Summary
Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.
Introduction
Metastatische ziekte is een belangrijke oorzaak van kankersterfte en vele mechanismen waarmee kankercel disseminatie nog worden ontdekt 1. Om een kankercel met succes uitzaaien, moet het eerst binnen te dringen door het stroma dat een primaire tumor omringt, in te voeren (intravasate) in de bloedsomloop, overleven in transit, afslag (extravasaat) uit de circulatie, en tot slot de oprichting van een microflora naar de verre orgaan met 2. Intravasation en extravasatie zijn dus cruciale stappen in de metastatische cascade, maar toch elke kankercel is niet inherent bedreven in het verstoren en het migreren door middel van endotheliale kruispunten 3. In feite zijn er een aantal unieke selectiedruk die kankercel vasculaire invasie omringen en de werkwijze kan verder worden beïnvloed door verschillende endogene en exogene factoren 4. Daarom, technieken die het agressieve gedrag van vergevorderde kanker sonde vaak gericht op vascular invasieve vermogen als middel om metastatische verspreiding te voorspellen.
Verschillende modelsystemen bestaan om de studie van kankercel vasculaire invasie in vitro te vergemakkelijken. De meest gebruikte in vitro assays omvatten hetzij transwell systemen kankercelmigratie beoordelen via een endotheelbarrière 5 of elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) technologie om de real-time verstoring van een intacte endotheliale monolaag van kankercellen 6 volgen. Deze tests meestal niet over de vloeistofdynamica en stromale factoren die anders zouden beïnvloeden kankercel bijlage bij een endotheliale muur. Dit probleem is enigszins omzeild door perfusable vasculaire netwerken die voortvloeien uit de 3D-cultuur van endotheel met ondersteunende stromale cellen, en deze 3D-microfluïdische systemen vertegenwoordigen nu de voorhoede van de huidige in vitro opties 7,8. Toch zijn deze benaderingen laat de robuuste micromilieu van een functionele vaatstelselen derhalve slechts gedeeltelijk substituut voor in vivo modellen.
De meest gebruikte in vivo model van vasculaire invasie van de muis, waarin experimentele metastase testen gewoonlijk uitgevoerd omdat dat dit op relatief korte tijdschaal en die in het algemeen indicatief voor metastatische vermogen 9. Deze testen omvatten directe injectie van kankercellen in het verkeer en daarmee het model van de eindfase van de metastase, namelijk extravasatie en kankercel kolonisatie van organen. De experimentele metastase testen verschillen, afhankelijk van de plaats van injectie kankercel en de organen uiteindelijk geanalyseerd. In het eerste assay soort worden kankercellen geïnjecteerd in de staartader van muizen en kankercellen zaaien in de longen wordt bewaakt 10,11. De tweede test omvat het uitvoeren van intracardiale injectie metastatische zaaien tegen het bot micro 12-14 leiden, maar ook de hersenen 15. In de derde proef, kanker cells worden geïnjecteerd in de milt om kolonisatie mogelijk van de lever 16 terwijl de vierde afgifteroute in de halsslagader verricht kankercellen naar de hersenen 17,18. Ongeacht de kankercel levering methode, orgel kolonisatie is de geaccepteerde experimentele eindpunt en wordt meestal bepaald via luminescentie, histologie, of PCR-gebaseerde technieken. Ondanks het fysiologische voordelen van het uitvoeren van experimentele metastase testen bij een murine gastheer deze experimenten moeten nog weken tot maanden in beslag en analyseren.
