Summary
Bu yöntem etkili bir kanser hücrelerinin damar invaziv yeteneğini test etmek zebrafish embriyolar kullanır. Floresan kanser hücrelerinin gelişmekte olan embriyo precardiac sinüs ve yumurta sarısı kesesinin içine enjekte edilir. Kanser hücresi vasküler invazyon ve damar dışına 24-96 saat sonra kuyruk bölgenin floresan mikroskobu ile değerlendirilir.
Introduction
Metastatik hastalık kanser mortalite ve kanser hücresi yayılmasını sağlayabilmek 1 keşfedilmeyi beklemektedir birçok mekanizmalar önemli bir nedenidir. Başarıyla metastaz için bir kanser hücresi için, öncelikle dolaşım sistemi içine (intravasate) girin, primer tümörü çevreleyen stroma ile işgal gerekir, dolaşımdan transit çıkış (extravasate) hayatta ve son olarak uygulanabilir bir koloni kurmak uzak organ sitesinde 2'de. Intravasation ve damar dışına böylece metastatik kaskad önemli adımlardır, ancak her kanser hücresi bozarak ve endotel kavşaklar 3 ile göç de doğal olarak usta değildir. Aslında, kanser hücresi vasküler invazyonu çevreleyen ve işlem ayrıca iç ve dış faktörlerin 4 çeşitli etkilenebilir özel baskılar bir dizi bulunmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, ileri evre kanser saldırgan davranış prob teknikleri genellikle v odaklanmakmetastatik yayılması tahmin etmek için bir araç olarak, invaziv yeteneği ascular.
Çeşitli model sistemler in vitro kanser hücresi vasküler invazyon çalışma kolaylaştırmak için vardır. En vitro deneylerde kullanılan kanser hücreleri 6 tarafından sağlam endotel tek tabaka gerçek zamanlı bozulmasını izlemek için bir endotel bariyer 5 ya da elektrik Hücre Yüzey empedansını algılayarak, (ECIS) teknolojisi ile kanser hücre göçü değerlendirmek ya Transwell sistemleri içerir. Bu tahliller, tipik aksi bir endotel duvara kanser hücresi eki etkileyecektir akışkanlar dinamiği ve stromal faktörleri yoksundur. Bu sorun biraz stromal hücreler destekleyen endotelinin 3D kültür kaynaklanan perfusable vasküler şebekeler tarafından atlatılabilir edilir ve bu 3 boyutlu mikroakışkan sistemleri artık vitro mevcut seçeneklerin 7,8 ön planda temsil etmektedir. Yine de, bu yaklaşımlar fonksiyonel dolaşım sisteminin sağlam mikro ihmalve bu nedenle sadece in vivo modeller için parça atama.
En yaygın olarak vasküler invazyon in vivo modelde kullanılan nispeten kısa zaman ölçeği üzerinde meydana gelir ve metastatik yeteneği 9 genellikle göstergesidir için deneysel metastaz tahlilleri sık gerçekleştirilen edildiği fare,. Bu deneyler dolaşıma kanser hücrelerinin direkt enjeksiyon içerir ve bu nedenle metastaz, organların yani ekstravazasyon ve kanser hücresi kolonizasyon son aşamalarını modeli. Deneysel metastaz tahlilleri kanser hücre enjeksiyon yerinde göre farklılık ve organlar sonuçta analiz edildi. İlk deney türü, kanser hücreleri akciğer fareler ve kanser hücresi tohumlama kuyruk damarının içine enjekte edilir 10,11 izlenir. İkinci tahlil kemik mikroçevresindeki 12-14 doğru metastatik tohumlama yönlendirmek için intrakardiyak enjeksiyon gerçekleştiren, fakat aynı zamanda beyin 15 içerir. Üçüncü bir deneyde, kanser Cıarşın karotid artere dördüncü dağıtım yolu, beyin 17,18 kanser hücreleri taşıyan ise karaciğer 16 kolonizasyonunu izin vermek amacıyla dalak içine enjekte edilir. Ne olursa olsun kanser hücresi teslim yönteminin organ kolonizasyonu kabul deneysel uç ve genellikle lüminesans, histoloji, ya da PCR tabanlı teknikleri ile tespit edilir. Bir fare konak içinde deneysel metastaz deneyleri yürüten fizyolojik avantajlarına rağmen, bu deneyler hala tamamlamak ve analiz etmek için aylar haftalar gerektirir.
