Internacional de pez cebra.
    2. Cohuevos llect, limpiar y retirar los embriones fertilizados o deformadas el próximo día 22.
    3. Incubar embriones en 28,5 ° C hasta el momento de la inyección con las células cancerosas, que se producen cuando los embriones de pez cebra son 2-días después de la fertilización (2 dpf).
  2. Hacer placas de inyección.
    1. Derretir 25 ml de agarosa al 1,5% en dH2O para cada plato.
    2. Verter 12 ml de la agarosa en un 100 mm x 15 mm placa de Petri y dejar que se endurezca.
    3. Vuelva a derretir y verter los agarosa restantes en la placa.
    4. Inmediatamente colocar un molde de vidrio de corte (3 mm x 7,2 cm de ancho x 7,5 cm de longitud) de manera que es en un ángulo de 30 grados a la agarosa y se coloca en el centro de la placa.
      NOTA: Esto creará una empinada pared de 60 ° y una rampa inclinada 30 °.
    5. Tape el molde de vidrio en su lugar y dejar que se endurezca la agarosa.
    6. Retire con cuidado el molde de vidrio y tenga cuidado de no romper la agarosa.
      NOTA: Los moldes se pueden almacenar en H2O destilada a 4 ° C.
  3. Equilibrar placa de inyección con agua de pescado (0,3 g / l de sal de mar).
    1. placa de enjuague dos veces con agua destilada.
    2. Equilibrar la placa mediante la adición de 10 ml de agua de pescado a la plancha y el lugar en un agitador durante 10 minutos.
    3. Equilibrar la placa una segunda vez con agua los peces.
  4. Dividir embriones de 2 días después de la fertilización (DPF) en grupos de inyección transfiriéndolos en platos de pescado que contienen agua 22.
  5. Preparar platos de recuperación para cada grupo para utilizar después de la inyección. Asegúrese de que el plato de recuperación contiene agua 10 ml de pescado, además de penicilina (25 mg / ml) y estreptomicina (50 mg / ml).
  6. Preparar la solución de tricaína 2x mediante la adición de 4 ml de tricaína tamponada de valores (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) a 50 ml de agua de pescado más penicilina y estreptomicina.
  7. Disolver agarosa 15 mg de bajo punto de fusión en 10 ml de solución de tricaína 2x para generar un medio anestésico de montaje que inmovilizará embriones vivos para IMAGingramo.
    NOTA: El montaje consiste en medio de agarosa al 1,5%.
  8. Tire las agujas de microinyección.
    1. Colocar tubos capilares de vidrio en un extractor de pipeta vertical. Tire pipetas largo cónicos utilizando actual mAmp 20 y un elemento de calentamiento de 2 espirales.

2. Las células de cáncer de etiquetado con colorante fluorescente lipofílico

  1. Mantener las células cancerosas en sus condiciones de cultivo recomendadas.
    NOTA: Estas líneas se mantuvieron en DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, y SK-BR-3. Estas líneas se mantuvieron en RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 y T-47D. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la incubación.
  2. Generar una suspensión de una sola célula disociando un cultivo adherente de las células cancerosas.
    1. Lavar las células primero con PBS y después se trata con una solución de tripsina-EDTA 0,05%.
      NOTA: el tiempo de exposición tripsina dependerá de la línea celular.
    2. Neutralizar la solución de tripsina con SEmedios de cultivo celular después de que las células se desprenden contiene ron.
  3. Centrifugar la suspensión celular de tripsina-neutralizado durante 5 min a 200 xg, a continuación, volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo fresco para el recuento de células.
  4. Contar la suspensión de células usando un contador automatizado y preparar 1 millón de células en 200 l de medio de cultivo celular.
    1. Verificar la viabilidad celular con exclusión de tripan colorante azul antes de la inyección en embriones de pez cebra.
      NOTA: Sólo las poblaciones de células viables deben inyectarse en embriones de pez cebra, como la inyección de las células muertas no reflejarán la verdadera invasión vascular.
  5. Añadir 2 l de colorante lipófilo roja a la suspensión de células de cáncer para una dilución 1: 100, mezclar bien, y luego se incuba la mezcla a 37 ° C durante 20 min.
    NOTA: La concentración del colorante tiempo y el etiquetado puede necesitar ser optimizado para cada línea celular.
  6. Después de la incubación, añadir 1 ml de medio fresco al tubo y centrifugar durante 5 min a200 x g.
  7. Eliminar el colorante fluorescente residual de las células cancerosas.
    1. Aspirar el sobrenadante del sedimento celular, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de cultivo fresco, y se centrifuga durante 5 min a 200 x g.
    2. Repetir la etapa de lavado una segunda vez: aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio fresco y centrifugar de nuevo durante 5 min a 200 x g.
    3. Repetir la etapa de lavado tercera vez: aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio fresco y centrifugar de nuevo durante 5 min a 200 x g.
  8. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular que contiene 1 millón de células de cáncer etiquetados en 500 l de medio fresco.
    NOTA: mM EDTA 0,5 se puede agregar a los medios de comunicación para evitar la aglutinación de células.