De zebravis (Danio rerio) model is onlangs naar voren gekomen als een nieuw systeem kankervooruitgang 19,20 bestuderen, en maakt de beoordeling van kankercel vasculaire invasie in een functionele vaatstelsel gedurende een veel kortere tijdschaal vergelijking met muizen 21-24. De methode maakt gebruik van een transparante zebravis stam die het endotheel is gemarkeerd met een groene koraalrif fluorescent eiwit reporter aangedreven door de kdrl promoter, de zebravis receptor voor vasculaire endotheelgroeifactor 25. In de test worden kankercellen gemerkt met een fluorescerende marker en geïnjecteerd in de precardiac sinus van 2-dagen oude embryo's. Ergens tussen 48-96 uur na de injectie kankercellen die uit het vaatstelsel en in het caudale gebied van embryo zijn binnengedrongen kan efficiënt in een fluorescentiemicroscoop scoorde. Hier de techniek passen we een panel van veelgebruikte humane borstkankercellijnen tot grote verschillen in hun vasculaire invasieve vermogen aantonen. Verder tonen we aan dat het veranderen van de plaats van injectie het embryo dooierzak maakt de studie van heterogene cel interacties, kanker celpopulaties verschillend kunnen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen en geïnjecteerd in zebravisembryo's ontbreekt fluorescerende vasculatuur. In dit laatste assay kankercellen die de dooier zijn binnengedrongen en intravasated in de vasculature gescoord in het caudale gebied 24 tot 48 uur na injectie. Vanwege de effectiviteit en het gemak van dit model, worden zebravis toenemende mate toegepast om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen snel testen onder een fysiologische omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: zebravis embryo's werden geproduceerd volgens een goedgekeurde IACUC protocol. Deze experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Georgetown University Animal Care en gebruik Comite.
1. Organiseren Embryo's voor injectie en Create Stock Solutions
- Genereer vereiste zebravis larven kankercel vasculaire invasie te beoordelen.
- Opzetten paarsgewijze of groep in-cross paring met Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 vis.
LET OP: Wij gegenereerd Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebravis, door het kruisen van Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, die groene koraalrif fluorescerend eiwit tot expressie in endotheelcellen, met een lijn die pigmentcellen ontbreekt, mitfa b692; ednrb1 b140, ontwikkeld aan de zebravis International Resource Center. - Collect eieren, schoon en verwijder onbevruchte of misvormde embryo's de volgende dag 22.
- Incubeer embryo's bij 28,5 ° C tot klaar voor injectie met kankercellen, te komen wanneer de zebravis embryo's zijn 2-dagen na de bevruchting (2 DPF).
- Opzetten paarsgewijze of groep in-cross paring met Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 vis.
- Maak injectie platen.
- Smelt 25 ml van 1,5% agarose in dH 2 O voor elke plaat.
- Giet 12 ml van de agar in een 100 mm x 15 mm petrischaal en laat het uitharden.
- Re-smelten en giet de resterende agarose in de plaat.
- Zich onmiddellijk een kristal matrijs (3 mm x 7,2 cm breed x 7,5 cm), zodat het op een 30 graden hoek met de agarose en in het midden van de plaat.
LET OP: Dit zal een steile 60 ° muur en een 30 ° hellende oprit te creëren. - Tape de glazen mal op zijn plaats en laat de agarose uitharden.
- Verwijder voorzichtig de glazen mal en wees voorzichtig de agarose niet scheurt.
OPMERKING: Matrijzen kunnen worden opgeslagen in dH 2 O bij 4 ° C.
- Evenwicht injectie plaat met vis water (0,3 g / l zeezout).
- Spoel de plaat tweemaal met gedestilleerd water.
- Evenwicht plaat door toevoeging van 10 ml water vissen op de plaat en plaats op shaker gedurende 10 min.
- Evenwicht plaat een tweede keer met vis water.
- Split 2 dagen na de bevruchting (DPF) embryo's in injectie groepen door ze in gerechten met vis water 22.
- Bereid herstel gerechten voor elke groep om gebruik te maken na de injectie. Zorg ervoor dat het herstel gerecht bevat 10 ml water vissen, plus penicilline (25 ug / ml) en streptomycine (50 ug / ml).
- Bereid 2x tricaïne door toevoeging van 4 ml gebufferde tricaïne voorraad (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) met 50 ml water vis plus penicilline en streptomycine.
- Los op 15 mg laag smeltpunt agarose in 10 ml 2x tricaïne oplossing voor een montage verdoving medium dat levende embryo's Imagin zal immobiliseren generereng.
LET OP: Montage medium bestaat uit 1,5% agarose. - Trek micro-injectie naalden.