Zebra balığı (Danio rerio) modeli son zamanlarda kanser ilerlemesini 19,20 incelemek için yeni bir sistem olarak ortaya çıktı ve fareler 21-24 ile karşılaştırıldığında çok daha kısa bir süreye üzerinde fonksiyonel dolaşım sistemi içinde kanser hücresi damar invazyonu değerlendirilmesi için olanak sağlamaktadır. yöntem, endotelin yeşil resif mercan fluo ile etiketlenmiş olan şeffaf zebrafish gerginlik kullanırkdrl promotör, vasküler endotelyal büyüme faktörü 25 zebrabalıkları reseptör tarafından yönlendirilen rescent protein muhabiri. tahlilde, kanser hücreleri, bir kırmızı floresan işaretleyici ile etiketlenir ve 2 günlük embriyoların precardiac sinüs içine enjekte edilir. Anywhere 48 saat 96 arasındaki enjeksiyondan sonra, damarsal dışında ve embriyoların kaudal bölgeye işgal etmiş kanser hücreleri bir floresan mikroskop verimli attı edilebilir. Burada da vasküler invaziv yeteneği açık farkları göstermek için yaygın olarak kullanılan insan göğüs kanseri hücre çizgileri panelinde tekniği uygulanır. Ayrıca, kanser hücre popülasyonları farklı olarak florasan boyalarla işaretlenmiş floresan damar yoksun zebra balığı embriyoların içine enjekte edilebilir embriyo yumurta sarısının için enjeksiyon yerinin değiştirilmesi, heterojen bir hücre etkileşimleri çalışma için izin verdiğini göstermektedir. Bu ikinci deneyde, sarısı işgal ve sahip kanser hücreleri vasculatur içine intravasatede enjeksiyonundan sonra 48 saat için kaudal bölgede 24 puanlanır. Nedeniyle bu modelin etkililiği ve kolaylık, zebra balığı giderek hızla fizyolojik bir ortamda altında kanser hücrelerinin damar invaziv kabiliyetini test etmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: onaylı IACUC protokole göre Zebra balığı embriyolar üretildi. Bu deneyler, Georgetown Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından tavsiyelerine uygun olarak yürütülmüştür.
1. Enjeksiyon için Embriyolar Organize ve Stok Çözümleri Oluşturmak
- kanser hücresi damar invazyonu değerlendirmek için gerekli Zebra balığı larvaları oluşturun.
- Mitfa b692;; ednrb1 b140 balık: (grcfp kdrl) zn1 Tg ile çapraz çiftleşme çifti bilge ya da grup kurmak.
NOT: Tg oluşturulan (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafish, Tg (kdrl: grcfp) geçerek pigment hücreleri yoksun bir çizgi, mitfa ile endotel hücrelerinde mercan floresan protein yeşil resif ifade zn1 25, b692; Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'nde geliştirilen ednrb1 b140. - Collect yumurta, temiz ve döllenmemiş veya deforme embriyolar ertesi gün 22 kaldırın.
- Zebra balığı embriyolar 2-günler olduğunda oluştuğu, kanser hücreleri enjeksiyon için hazır olana kadar 28.5 ° C embriyolar inkübe sonrası fertilizasyon (2 dpf).
- Mitfa b692;; ednrb1 b140 balık: (grcfp kdrl) zn1 Tg ile çapraz çiftleşme çifti bilge ya da grup kurmak.
- enjeksiyon plakaları olun.
- Her plaka için dH 2 O% 1.5 agaroz 25 ml eritin.
- 100 mm x 15 mm Petri kabı içine agaroz 12 mi dökün ve sertleştiriniz.
- Yeniden eritebilir plaka kalan agaroz dökün sonra.
- o agaroz bir 30 derecelik açıyla ve plakanın ortasına konumlandırılmış böylece hemen kesme cam kalıp (genişlik x 7.5 cm uzunluğunda 3 mm x 7.2 cm) yerleştirin.
NOT: Bu dik bir 60 ° duvarı ve 30 ° eğimli rampa yaratacaktır. - yerinde cam kalıp Bant ve agaroz sertleşmesine izin verin.
- Yavaşça cam kalıp çıkarmak ve agaroz gözyaşı için dikkatli olmak.
Not: Kalıplar, 4 ° C'de dH 2 O saklanabilir.
- Balık, su (0,3 g / L, deniz tuzu) enjeksiyon plaka dengelenmesi.
- İki kez distile su ile durulayın plaka.
- 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde plaka ve yer balık 10 ml su ilave edilerek plaka dengelenmesi.
- plaka balığı, su ile bir kez dengelenmesi.
- Balık suyu 22 içeren yemeklerin içine aktararak enjeksiyon gruba 2 gün sonrası fertilizasyon (dpf) embriyolar bölün.