3. Inyectar células de cáncer en el seno antes de la circulación de embriones de pez cebra

  1. Adjuntar sistema de dispensación de microinyección a una fuente de aire a presión y girar en el the microinyección fuente de alimentación del sistema de dispensación.
    1. Presión de prueba presionando el pedal del pie. Un breve impulso de aire debe emitir desde el soporte de la aguja.
  2. Equilibrar las placas de inyección de dos veces con la solución 2x ​​tricaína.
    1. Para cada paso de equilibrado, añadir 20 ml de solución de tricaína 2x a la placa de inyección y el lugar en un agitador durante 10 min.
  3. Utilice pipeta de plástico para transferir un grupo de embriones a una pequeña placa que contiene la solución 2x ​​tricaína.
  4. Rellene la aguja de inyección microinyección con células de cáncer utilizando una punta de pipeta de carga de gel.
    1. Colocar la aguja en un recipiente de almacenamiento de electrodo con el extremo puntiagudo hacia abajo lo que las células se depositan cerca de la punta.
  5. Transferir 20 - 30 embriones anestesiados a una placa de inyección por la recogida de los embriones con un montón de 2x tricaína en una pipeta de plástico.
    1. Permitir que los embriones se asienten en la punta de la pipeta.
    2. CaballeroLy expulsar los embriones en la pila de la placa de inyección, la difusión de los embriones a lo largo de la longitud de la cubeta.
    3. Alinear los embriones con la cabeza hacia arriba y vientres que enfrenta la escarpada pared de la cubeta.
      NOTA: la solución Tricaína debe abarcar tanto la longitud y la superficie a través de agarosa plana, con embriones únicamente con domicilio en la artesa. Los embriones son ahora lista para la inyección.
  6. Inyectar 50 - 100 células cancerosas (2-5 nl) en el seno precardiaco de los embriones de pez cebra utilizando el sistema de microinyección de dispensación.
    1. Ponga la aguja en el soporte de aguja de un micromanipulador.
    2. Coloque la placa de inyección bajo el estereoscopio con la pared de 60 grados a la izquierda y se centran en la parte superior del embrión con 25 aumentos.
    3. Coloque el micromanipulador para que, cuando está extendido, la aguja perforará el embrión.
    4. Extender la aguja por el ojo hasta que está casi tocando el embrión.
    5. Mirando bajo el microscopio, alinear la aguja de manera tsombrero que perforará el embrión en una mayor extensión.
    6. Pierce el embrión a través del saco vitelino colocando la punta justo en, pero no en, el seno pre-cardíaca.
    7. Inyectar células presionando el pedal del pie. La fuerza de la inyección expulsa las células en el seno cardiaco. Retraer la aguja.
    8. Con la mano derecha, extender y retraer la aguja de inyección. Con la mano izquierda, hacer ajustes precisos en la posición próxima embrión.
    9. Devolver la aguja a la jarra de almacenamiento de electrodo mientras se configura para inyectar otra placa.
  7. La transferencia de los embriones al plato recuperación una vez que se inyecta toda la placa.
    1. Inclinar la placa de inyección a la piscina de los embriones en la parte inferior, el lavado de los embriones restantes fuera de la pila, y su recogida con la pipeta de plástico.
    2. Permitir que los embriones se asienten en la parte inferior de la pipeta.
    3. La transferencia de los embriones al plato de recuperación en un volumen mínimo de tricaína.
  8. Incubadorasplato de la recuperación del te a 28 ° C durante 1 hora.
    1. Separados embriones de pez cebra viables a partir de embriones muertos y otros desechos.
  9. Incubar plato a 33 ° C hasta que esté listo para la puntuación, normalmente de 24 - 96 horas.
    NOTA: Esta temperatura se determina como un compromiso entre 37 ° C, la temperatura ideal para las células cancerosas, y 28,5 ° C, la temperatura ideal para el pez cebra.