- Plaats glazen capillaire buis in een verticale pipet trekker. Trek lang taps pipetten met behulp van 20 mAmp huidige en een 2-coil verwarmingselement.
2. Cellen Labeling Kanker met lipofiele fluorescerende kleurstof
- Handhaving van kankercellen in hun aanbevolen kweekomstandigheden.
Opmerking: Deze lijnen werden in DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 en SK-BR-3. Deze lijnen werden in RPMI + 10% FBS gehouden: HCC 1806 en T-47D. Alle cellijnen werden gedurende de incubatie bij 37 ° C en 5% CO2 gehandhaafd. - Genereer een enkele-celsuspensie door dissociatie een hechtende kweek van kankercellen.
- Was de cellen eerst met PBS en daarna behandelen met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing.
OPMERKING: Trypsine belichtingstijd is afhankelijk van de cellijn. - Neutraliseren van de trypsine oplossing serum-bevattende celkweek media na de cellen los te maken.
- Was de cellen eerst met PBS en daarna behandelen met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing.
- Centrifugeer de trypsine-geneutraliseerde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 xg, dan resuspendeer de celpellet in verse kweekmedia voor celtelling.
- Tel de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde teller en gelijktijdig 1 miljoen cellen in 200 ul van celkweekmedia.
- Controleer levensvatbaarheid van de cellen met trypan blauwe kleurstof uitsluiting vóór injectie in zebravis embryo's.
OPMERKING: Alleen levensvatbare cel populaties moet worden geïnjecteerd in de zebravis embryo's, zoals de injectie van dode cellen zal niet overeen met echte vasculaire invasie.
- Controleer levensvatbaarheid van de cellen met trypan blauwe kleurstof uitsluiting vóór injectie in zebravis embryo's.
- Voeg 2 pl rode lipofiele kleurstof kanker celsuspensie voor een 1: 100 verdunning, meng en incubeer daarna het mengsel bij 37 ° C gedurende 20 min.
OPMERKING: Concentratie van de kleurstof en etikettering tijd moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn. - Na de incubatie, voeg 1 ml vers medium aan de buis en centrifugeer 5 min bij200 x g.
- Wegspoelen resterende fluorescerende kleurstof uit de kankercellen.
- Zuig het supernatant van de celpellet, resuspendeer de pellet in 1 ml vers kweekmedium, en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Herhaal de wasstap nogmaals: zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml vers medium en centrifugeer weer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Herhaal de wasstap derde: zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml vers medium en centrifugeer weer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet bevattende 1.000.000 gemerkte kankercellen in 500 pl vers medium.
OPMERKING: kan 0,5 mM EDTA aan de media worden toegevoegd aan cel klonteren te voorkomen.
3. Cellen Injecteren Cancer in de Pre-cardiale Sinus van de zebravis embryo's
- Bevestig micro-injectie doseersysteem een perslucht bron en zet the micro-injectie doseersysteem stroombron.
- Test druk door het indrukken van het voetpedaal. Een korte puls van lucht moeten uitstoten van de naaldhouder.
- Equilibreren de injectie platen tweemaal met 2x tricaïne oplossing.
- Voor elke equilibratie stap, voeg 20 ml 2x tricaïne oplossing van de injectieplaat en plaats op schudder gedurende 10 min.
- Gebruik plastic pipet een groep embryo transfer naar een klein schaaltje met het 2x tricaïne oplossing.
- Backfill de micro-injectie injectienaald met kankercellen met behulp van een gel-loading pipet tip.
- Plaats de naald in een elektrode opslag pot met de punt naar beneden, zodat de cellen te vestigen in de buurt van de top.
- Transfer 20-30 narcose embryo's om een injectie plaat door het verzamelen van de embryo's met veel 2x tricaïne in een plastic pipet.
- Laat embryo's om zich te vestigen in de punt van de pipet.
- Gently verdrijven embryo in de trog van de injectieplaat, verspreidt het embryo over de lengte van de goot.
- Lijn embryo's met kop naar boven en buiken met uitzicht op de steile wand van de trog.