- enjeksiyondan sonra kullanmak için her grup için kurtarma yemekleri hazırlayın. Kurtarma çanağı 10 mi balık suyu artı penisilin (25 ug / ml) ve streptomisin (50 ug / ml ug) içerdiğinden emin olun.
- Balık su artı penisilin ve streptomisin, 50 ml tamponlanmış tricaine stok (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) içinde 4 ml ekleyerek 2x tricaine çözeltisi hazırlayın.
- IMAGin canlı embriyolar hareketsiz bir montaj anestezi ortam oluşturmak için 2x tricaine çözeltisi, 10 ml 15 mg düşük erime noktalı agaroz eritilirörn.
Not: Montaj ortamı% 1.5 agaroz oluşur. - mikroenjeksiyon iğneler çekin.
- dikey pipet çektirmesi cam kılcal boru yerleştirin. 20 mAmp akımı ve 2-coil ısıtma elemanı kullanarak uzun konik pipetler çekin.
Lipofilik Floresan Boya ile 2. Etiketleme Kanseri Hücreleri
- tavsiye edilen kültür koşullarında kanser hücreleri korumak.
NOT: Bu hatlar, DMEM +% 10 FBS muhafaza edilmiştir: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve SK-BR-3. Bu hatlar, RPMI +% 10 FBS içinde muhafaza edilmiştir 1806 HCC ve T-47D. Tüm hücre çizgileri, inkübasyon sırasında 37 o C ve% 5 CO2 de muhafaza edilmiştir. - Kanser hücrelerinin bir yapışkan kültürü süzülerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturur.
- PBS ile ilk hücreleri yıkanır ve daha sonra% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi edilir.
NOT: Tripsin maruz kalma süresi hücre hattına bağlıdır. - se ile tripsin çözüm nötralizerom içeren hücreler ayırmak sonra hücre kültürü ortamı.
- PBS ile ilk hücreleri yıkanır ve daha sonra% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi edilir.
- 200 x g'de 5 dakika boyunca tripsin nötralize hücre süspansiyonu santrifüj, daha sonra hücre sayımı için taze kültür ortamı hücre pelletini.
- bir otomatik sayaç hücre süspansiyonu sayımı ve hücre kültür ortamı 200 ul 1.000.000 hücreleri hazırlamak.
- Zebra balığı embriyolarının içine enjeksiyon öncesinde tripan mavi boya dışlama hücre canlılığını doğrulayın.
NOT: Sadece canlı hücre popülasyonları, gerçek vasküler invazyonu yansıtmaz ölü hücrelerin enjeksiyonu gibi, zebra balığı embriyoların içine enjekte edilmelidir.
- Zebra balığı embriyolarının içine enjeksiyon öncesinde tripan mavi boya dışlama hücre canlılığını doğrulayın.
- 100 seyreltme karıştırın ve daha sonra 20 dakika boyunca 37 ° C'de karışım inkübe bir 1: kanser hücre süspansiyonu kırmızı lipofilik boya 2 ul ekle.
Not: boya ve markalama zaman konsantre her bir hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir. - İnkübasyondan sonra, tüp taze ortam 1 ml ilave edilir ve daha sonra 5 dk süreyle santrifüj200 x g.
- kanser hücreleri kalıntı floresan boya silsin.
- Aspire hücre peletinin yüzen kısmı, 200 x g'de 5 dakika boyunca, taze kültür ortamı, 1 ml pelet ve santrifüj yeniden süspanse edin.
- 200 x g'de 5 dakika boyunca daha sonra santrifüj, süpernatan aspire taze ortam 1 ml hücre pelletini ve: yıkama aşamasından ikinci kez tekrarlayın.
- 200 x g'de 5 dakika boyunca daha sonra santrifüj, süpernatan aspire taze ortam 1 ml hücre pelletini ve: yıkama aşaması, üçüncü bir zaman tekrar edin.
- Süpernatant aspire ve taze ortam 500 ul 1.000.000 etiketli kanser hücrelerini içeren hücre pelletini.
Not: 0.5 mM EDTA hücre topaklanma önlemek için ortama ilave edilebilir.
Zebra balığı Embriyolar Öncesi kalp Sinüs içine 3. Enjekte Kanseri Hücreleri
- Bir basınçlı hava kaynağına mikroenjeksiyon dağıtım sistemini takın ve inci açmake mikroenjeksiyon dağıtım sistemi güç kaynağı.
- ayak pedalına basılarak Test basıncı. Havanın kısa bir darbe iğne tutucu yayarlar gerekir.
- 2x tricaine çözeltisi ile iki kez enjeksiyon plakaları dengelenmesi.
- Her dengeleme adım için, 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde, enjeksiyon plakası ve yere 2x tricaine çözeltisi 20 ml ekleyin.