4. La extravasación de puntuación

  1. Anestesiar el lote de embriones que se anotó colocándolas en un plato con una solución tricaína.
  2. Coloque una larvas anestesiado en un portaobjetos de microscopía de la depresión en una gota de tricaína.
    1. larvas Orient lateralmente para la imagen óptima de la región caudal.
  3. Contar el número de células cancerosas que han invadido con éxito de la vasculatura, centrándose arriba y hacia abajo a través de la región de la cola de discernir claramente las células intactas.
    NOTA: Lo mejor es tener al menos dos individuos involucrados en tsu proceso, donde el individuo meter el pescado es ciego a la condición experimental que está siendo evaluada.
    1. Puntuación larvas en un microscopio de fluorescencia compuesto con la lente de objetivo de 10x. Utilice el objetivo 20x para cualquier llamada difíciles.

5. Los embriones de montaje en portaobjetos y Fluorescencia de Imagen Con posterioridad

  1. Derretir solución de agarosa / tricaína 1,5% y llevar a 37 ° C.
  2. Anestesiar el embrión para formar una imagen mediante la colocación en solución tricaína.
  3. Transferir el embrión en una gota de solución de tricaína a la superficie de formación de imágenes. utilizar opcionalmente un plato o un microscopio de diapositivas con fondo de vidrio.
  4. Usar una pipeta de vidrio para eliminar la solución tricaína exceso, reteniendo el embrión en la superficie de formación de imágenes.
  5. Superposición de una gota de solución de agarosa derretida sobre el embrión.
  6. Rápidamente, antes de que la agarosa se polimeriza, utilizar una herramienta delicada, como un cepillo de pestañas, para orientar el embrión lateralmente para la imagen, dando un cuidado especialpara asegurarse de que el embrión se aplana a lo largo de la superficie de formación de imágenes.
  7. Sumergir la gota de agarosa ahora polimerizado bajo tricaína solución.
  8. Se somete el embrión de pez cebra en vivo de imágenes microscópicas.

6. Modificación: La inyección de células cancerosas en el saco vitelino de embriones de pez cebra

  1. Preparar las placas de sistema de inyección y la microinyección de dispensación como se ha descrito anteriormente en la sección (3) de este protocolo.
  2. Etiquetar dos poblaciones de células en contraste con tintes fluorescentes como se ha descrito anteriormente en la sección (2) de este protocolo.
  3. Inyectar 5-10 nl de 2 x 10 ^ 7 células / ml en el saco vitelino. Mantener constante el volumen de inyección para inyectar el número de células idénticas (100 - 200 células cancerosas) de cada población celular
    NOTA: Se puede utilizar embriones de pez cebra transparentes que carecen de vasculatura fluorescente para este ensayo. entrada pasiva de las partículas en la vasculatura puede ser controlado para mediante la inyección de perlas fluorescentes (<10 micras) o, alterarde forma nativa, una línea celular que no intravsate.
  4. Recuperar los embriones inyectados como se ha descrito anteriormente en la sección (3) de este protocolo y luego la detección de inyecciones exitosas.
    1. Utilice un estereoscopio para defender y para transferir los embriones viables que fueron inyectados con éxito a un nuevo plato.
      NOTA: Todos los embriones deben tener una masa de tamaño consistente de células situadas en la yema. Los embriones se descartan si el tamaño de la masa difiere o si las células están situadas fuera de la yema.
    2. La transferencia de los embriones viables para un nuevo plato si las células cancerosas se ven claramente en el saco vitelino.
  5. Incubar plato a 33 ° C hasta que esté listo para la puntuación, por lo general de 24 - 48 h.
    NOTA: Esta temperatura se determina como un compromiso entre 37 ° C, la temperatura ideal para las células cancerosas, y 28,5 ° C, la temperatura ideal para el pez cebra.
  6. Para anotar intravasación, sigue las instrucciones descritas en el apartado (4) de este protocolo, pero en lugar de contar el número de ccélulas Ancer que han invadido con éxito en el sistema vascular de la región caudal.

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Representative Results

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Aquí hemos probado la capacidad invasiva vascular de líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados en un modelo de embrión de pez cebra (Figura 1). Se emplearon criterios rigurosos en la extravasación de puntuación para estas diferentes líneas celulares, donde los acontecimientos positivos sólo si se contaron las células cancerosas habían extravasado claramente, este ser hecho principalmente para limitar los positivos falsos que podrían derivarse de anotar los restos celulares.