LET OP: tricaïne oplossing moet betrekking hebben op zowel de trog lengte en het vlakke agarose oppervlak, embryo's alleen die woonachtig zijn in de trog. Embryo's zijn nu klaar voor injectie.
- Injecteer 50-100 kankercellen (2-5 nl) in de precardiac sinus van de zebravis embryo's met de micro-injectie doseersysteem.
- Bevestig de naald om de naald houder van een micromanipulator.
- Plaats de injectieplaat onder de stereoscoop met 60 graden muur links en focus op de top embryo bij 25x vergroting.
- Plaats de micromanipulator, zodat wanneer verlengd, zal de naald de embryo doorboren.
- Verleng de naald op het oog, totdat het bijna het embryo raakt.
- Op zoek onder de microscoop, uitlijnen van de naald zo thoed zal het embryo na verdere uitbreiding doorboren.
- Doorboren het embryo door de dooierzak de punt net aan, maar niet in de pre-cardiale sinus.
- Injecteren cellen door het indrukken van het voetpedaal. De kracht van de injectie verdrijft de cellen in het hart sinus. Trek de naald.
- Met behulp van de rechter, uit te breiden en schuif de injectienaald. Met de linkerhand, maken kleine wijzigingen aanbrengen in de volgende embryo te positioneren.
- Zet de naald op de elektrode opslag jar bij het opzetten van een andere plaat te injecteren.
- Breng de embryo's om het herstel gerecht zodra de gehele plaat wordt geïnjecteerd.
- Kantel de injectieplaat het embryo zwembad onderaan, wast resterende embryo's uit het dal, en het inzamelen van de plastic pipet.
- Laat het embryo te vestigen in de bodem van de pipet.
- Breng de embryo's om het herstel gerecht in een minimaal volume van tricaïne.
- Incubate herwinnen schotel bij 28 ° C gedurende 1 uur.
- Afzonderlijke levensvatbare zebravis embryo's van dode embryo's en ander puin.
- Incubeer gerecht bij 33 ° C tot klaar om te scoren, meestal 24-96 uur.
Opmerking: Deze waarde wordt bepaald als een compromis tussen 37 ° C, de ideale temperatuur voor kankercellen en 28,5 ° C, de ideale temperatuur voor zebravis.
4. Scoren Extravasatie
- Verdoven de partij embryo's worden gescoord door ze in een schotel met tricaïne oplossing.
- Plaats een verdoofd larven op een depressie microscopie dia in een druppel tricaïne.
- Orient larven zijdelings voor een optimale weergave van de staart regio.
- Tel het aantal kankercellen die met succes uit het vaatstelsel zijn binnengedrongen door te focussen op en neer door de staartgebied duidelijk onderscheiden intacte cellen.
LET OP: Het beste is om ten minste twee personen die betrokken zijn bij t hebbenZijn werkwijze, waarbij de afzonderlijke punten de vis blind voor de experimentele conditie wordt beoordeeld.- Score larven op samengestelde fluorescentiemicroscoop met de 10x objectief. Gebruik de 20x doelstelling voor een moeilijke gesprekken.
5. Montage van embryo's op Slides en Latere Fluorescentie Imaging
- Smelt 1,5% agarose / tricaïne oplossing en breng aan 37 ° C.
- Verdoven het embryo te beelden door het in tricaïne oplossing.
- Breng het embryo in een druppel tricaïne oplossing van het beeld-vormoppervlak. Eventueel kan gebruik maken van een glazen bodem schaal of microscoopglaasje.
- Gebruik een glazen pipet om het overtollige tricaïne oplossing te verwijderen, met behoud van het embryo op de beeldvorming oppervlak.
- Overlay één druppel gesmolten agarose oplossing over het embryo.
- Snel, voordat de agarose polymeriseert, gebruik dan een delicate instrument, zoals een wimper borstel, het embryo zijdelings te oriënteren voor de beeldvorming, het geven van extra zorghet embryo waarborgen wordt afgeplat langs het beeld-vormoppervlak.
- Dompel de inmiddels gepolymeriseerd agarose daling onder tricaïne oplossing.
- Betreft de live zebravis embryo tot microscopische beeldvorming.