- 2x tricaine çözeltisi içeren küçük bir çanak embriyoların bir grup aktarmak için plastik pipet kullanın.
- Bir jel yükleme pipet ucu kullanılarak kanser hücreleri mikroenjeksiyon enjeksiyon iğnesi Dolgu.
- Hücreler ucuna yakın yerleşmek böylece aşağı bakacak sivri ucu bir elektrot depolama kavanoz iğne yerleştirin.
- Transferi 20 - plastik bir pipet 2x tricaine bol embriyolar toplayarak bir enjeksiyon plakasına 30 anestezi embriyolar.
- Embriyolar pipet ucu yerleşmek için izin verin.
- centilmenly oluk uzunluğu boyunca embriyolar yayılan, enjeksiyon plaka çukur içine embriyolar sınırdışı.
- çukur dik duvara bakan yukarı bakacak başkanları ve karınlarına embriyolar hizalayın.
NOT: Tricaine çözüm embriyolar sadece yalak ikamet ile, yalak uzunluğu ve düz agaroz yüzeyi hem kapsamalıdır. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır.
- mikroenjeksiyon dağıtım sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarının precardiac sinüse - (5 nl 2) 100 kanser hücrelerini - 50 enjekte edilir.
- Bir Mikromanipülatör iğne tutucu iğne takın.
- sola 60 derece duvar Stereoskop altında enjeksiyon plakasını yerleştirin ve 25x büyütme üst embriyo odaklanmak.
- uzatılmış zaman, iğne embriyo delmek olacak, böylece mikromanipülatör yerleştirin.
- neredeyse embriyo dokunmadan kadar gözle iğne uzatın.
- Mikroskop altında bakıldığında, t böylece iğne hizalamakşapka daha da uzatma üzerine embriyo delmek olacaktır.
- Pierce, sadece en ucu yerleştirerek yolk kesesi yoluyla embriyo, ama değil, önceden kalp sinüs.
- Ayak pedalına hücreleri enjekte edilir. enjeksiyon kuvvet kalp sinüs içine hücreleri kovar. iğne geri çekin.
- Sağ elini kullanarak, genişletmek ve enjeksiyon iğnesi geri çekin. sol el ile, bir sonraki embriyo konumlandırmak için ince ayarlamalar yapmak.
- başka bir plaka enjekte kurarken elektrot depolama kavanoz iğne dönün.
- tüm plaka enjekte edildikten sonra kurtarma çanak embriyolar aktarın.
- çukur dışında kalan embriyolar yıkama ve plastik pipet ile onları toplama, altta embriyolar havuz enjeksiyon plaka yatırın.
- Embriyolar pipet dibinde yerleşmek için izin verin.
- tricaine bir minimal hacimde geri çanak embriyolar aktarın.
- doğmuş iyileşmesini1 saat süre ile 28 ° C 'de te geri çanak.
- ölü embriyo ve diğer enkaz ayrı canlı zebrafish embriyolar.
- 96 saat - tipik olarak 24, puanlama için hazır olana kadar 33 ° C'de çanak inkübe edin.
NOT: Bu sıcaklık 37 ° C, kanser hücreleri için ideal sıcaklık ve 28.5 ° C, zebrabalıkları için ideal sıcaklık arasında bir uzlaşma olarak belirlenir.
4. Puanlama Ekstravazasyon
- Embriyoların toplu tricaine solüsyonu ile bir tabak yerleştirerek atılır için uyutmak.
- tricaine bir damla bir depresyon mikroskopi slayt üzerinde bir anestezi larvaları yerleştirin.
- kaudal bölgenin uygun görüntüleme için yanal olarak yönlendirilmesi larva.
- başarıyla açıkça sağlam hücreleri ayırt etmek kuyruk bölgesinden geçen yukarı ve aşağı odaklanarak damarsal dışında işgal kanser hücrelerinin sayısını sayın.
NOT: t katılan en az iki kişi olması en iyisidirbalık puanlama bireysel deneysel durumuna kör onun süreç, değerlendirilen.- 10x objektif lens ile bir bileşik floresan mikroskop larvaları puanı. herhangi bir zor aramalar için 20x objektif kullanın.
Slaytlar ve sonraki Floresan Görüntüleme üzerine 5. Montaj Embriyolar
- % 1.5 agaroz / tricaine çözeltisi eritin ve 37 ° C'ye getir.
- embriyo anestezisi tricaine çözelti içinde yerleştirilerek yansıması.
- görüntüleme yüzeyine tricaine çözümün bir damla embriyo transferi. İsteğe bağlı olarak cam alt çanak veya mikroskop lamı kullanın.