Nuestro análisis reveló marcadas diferencias entre las líneas cuando la invasión se evaluó 96 h después de la inyección en el seno precardiaco (Tabla 1). De las 7 líneas celulares ensayadas, embriones de pez cebra inyectados con la línea celular MDA-MB-231 exhibieron el mayor número de células cancerosas extravasated por embrión, un hallazgo que es coherente con la naturaleza metastásica aceptada de la línea (Figura 2). También se encontró que las células BT-474 fácilmente invaded en la región caudal de los embriones, mientras que otras líneas celulares, tales como las células MCF-7, células SK-BR-3 y T-47D, eran mínimamente invasiva (Figura 3). Un descubrimiento curioso es que aproximadamente la mitad de los embriones de pez cebra inyectados con las células MDA-MB-468 tenía edema en la región cardial y estos no se anotó. Como consecuencia, un número de embriones inyectados con las células MDA-MB-468 se descartaron antes de encontrar suficientes muestras viables que pudieran cuantificarse para la extravasación. A pesar de estas diferencias ostensibles, es notable que la extravasación se produjo con cada línea celular de cáncer de prueba.

Como una modificación al ensayo precardiaco sinusal, se realizó un experimento de competición por el que dos poblaciones de MDA-MB-231 células que difieren en su capacidad invasora vascular 26 se inyectaron simultáneamente en el saco vitelino de embriones en desarrollo. células MDA-MB-231 reproducidos en condiciones de cultivo confluente anteriorespara inyección mostraron una reducción en la intravasación en la circulación y por lo tanto tenía una presencia reducida en la región caudal de los embriones en puntuación (Figura 4).

Línea celular Avg. # Las células extravasado por embrión Distancia
MDA-MB-231 (subconfluentes) 4 0-9
BT-474 1.5 0-4
MDA-MB-468 0,7 0-6
MCF-7 0,6 0-2
T-47D 0,3 0-2
HCC1806 0,2 0-1
SK-BR-3 0,1 0-1

Tabla 1: Comparación de la capacidad invasora vascular de líneas celulares de cáncer de mama en el pez cebra comúnmente usados líneas celulares de cáncer de mama fueron inyectadas en el seno precardiaco de 2 días de edad embriones de pez cebra y anotó 4 días más tarde. Las células cancerosas invasoras de la vasculatura y en la región caudal se cuantificaron en 10 embriones por línea celular. El número medio de células de cáncer de extravasados ​​se indica junto con la gama.

Figura 1
Figura 1. Visual Resumen de la célula cancerosa de pez cebra extravasación de ensayo. En este ensayo, las células cancerosas se marcan con un colorante fluorescente y se inyectan en el seno precardiaco de 2 días de edad embriones de pez cebra, cuyo vasculatura está marcado por un indicador fluorescente de contraste. Después de 2 - 4 días adicionales, las células cancerosas que han invadido en la región caudal del embrión sonmarcado y se puede montar en un medio de agarosa anestésico para la imagen posterior. Cada paso se representa en esto corresponde a una sección esquemáticas del protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Imagen de mosaico de un embrión de pez cebra 4 días después de la inyección con MDA-MB-231 células. Brightfield (A) y mosaicos fluorescentes (B) muestran. Fluorescente imágenes se representan como la proyección máxima de una pila Z, en el que un color verde indica la vasculatura y un color rojo indica las células cancerosas. Barra de escala, 200 micras. (C) región caudal del embrión se amplía para mostrar las células cancerosas extravasated. Punteada marcaje fluorescente se ve en magnificación. Barra de escala, 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Ejemplo de resultados experimentales. Aquí se demuestra la extravasación en un embrión inyectado con células de cáncer de BT-474, pero no en un embrión inyectado con, SK-BR-3 células de cáncer, y T-47D MCF-7. Las puntas de flecha indican las células extravasated. Barra de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. intravasación de MDA-MB-231 poblaciones de células 2 días after saco vitelino de inyección. (A) del saco vitelino con el verde (invasor) y rojo (menos invasiva) etiquetada La región caudal con células MDA-MB-231 que invadió la vasculatura para llegar a la cola MDA-MB-231 células. (B) región. (C) el número de embriones de pez cebra con intravasated MDA-MB-231 células en la región caudal 2 días después de la inyección 26. Las barras de escala, 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Esta técnica utiliza el modelo de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas (véase la Figura 1). A continuación se aplicó la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama con el fin de proporcionar una línea de base sobre la que otros investigadores pueden construir sus propios estudios (véase la Tabla 1. Las figuras 2 - 3). La observación de que MDA-MB-231 células fácilmente invadieron en la región caudal de embriones de pez cebra haría que esta línea celular ideal para agentes que podrían inhibir la invasión vascular de prueba. líneas celulares comparativamente menos invasivas, como las células HCC1806 o MDA-MB-468 por ejemplo, se podrían emplear para estudiar los factores que de otro modo potenciar la invasión vascular. Si estos tipos de experimentos requieren la inclusión de fármacos, entonces uno tiene dos rutas distintas de la entrega, dependiendo de si se espera que el efecto del tratamiento para ser duradera. Las células cancerosas pueden tratarse previamente con el fármaco antes de la inyección enlos embriones o el fármaco se pueden añadir directamente al agua que aloja los embriones donde tendrá un impacto en las células cancerosas por difusión.