6. Wijziging: Het inspuiten Kankercellen Into de dooierzak van de zebravis embryo's
- Bereid de micro-injectie doseersysteem en injectie platen zoals eerder beschreven in paragraaf (3) van dit protocol beschreven.
- Label twee celpopulaties met contrasterende fluorescerende kleurstoffen zoals eerder beschreven in paragraaf (2), van dit protocol beschreven.
- Injecteer 5-10 nl van 2 x 10 ^ 7 cellen / ml in de dooierzak. Houd het injectievolume constant identieke celaantallen injecteren (100-200 kankercellen) van elke celpopulatie
NB: Men kan transparante zebravis embryo's ontbreekt fluorescerende vaatstelsel voor deze test gebruiken. Passieve ingang van deeltjes in de vasculatuur kan worden gecontroleerd door het injecteren van fluorescerende kralen (<10 um) of, wijzigennative, een cellijn die niet intravsate. - Herstellen van de geïnjecteerde embryo's zoals eerder beschreven in paragraaf (3) van dit protocol en vervolgens screenen voor een succesvolle injecties.
- Gebruik een stereoscoop om het scherm en de overdracht van levensvatbare embryo's die met succes werden geïnjecteerd met een nieuw gerecht.
OPMERKING: alle embryo's zou een consequent formaat massa van cellen die zich in de dooier te hebben. Embryo's worden verwijderd wanneer de massa grootte verschilt of indien cellen zich buiten de dooier. - Breng de levensvatbare embryo's naar een nieuw gerecht of kankercellen duidelijk worden gezien in de dooierzak.
- Gebruik een stereoscoop om het scherm en de overdracht van levensvatbare embryo's die met succes werden geïnjecteerd met een nieuw gerecht.
- Incubeer gerecht bij 33 ° C tot klaar om te scoren, meestal 24 - 48 uur.
Opmerking: Deze waarde wordt bepaald als een compromis tussen 37 ° C, de ideale temperatuur voor kankercellen en 28,5 ° C, de ideale temperatuur voor zebravis. - Te scoren intravasation, volg dan de in paragraaf beschreven richtlijnen (4) van dit protocol, maar in plaats daarvan tellen het aantal cancer cellen die met succes zijn binnengedrongen in het vaatstelsel van de caudale regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier hebben we getest de vasculaire invasieve vermogen van veelgebruikte borstkankercellijnen in een zebravis embryo model (figuur 1). Strenge criteria werden gebruikt in het noteren extravasatie voor deze verschillende cellijnen, waarbij positieve gebeurtenissen alleen werden geteld als de kankercellen duidelijk had geëxtravaseerd, dit gebeurt vooral om eventuele vals-positieven die kunnen voortvloeien uit het maken cellulaire afval te beperken.
Onze analyse toonde grote verschillen tussen de lijnen bij invasie werd bepaald 96 uur na injectie in de precardiac sinus (tabel 1). Van de 7 geteste cellijnen zebravis embryo's geïnjecteerd met MDA-MB-231 cellijn vertoonde het grootste aantal extravasatiegebied kankercellen per embryo, een bevinding die consistent is met de aanvaarde metastatische aard van de lijn (figuur 2). We vonden ook dat BT-474 cellen gemakkelijk invaded in het caudale gebied van de embryo's, terwijl andere cellijnen, zoals MCF-7, SK-BR-3 en T-47D-cellen waren minimaal invasieve (figuur 3). Een merkwaardige ontdekking was dat ongeveer de helft van de zebravis embryo geïnjecteerd met de MDA-MB-468 cellen had oedeem in de cardiale regio en deze werden niet gescoord. Bijgevolg, een aantal embryo's geïnjecteerd met MDA-MB-468 cellen werden verwijderd voordat we voldoende levensvatbare specimens die kunnen worden gekwantificeerd voor extravasatie. Ondanks deze ogenschijnlijke verschillen, is het opmerkelijk dat de extravasatie optrad bij elke kanker cellijn getest.