- görüntü yüzeyinde embriyo koruyarak, aşırı tricaine çözüm kaldırmak için bir cam pipet kullanın.
- embriyo üzerinde erimiş agaroz çözüm bir damla Yerleşimi.
- Çabuk, agaroz polimerize önce, bir kirpik fırçası gibi hassas bir aracı kullanmak ekstra bakım veren görüntüleme için yanal embriyo yönlendirmek içinembriyo sağlamak için görüntü oluşturma yüzeyi üzerinde düzleştirilir.
- tricaine çözümü altında şimdi polimerize agaroz damla Batmak.
- mikroskopik görüntüleme için canlı zebrafish embriyo Konu.
6. Modifikasyon: Zebra balığı Embriyolar sarısı kesesinin içine enjekte Kanser Hücreleri
- Daha önce bu protokol bölüm (3) 'de tarif edildiği gibi mikroenjeksiyon dağıtma sistemi ve enjeksiyon tabak hazırlayın.
- Daha önce bu protokol bölüm (2) 'de tarif edildiği gibi floresan boyalar zıt olan iki hücre popülasyonu etiketleyin.
- sarısı kesesinin içine 2 x 10 7 hücre / ml 10 nl - 5 enjekte edilir. Her hücre popülasyonundaki - (200 kanser hücreleri 100) özdeş hücre sayıları enjekte enjeksiyon hacmi sabit tutmak
NOT: Bir bu deney için floresan damarsal eksik şeffaf zebrafish embriyolar kullanabilir. damar içine partiküllerin pasif giriş veya flüoresan boncuklar (<10 um) enjekte edilmesiyle kontrol edilebilir değiştirebilirAlternatif olarak, intravsate olmayan bir hücre çizgisi. - Daha önce (3) Bu protokolün ardından başarılı enjeksiyonları için ekran bölümünde açıklandığı gibi enjekte embriyolar kurtarın.
- Ekrana ve başarılı yeni bir çanak enjekte edildi embriyo transfer etmek Stereoskop kullanın.
NOT: Tüm embriyolar sarısında bulunan hücrelerin sürekli boyutta kütleye sahip olmalıdır. Herhangi hücreler sarısı dışında bulunuyorsa Embriyolar kitle boyutu farklıysa atılır ya da vardır. - Kanser hücreleri açıkça yumurta sarısının görülür ise yeni bir çanak embriyo transfer.
- Ekrana ve başarılı yeni bir çanak enjekte edildi embriyo transfer etmek Stereoskop kullanın.
- 48 saat - tipik olarak 24, puanlama için hazır olana kadar 33 ° C'de çanak inkübe edin.
NOT: Bu sıcaklık 37 ° C, kanser hücreleri için ideal sıcaklık ve 28.5 ° C, zebrabalıkları için ideal sıcaklık arasında bir uzlaşma olarak belirlenir. - intravasation puan için (4) Bu protokolün, ancak bunun yerine c sayısını bölümünde açıklanan yönergeleri izleyinbaşarıyla kaudal bölgede damar içine işgal ancer hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada bir zebrabalıkları embriyo modelinde yaygın olarak kullanılan meme kanseri hücre hatları (Şekil 1), vasküler invaziv yeteneği test edildi. Titiz kriterler, kanser hücreleri açıkça ekstravaze olsaydı pozitif olaylar sadece sayıldı bu farklı hücre hatları için puanlama ekstravazasyonunda hücresel enkaz puanlama ortaya çıkabilecek herhangi bir yanlış-pozitif sınırlamak için esas yapılması bu varlık istihdam edilmiştir.
Işgali 96 saat precardiac sinüs (Tablo 1) içine enjeksiyonundan sonra değerlendirildi bizim analiz hatları arasında sade farklılıklar ortaya çıkardı. Test edilen 7 hücre hatlarının, MDA-MB-231 hücre hattı ile enjekte zebra balığı embriyolar embriyo başına ekstravaze kanser hücrelerinin en fazla sayıda hattın kabul metastatik doğası (Şekil 2) ile uyumlu bir bulgu gösterdi. Biz de bulduğu BT-474 hücreleri kolayca iörneğin, MCF-7 gibi diğer hücre çizgileri, SK-BR-3, ve T-47D hücreleri, (Şekil 3), minimal invaziv ise, embriyo kaudal bölgeye nvaded. Meraklı keşif MDA-MB-468 hücreleri enjekte zebra balığı embriyolarının kabaca yarısı miyokard bölgesinde ödem vardı ve bu gol olmasıydı. Bu ekstravazasyonu için nicel olarak yeterli uygulanabilir örnekleri bulmadan önce, bir sonucu olarak, MDA-MB-468 hücreleri ile enjekte edilen embriyoların sayısı atıldı. Bu göstermelik farklılıklara rağmen, damar dışına Test edilen her kanser hücre hattı oluştu dikkat çekicidir.