En nuestra comparación, se analizaron la extravasación de células cancerosas en la cola embrión de pez cebra 96 ​​h después de la inyección en el seno precardiaco. Para el ensayo de competición de células MDA-MB-231, intravasación en circulación se evaluó 48 horas después de la inyección del saco vitelino. Los puntos de tiempo elegido para el análisis típicamente requieren la optimización para cada línea celular, donde, para algunos experimentos, pico extravasación puede ocurrir justo 24 horas después de la inyección. Vale la pena señalar que los embriones de pez cebra tienen un sistema inmune innato funcional cuando son inyectados con células de cáncer de 27 y, en consecuencia, los desechos fluorescente de las células cancerosas puede ser absorbido por las células inmunes como los macrófagos o neutrófilos. Actividad del sistema inmune innato puede por lo tanto potencialmente crear el marcaje fluorescente de falsos positivos cuando se trata de marcar extravasation; se debe tener cuidado al anotar solamente las células que presentan fluorescencia con fuerza en el canal apropiado. Dado que la investigación del cáncer de corriente se implicando el sistema inmune en el aumento de la metástasis del cáncer 28, el modelo de embrión de pez cebra puede proporcionar una visión única de esta área por lo que permite el examen de la diafonía se produce entre las células cancerosas y el sistema inmune innato. Esta idea se ejemplifica por un par de estudios recientes. El primero de estos estudios demostraron que la inhibición de VEGFR dentro de pez cebra mejoró la capacidad de los neutrófilos para provocar comportamiento metastásico de células de cáncer de 29. Un segundo estudio mostró que el CXCR4-CXL12 inmune eje de señalización de quimioquinas está intacto en el pez cebra, como el receptor en las células cancerosas humanas era capaz de detectar y responder al ligando de pez cebra 30, y la expresión de CXCR4 en células de cáncer correlacionada con su capacidad invasiva en el modelo animal. Además, se demostró que los macrófagos de pez cebra exposited una respuesta quimiotáctica hacia CXCL12 humano. Una cepa embrión de pez cebra con los neutrófilos marcados con fluorescencia 31, por ejemplo, podría ser utilizado para explorar más a fondo las interacciones celulares de cáncer con el sistema inmune en este modelo.