Als een wijziging van het precardiac sinus test, voerden we een competitie experiment waarbij twee populaties van MDA-MB-231 cellen die verschillen in hun vasculaire invasieve vermogen 26 gelijktijdig in de dooierzak van zich ontwikkelende embryo's geïnjecteerd. MDA-MB-231-cellen gekweekt onder omstandigheden samenvloeiende cultuur voorafgaandeinjectie vertoonde een verlaging van intravasation in de circulatie en had daarom een verminderde aanwezigheid in de caudale gebied van het embryo na scoring (figuur 4).
| cellijn | Gem. # Geëxtravaseerde Cellen per Embryo | reeks |
| MDA-MB-231 (Subconfluente) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
Tabel 1: Vergelijking van de Vasculaire Invasieve Vermogen van borstkanker cellijnen in zebravis Veelgebruikte borstkanker cellijnen werden geïnjecteerd in de precardiac sinus van 2 dagen oude zebravis embryo's en scoorde 4 dagen later. Kankercellen invasie van het vaatstelsel en in de caudale regio werden gekwantificeerd in 10 embryo's per cellijn. Het gemiddelde aantal extravasatiegebied kankercellen wordt aangegeven met het bereik.
Figuur 1. Visuele Samenvatting van de zebravis Cancer Cell Assay extravasatie. In deze assay worden kankercellen gelabeld met een fluorescente kleurstof en geïnjecteerd in de precardiac sinus van 2 dagen oude zebravisembryo's, waarvan vaatstelsel wordt gekenmerkt door een tegenover fluorescent reporter. Na 2-4 extra dagen, kankercellen die zijn binnengedrongen in de caudale regio van de embryogescoord en kan een verdovend agarose medium voor latere beeldvorming worden gemonteerd. Elke stap afgebeeld in dit schema overeen met een deel van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Afbeelding Mozaïek van een zebravis embryo 4 dagen na injectie met MDA-MB-231 cellen. Helderveld (A) en fluorescentie (B) mozaïeken weergegeven. Fluorescerende beelden worden afgebeeld als de maximale projectie van een z-stack, waarbij een groene kleur geeft het vaatstelsel en een rode kleur geeft de kankercellen. Schaal bar, 200 pm. (C) caudale regio De embryo's wordt vergroot om extravasatiegebied kankercellen te tonen. Gestippelde fluorescerende labeling wordt gezien op magnificatie. Schaal bar, 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorbeeld Experimentele Resultaten. Hier extravasatie is aangetoond in een embryo geïnjecteerd met BT-474 kankercellen maar niet in een embryo geïnjecteerd met MCF-7, SK-BR-3 en T-47D kankercellen. Pijlpunten duiden extravasatiegebied cellen. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. intravasation van MDA-MB-231 celpopulaties 2 dagen after dooierzak injectie. (A) Dooierzak met groene (invasief) en rode (minder invasief) gemerkt MDA-MB-231-cellen. (B) Het caudale gebied met MDA-MB-231 cellen die de vasculatuur binnengedrongen de staart te bereiken regio. (C) het aantal zebravisembryo's met intravasated MDA-MB-231 cellen in het caudale gebied 2 dagen na de injectie 26. Schaal bars, 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek maakt gebruik van de zebravis model om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen (zie figuur 1) efficiënt testen. Hier pasten we de techniek om een panel van borstkankercellijnen teneinde een basislijn waarop andere onderzoekers vervolgens hun studies bouwen verschaffen (zie tabel 1, figuren 2-3). De waarneming dat MDA-MB-231-cellen gemakkelijk binnengevallen in de caudale regio van de zebravis embryo's zou deze cellijn ideaal voor het testen van stoffen die de vasculaire invasie zou kunnen remmen te maken. Relatief minder invasieve cellijnen, zoals HCC1806 of MDA-MB-468-cellen kan bijvoorbeeld worden toegepast om factoren die anders vasculaire invasie versterken bestuderen. Als deze soorten experimenten de opname van geneesmiddelen vereisen, dan heeft men twee verschillende toedieningsroutes, naargelang het behandelingseffect verwacht duurzaam. Kankercellen kunnen worden voorbehandeld met het geneesmiddel voorafgaand aan injectie inde embryo's of het geneesmiddel kan direct worden toegevoegd aan het water huisvesting van de embryo's waar de kankercellen beïnvloeden door diffusie.