Precardiac sinüs tahlilinde bir değişiklik olarak, kendi vasküler invazif yetenekleri 26 farklıdır, MDA-MB-231 hücrelerinin iki popülasyonu aynı zamanda gelişmekte olan embriyo yumurta sarısı kesesinin içine enjekte edildi ve böylece, bir rekabet deneyinin gerçekleştirilir. Birleşik kültür koşulları önceden altında yayılan MDA-MB-231 hücreleriEnjeksiyondan dolaşıma intravasation bir azalma göstermiş ve bu nedenle de (Şekil 4) vuruşu sırasında embriyoların kaudal bölgesinde azaltılmış izlendi.
| Hücre çizgisi | Ort. Embriyo başına # Damar dışına Hücreler | menzil |
| MDA-MB-231 (Birlikte akan) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
Tablo 1: Genel olarak göğüs kanseri hücre çizgileri 2 günlük zebra balığı embriyolarının precardiac sinüs içine enjekte edilmekte ve 4 gün sonra skorlandı kullanılan Zebra balığı Meme Kanseri Hücre Hatlarında vasküler invazif yetenekleri karşılaştırılması. damar ve kaudal bölgeye işgalci Kanser hücreleri hücre hattı başına 10 embriyolar ölçülmüştür. ekstravaze kanser hücrelerinin ortalama sayısı aralığı ile birlikte gösterilir.
Şekil 1. balığı Kanseri Hücre Ekstravazasyonu Deneyi görsel Özeti. Bu tahlilde, kanser hücreleri, bir floresan boya ile etiketlenir olan ve damar sistemi, bir kontrast floresan haberci ile işaretlenir 2 günlük zebra balığı embriyolarının precardiac sinüs içine enjekte edilir. 2 Aşağıdaki - 4 gün daha, embriyonun kaudal bölgeye işgal etmiş kanser hücreleriatılır ve daha sonra görüntüleme için anestetik bir agaroz ortam içinde monte edilebilir. Protokol bölümüne bu şematik tekabül tasvir her adım. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4 gün MDA-MB-231 Hücreleri ile Enjeksiyon sonrası Zebra balığı Embriyo Şekil 2. Görüntü Mozaik. Aydınlık (A) ve floresan (B) mozaikler gösterilmiştir. Floresan görüntüler yeşil renk damarsal gösterir ve kırmızı renk kanser hücrelerini işaret eden bir z-yığınının maksimum projeksiyon olarak tasvir edilmektedir. Ölçek çubuğu, 200 mikron. (C) embriyonun kaudal bölge ekstravaze kanser hücrelerini göstermek için büyütülür. Noktalı floresan etiketleme magnifica sonra görülüryon. Ölçek çubuğu, 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil deneysel sonuçlar 3. Örnek. Burada ekstravazasyonu ancak MCF-7, SK-BR-3, ve T-47D kanser hücreleri enjekte edilmiş bir embriyo BT-474, kanser hücreleri enjekte edilmiş bir embriyo gösterilmiştir. Ok uçları ekstravaze hücreleri belirtmektedir. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. MDA-MB-231 hücre popülasyonlarının intravazasyonunda 2 gün after Yolk Sac Enjeksiyon. (A) yeşil (invaziv) ve kırmızı (daha az invazif) ile Yolk kesesi etiketli MDA-MB-231 hücreleri. (B) kuyruk ulaşmak için damarsal işgal MDA-MB-231 hücreleri ile kaudal bölge bölgesi. (C) kaudal bölgesinde intravasated MDA-MB-231 hücreleri ile zebra balığı embriyo sayısı enjeksiyondan 2 gün 26 sonra. Ölçek barlar, 250 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik, etkili bir şekilde, kanser hücreleri (Şekil 1 e bakınız) vasküler invaziv yeteneğini test etmek zebra balığı modeli kullanmaktadır. (; - 3 Şekil 2 Tablo 1) Burada diğer araştırmacılar daha sonra kendi çalışmalarını inşa edebilirsiniz hangi üzerine bir temel sağlamak amacıyla meme kanseri hücre hatları bir panel tekniği uygulandı. MDA-MB-231 hücreleri kolayca zebra balığı embriyolarının kaudal bölgeye işgal gözlem vasküler invazyonu inhibe olabilir ajanların test edilmesine yönelik bu hücre hattı ideali olur. Örneğin HCC1806 veya MDA-MB-468 hücreleri gibi nispeten daha az invaziv hücre çizgileri, aksi takdirde, vasküler invazyonu kuvvetlendirebilecek faktörleri çalışma kullanılabilecektir. deneyler bu tür ilaçların dahil edilmesini gerektirir ise, daha sonra bir tedavi etkisi dayanıklı olması beklenmektedir bağlı olarak, teslimat iki farklı yolları vardır. Kanser hücreleri, ilacın enjeksiyondan önce olarak önceden işlemden geçirilebilirembriyolar ya da ilaç doğrudan difüzyon kanser hücrelerini etkiler embriyolar muhafazası su ilave edilebilir.