Unos pasos en el protocolo requieren una atención especial. En primer lugar, es esencial que las células cancerosas pueden disociar en una suspensión de una sola célula con el fin de evitar la obstrucción de la aguja durante la inyección en los embriones. los agregados celulares también pueden bloquear el flujo de sangre y de interferir con la capacidad de las células cancerosas para viajar en la región caudal, sesgando así el análisis. agregados celulares también pueden inducir a los vasos sanguíneos se rompan y, si esto ocurre, anotando la capacidad invasiva de las células cancerosas vivas en estas regiones es fiable ni recomendable. Otra área potencial problema se refiere a el etiquetado de las células cancerosas con el colorante fluorescente. En experimentos llevados a cabo por nuestro laboratorio, se ha encontrado que los colorantes lipófilos,Dil como por ejemplo, tienden a producir la mejor etiquetado, sin embargo, su nivel de fluorescencia puede variar entre las líneas celulares. Por esta razón, el marcaje fluorescente de células de cáncer debe ser optimizado antes de la inyección en los embriones con el fin de evitar el exceso de etiquetado. Es crítico que el exceso de tinte se elimina por lavado de las células de cáncer después de que han sido etiquetados, y esto se logra por las diversas etapas de centrifugación que se indican en la sección de etiquetado del protocolo; estos pasos pueden parecer superfluo, pero son absolutamente necesarias. El exceso de colorante fluorescente puede ser tóxico para las células o escape, en el torrente sanguíneo, produciendo un fondo fluorescente artefactual. Muchos de estos problemas pueden ser eludidas mediante el uso de células cancerosas que expresan las proteínas fluorescentes, y se recomienda que se utilicen estos sistemas en lugar del colorante fluorescente cuando sea posible. Por último, cuando se calificaron los embriones para la extravasación de cáncer, es imperativo aplicar criterios coherentes para todas las condiciones. Nos encontramos THen el que participen al menos dos individuos en la etapa de puntuación ayuda a mantener el rigor científico: un individuo tiene la tarea de preparar las diapositivas y el registro de los resultados, mientras que la otra persona hace que el veredicto de la extravasación y se mantiene ciegos a la condición que está siendo evaluado. Al puntuar, se puede ya sea cuantificar las células de cáncer extravasados ​​en la región de la cola o crear criterios binarios para facilitar la comparación. Fluorescentemente el teñido de las células de cáncer produce etiquetado puntiforme que será visible a muy gran aumento (Figura 2c), aunque las células enteras son más fáciles de discernir en aumento menor (Figura 3), se recomienda el último de los cuales para la puntuación. A juzgar casos más ambiguos de la extravasación puede ser ayudado por la adquisición de las rebanadas ópticas en un microscopio confocal, donde la cuantificación de la extravasación como un porcentaje de todas las células en la región de la cola puede controlar para desigual de carga de las células cancerosas en el embrión.

el yolk sac vía de inyección es diferente de la del seno precardiaco ya que permite un mayor número de células y por lo tanto mejor capacidad para la heterogeneidad dentro de una población de células. Como se muestra en la Figura 4, varias poblaciones de células marcadas diferencialmente se pueden inyectar de forma simultánea en el saco vitelino para comparar su capacidad invasora y el patrón. La capacidad angiogénica de células inyectadas y mayor reclutamiento de los vasos sanguíneos pueden facilitar la entrada de células de cáncer en la región de la cola pero este aspecto aún no ha sido analizada. Técnicamente, la yema de inyecciones saco son más fáciles de realizar que una inyección precardiaco sinusal sin embargo, por otro lado, el saco vitelino es un entorno rico en nutrientes que pueden obstaculizar la salida de las células cancerosas. También es posible que la inyección cerca de los vasos sanguíneos en la yema puede introducir antes de tiempo las células cancerosas en la circulación y, por lo tanto, hay que examinar cuidadosamente para inyecciones fallidas y omitir estos embriones a partir de la puntuación. Por último, es importante tO en cuenta que el microambiente yema es algo artificial, ya que carece de un sitio primario análoga en ratones o humanos.

Los diversos sistemas de modelos que tratan de predecir la metástasis del cáncer no son sin sus ventajas y desventajas, y el ensayo de extravasación de pez cebra no es una excepción. Como una ventaja importante, este ensayo permite la evaluación de la capacidad invasiva vascular dentro de un sistema circulatorio funcional y preguntas experimentales se puede responder después de unos pocos días. Dado el tiempo de respuesta rápido, tal sistema podría ser utilizado para sondear el comportamiento agresivo de líneas celulares establecidas, no sólo, pero las muestras de pacientes humanos con cáncer también recién aislados. La principal desventaja es que este modelo omite los eventos más próximas y más de la cascada metastásica al centrarse únicamente en la invasión vascular. Por otra parte, las células cancerosas humanas inyectadas en estos embriones de pez cebra es evidente que no operan en un entorno singénico y un poco de interacción con tque, en consecuencia estroma puede ser perdido. A pesar de estas limitaciones, el modelo de embrión de pez cebra tiene un lugar merecido en la investigación básica y traslacional del cáncer, ya que hemos empleado que muestran un papel para el hipopótamo ruta 26 y la proteína queratina-32 asociado 5-5 señalización en la capacidad invasiva vascular de cáncer Células. Por lo tanto, este modelo tiene el potencial para ayudar a la investigación de un sello metastásico clave del cáncer en estadio avanzado.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100 mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

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Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)
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Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).More

Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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