In onze vergelijking, analyseerden we kankercel extravasatie in de zebravis embryo staart 96 uur na injectie in de precardiac sinus. Voor de MDA-MB-231 concurrentie cel assay, intravasation in het verkeer werd bepaald 48 uur na de dooierzak injectie. De tijdstippen gekozen voor analyse vergen doorgaans optimalisatie voor elke cellijn, waar, voor sommige experimenten kan piek extravasatie slechts 24 uur na de injectie optreden. Het is vermeldenswaard dat de zebravis embryo een functionele aangeboren immuunrespons wanneer ze geïnjecteerd met 27 kankercellen en kunnen bijgevolg fluorescerende vuil van de kankercellen worden opgeslokt door immuuncellen zoals macrofagen en neutrofielen. Activiteit van het aangeboren immuunsysteem kan derhalve doen ontstaan vals-positieve fluorescente labeling bij een poging te scoren extravasation; zorg moet worden besteed aan alleen scoren cellen die robuust fluoresceren in het juiste kanaal. Aangezien de huidige kankeronderzoek is het immuunsysteem versterken uitzaaiing 28 impliceert, kan het zebravis embryo model unieke inzichten in dit gebied doordat voor onderzoek van overspraak optreedt tussen kankercellen en het aangeboren immuunsysteem. Dit idee wordt geïllustreerd door een aantal recente studies. De eerste van deze studies aangetoond dat VEGFR remming in zebravis vergroot het vermogen van neutrofielen metastatische gedrag van kankercellen 29 wekken. Een tweede onderzoek bleek dat de CXCR4-CXL12 immune chemokine signalering as intact in zebravis, de receptor op menselijke kankercellen kan aftasten en reageren op de zebravis ligand 30, en de expressie van CXCR4 in kankercellen correleerden met hun invasief vermogen was binnen het diermodel. Verder werd aangetoond dat macrofagen zebravis tentoonstellingted een chemotactische reactie in de richting van de menselijke CXCL12. Een zebravisembryo stam met fluorescent gelabelde neutrofielen 31, bijvoorbeeld, kunnen worden gebruikt om kankercellen interacties te onderzoeken met het immuunsysteem in dit model.
Een paar stappen in het protocol moet bijzondere aandacht. Ten eerste is het essentieel dat kankercellen worden gedissocieerd in een enkele-celsuspensie om te voorkomen verstopping van de naald gedurende injectie in de embryo. Celaggregaten kan de bloedstroom te blokkeren en interfereren met het vermogen van de kankercellen te reizen naar het caudale gebied, waardoor de analyse scheeftrekken. Cellulaire aggregaten kunnen ook veroorzaken bloedvaten te scheuren en, als dit gebeurt, het scoren van de invasieve vermogen van levende kankercellen in deze regio's is betrouwbaar noch aanbevolen. Een ander potentieel probleemgebied betrekking op labelen van de kankercellen met de fluorescerende kleurstof. In experimenten die door ons laboratorium hebben wij gevonden dat lipofiele kleurstoffen,Dil zoals bijvoorbeeld vaak de beste kenmerken te produceren, maar het fluorescentieniveau kan variëren cellijnen. Daarom moet de fluorescente labeling van kankercellen worden geoptimaliseerd voorafgaand aan injectie in de embryo om etiketteren te voorkomen. Het is essentieel dat de overtollige verf weg van de kankercellen wordt gewassen nadat ze zijn gemerkt, en dit wordt bereikt door de verschillende centrifugatiestappen vermeld in het hoofdstuk etikettering van het protocol; Deze stappen kunnen overbodig lijken, maar zijn absoluut noodzakelijk. Teveel fluorescente kleurstof kan toxisch zijn voor cellen of lekken in de bloedstroom, waardoor een kunstmatig fluorescente achtergrond. Veel van deze problemen kunnen worden omzeild door het gebruik van kanker cellen die fluorescerende eiwitten, en het wordt aanbevolen dat deze systemen worden toegepast in plaats van fluorescente kleurstof indien mogelijk. Wanneer