Bizim karşılaştırıldığında, biz 96 saat precardiac sinüse enjeksiyondan sonra Zebra balığı embriyo kuyruk kanser hücre ekstravazasyonu analiz. MDA-MB-231 hücre rekabet deneyi için, dolaşıma intravasation sarısı kese enjeksiyonundan sonra 48 saat sonra değerlendirildi. Analiz için seçilen zamannoktaları aşılamadan sonraki tipik olarak bazı deneyler için, pik ekstravazasyonu enjeksiyonundan sonra, sadece 24 saat oluşabilir, her bir hücre hattı için optimizasyon gerektirir. Onlar dolayısıyla kanser hücrelerinden floresan enkaz makrofajlar veya nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri tarafından yutulmuş olabilir kanser hücreleri 27 ve enjekte edildiğinde Zebra balığı embriyolar fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahip dikkati çekiyor. extravasat puan çalışırken doğuştan gelen bağışıklık sisteminin aktivitesi bu nedenle potansiyel olarak yanlış pozitif floresan etiketleme oluşturabiliriyon; bakım, sadece sağlam, uygun kanalda floresan hücreleri puan verilmelidir. Geçerli kanser araştırma kanser metastazı 28 artırılması bağışıklık sistemini karıştığı olduğundan, Zebra balığı embriyo modeli kanser hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasında meydana gelen karışma incelenmesi için izin vererek bu alana özgü bakış açısı sağlayabilir. Bu fikir, son çalışmalar, bir çift ile örneklendirilir. Bu çalışmaların ilk zebrabalıkları olan VEGFR inhibisyonu, kanser hücrelerinin 29 metastatik davranışı ortaya nötrofillerin kapasitesini artırdığını göstermiştir. İkinci bir çalışmada, insan kanser hücreleri üzerinde reseptör algılama ve zebra balığı ligand 30 yanıt ve invazyon yeteneği ile ilişkili kanser hücrelerinde CXCR4 ifade yeteneğine sahip olarak eksen sinyal CXCR4-CXL12 bağışıklık kemokin zebra balığı olan sağlam olduğunu göstermiştir hayvan modeli içinde. Bundan başka, bu sergisi bu zebrabalıkları makrofajlar gösterilmiştirted insan CXCL12 karşı kemotaktik yanıtı. Floresan etiketli nötrofiller 31, bir zebra balığı embriyo kök, örneğin, daha fazla bu modelde bağışıklık sistemi kanser hücresi etkileşimlerini keşfetmek için de kullanılabilir.
Protokolde birkaç adım özellikle dikkat gerektirir. İlk olarak, kanser hücreleri embriyolara enjeksiyonu sırasında iğne tıkanmasının engellenmesi amacıyla, tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış esastır. Hücresel agrega ayrıca kan akışını engelleyebilir ve böylece analiz skewing, kaudal bölgeye seyahat kanser hücrelerinin yeteneğini etkileyebilir. Bu ortaya çıkarsa hücresel agrega da güvenilir ne de tavsiye ne bu bölgelerde canlı kanser hücrelerinin invaziv yeteneği olduğunu puanlama, kan damarları yırtılmasına neden olabilir ve. Bir diğer potansiyel sorun alanı floresan boya ile kanser hücrelerini etiketleme ile ilgilidir. laboratuarımızda tarafından işletilen deneylerde, biz bulduk lipofilik boyalar olduğunu,Örneğin DII gibi, en iyi etiketleme üretme eğilimindedir, henüz flüoresans seviyesi hücre hatları arasında değişebilir. Bu nedenle, kanser hücreleri floresan etiketleme aşırı etiketleme önlemek için önceden embriyolara enjeksiyonu için optimize edilmelidir. Etiketlenmiş edildikten sonra fazla boya uzaklıkta kanser hücrelerinden yıkanır ve bu protokol markalama bölümünde belirtilen çeşitli santrifüj adımları ile elde edilir kritiktir; Bu adımlar gereksiz görünebilir, ama onlar kesinlikle gereklidir. Çok fazla floresan boya hücreleri için toksik ya da suni floresan arka plan üreten, kan dolaşımına sızıntı olabilir. Bu sorunların çoğu floresan proteinleri eksprese eden kanser hücrelerinin kullanılması