tenslotte het scoren van de embryo voor kanker extravasatie, is het noodzakelijk om consequent te gelden voor alle omstandigheden. We vinden thten waarbij ten minste twee personen in het scoren stap helpt om wetenschappelijke nauwkeurigheid: een individu moet voorbereiden de glijbanen en registreren van de resultaten, terwijl de andere persoon maakt de extravasatie uitspraak wordt bewaard blind voor de aandoening die wordt geëvalueerd. Wanneer maken, kan men ofwel kwantificeren extravasatiegebied kankercellen in het staartgebied of maak binaire criteria voor gemakkelijke vergelijking. Fluorescent verven de kankercellen produceert punctata etikettering die zichtbaar bij zeer hoge vergroting (figuur 2c) wordt, hoewel gehele cellen gemakkelijker te onderscheiden van kleinere vergroting (figuur 3), wordt de laatste van die aanbevolen voor het scoren. Afgaande meer dubbelzinnige gevallen van extravasatie kan worden geholpen door het verkrijgen van optische schijfjes op een confocale microscoop, waarbij extravasatie kwantificeren als percentage van alle cellen in het staartgebied kan controleren voor ongelijke belading van kanker cellen in de embryo.
de yolk sac injectieroute verschilt van de precardiac sinus omdat het zorgt voor een groter aantal cellen en dus beter geschikt voor de heterogeniteit binnen een celpopulatie. Zoals getoond in figuur 4, kunnen verscheidene verschillend gemerkte celpopulaties gelijktijdig worden geïnjecteerd in de dooierzak te vergelijken hun invasief vermogen en patroon. De angiogene vermogen van geïnjecteerde cellen en versterkte recrutering van bloedvaten kunnen kankercellen binnenkomst in het staartgebied vergemakkelijken, maar dit aspect is nog niet onderzocht. Technisch dooierzak injecties zijn eenvoudiger uit te voeren dan precardiac sinus injectie echter, anderzijds, de dooierzak een voedselrijke omgeving die de uitgang van kankercellen kunnen belemmeren. Het is ook mogelijk dat de injectie in de buurt van de bloedvaten in de dooier voortijdig kunnen introduceren kankercellen in de circulatie en daarom moet men zorgvuldig te screenen op opgelapte injecties en weglaten deze embryo's van de lijn halen. Ten slotte is het belangrijk to mee dat de dooier micro enigszins kunstmatig, omdat het een analoge primaire plaats bij muizen of mensen ontbreekt.
De verschillende modelsystemen die proberen kankermetastase voorspellen niet zonder hun voor- en nadelen, en de zebravis extravasatie assay is geen uitzondering. Als een groot voordeel, deze test maakt het mogelijk voor de beoordeling van vasculaire invasieve vermogen binnen een functionele bloedsomloop en experimentele vragen kunnen worden beantwoord na een paar dagen. Gezien de snelle doorlooptijd, kan een dergelijk systeem worden gebruikt voor het agressieve gedrag van niet alleen gevestigde cellijnen sonde, maar ook vers geïsoleerde monsters van humane kankerpatiënten. Het grote nadeel is dat dit model nalaat de vroegste en laatste gebeurtenissen van de metastatische cascade door zich uitsluitend richt op de vasculaire invasie. Bovendien, de menselijke kankercellen geïnjecteerd in zebravisembryo's die zijn duidelijk die niet in een syngene milieu en enige wisselwerking met tHij stroma kan daardoor verloren gaan. Ondanks deze beperkingen, de zebravis embryo model heeft een verdiende plaats in zowel basis- als translationeel kankeronderzoek, zoals we hebben gebruikt, het laten zien een rol voor de Hippo signaleringsroute 26 en keratine geassocieerd eiwit 5-5 32 in het vasculaire invasieve vermogen van kanker cellen. Vandaar dit model heeft de potentie om het onderzoek een belangrijke kenmerk van metastatische kanker vergevorderd stadium steun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