ile atlatılabilir ve mümkün olduğunda bu sistemler floresan boya yerine kullanılabilir önerilir. Kanser ekstravazasyon için embriyolar puanlama Son olarak, her koşulda tutarlı kriterleri uygulamak zorunludur. Biz th bulmakpuanlama aşamasında en az iki kişi ile ilgili bilimsel titizlik korumaya yardımcı olur: Bir bireysel slaytlar hazırlamak ve sonuçlarının kayıt görevli, diğer bireysel ekstravazasyon kararını oluşturur ve durumuna kör değerlendirilmektedir tutulurken. puanlama yaparken, bir kuyruk bölgesinde ekstravaze kanser hücrelerini quantitate veya karşılaştırma kolaylığı için ikili kriterleri oluşturabilirsiniz. Bütün hücreler daha düşük büyütme (Şekil 3) ayırt etmek kolay olsa floresan kanser hücrelerini boyama, çok yüksek büyütme (Şekil 2c) görünür olacak noktasal etiketleme üretir, ikinci puanlama için tavsiye edilir. ekstravazasyon daha belirsiz durumları bakılırsa kuyruk bölgedeki tüm hücrelerin yüzdesi olarak ekstravazasyonu miktarlarının embriyo içine kanser hücrelerinin eşitsiz yüklenmesi için kontrol edebilen bir konfokal mikroskop, optik dilim edinimi ile destekli olabilir.
yoBu hücreler daha yüksek bir sayıda izin verir ve bu nedenle daha iyi bir hücre popülasyonu içinde heterojen kapasiteli enjeksiyon yol kesesi lk precardiac sinüs farklıdır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, çok sayıda farklı şekilde etiketlenmiş hücre popülasyonları eş zamanlı olarak, invaziv yetenek ve kalıp karşılaştırma sarısı kesesinin içine enjekte edilebilir. enjekte edilen hücrelerin anjiyogenik yeteneği ve kan damarlarının gelişmiş alma kuyruk bölgeye kanser hücresi girişini kolaylaştırabilir ama bu yönü henüz analiz edilmemiştir. Teknik olarak, sac enjeksiyonu olsa precardiac sinüs enjeksiyon kıyasla daha kolay olan sarısı, diğer yandan yolk kesesi kanseri hücrelerinin çıkış engelleyebilir bir besleyici açısından zengin bir ortam. Sarısında vasküler yapılara enjeksiyonu zamanından önce dolaşıma kanser hücrelerini katabilmektedir ve bu nedenle, bir dikkatle botched enjeksiyonlar için taranması gerekir ve puanlama bu embriyolar ihmal de mümkündür. Son olarak, önemli to farelerde veya insanlarda benzer bir birincil siteyi yoksun olarak sarısı mikroçevresinin, biraz yapay olduğunu unutmayın.
Kanser metastazı tahmin etmeye çeşitli model sistemler kendi avantajları ve dezavantajları olmadan değildir, ve zebra balığı damar dışına tahlil istisna değildir. büyük bir avantaj olarak, bu deney fonksiyonel dolaşım sistemi içinde vasküler invaziv yeteneği değerlendirilmesi için izin verir ve deneysel sorular sadece birkaç gün sonra cevap olabilir. Hızlı, ucuz süre göz önüne alındığında, bu tür bir sistem, sadece yerleşik hücre hatları saldırgan davranış incelemek için kullanılmıştır, ama aynı zamanda, taze insan kanseri hastalarından alınan örnekler izole edildi. büyük dezavantajı bu model vasküler invazyon üzerinde sadece odaklanarak metastatik kaskad ilk ve son olayları atlar olmasıdır. Ayrıca, bu Zebra balığı embriyolarının enjekte insan kanser hücrelerinin belli bir singeneik ortamda ve t bazı etkileşim içinde faaliyet değilO dolayısıyla kaybedilebilir stroma. Biz kanser damar invaziv yeteneği yolu 26 ve keratin ile ilişkili protein 5-5 32 sinyalizasyon Hippo bir rol göstermek istihdam gibi bu sınırlamalara rağmen, Zebra balığı embriyo modeli, hem temel hem de translasyonel kanser araştırmalarında bir hak ettiği yeri vardır hücreler. Bu nedenle, bu model ileri evre kanseri önemli bir metastatik damgasını araştırılmasını yardımcı olma potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
