Summary
Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.
Introduction
A doença metastática é uma das principais causas de mortalidade por cancro e diversos mecanismos que permitem a difusão de células de cancro continuam a ser descobertos 1. Para que uma célula cancerosa para metastizar com sucesso, ele deve primeiro invadir através do estroma que rodeia um tumor primário, introduzir (intravasate) para o sistema circulatório, sobreviver em trânsito, saída (extravasamento) a partir da circulação, e, por último, estabelecer uma colónia viáveis no local do órgão distante 2. Intravasation e extravasamento são, assim, passos cruciais na cascata metastática, mas cada célula cancerosa não é inerentemente adepto de interromper e migrando através de junções endoteliais 3. De facto, há uma série de pressões de selecção únicas que circundam invasão vascular de células de cancro e o processo pode ser ainda influenciada por uma variedade de factores endógenos e exógenos 4. Por estas razões, as técnicas que sondam o comportamento agressivo de câncer em estágio avançado, muitas vezes se concentrar em vascular capacidade invasiva como um meio para prever a propagação metastática.
Existem vários sistemas de modelo para facilitar o estudo de invasão vascular de células de cancro in vitro. Os mais utilizados em ensaios in vitro envolvem ou sistemas Transwell para avaliar a migração de células de cancro por meio de uma barreira endotelial ou 5 tecnologia celular Eléctrica-Substrato Impedância de detecção (ECIS) para monitorar a interrupção em tempo real de uma monocamada endotelial intacta por células cancerosas 6. Estes ensaios normalmente não têm a dinâmica dos fluidos e fatores estromais que de outra forma afetar a fixação de células de câncer para uma parede endotelial. Este problema é um pouco iludida por redes vasculares perfusable que surgem a partir da cultura 3D do endotélio com o apoio de células do estroma, e estes sistemas microfluídicos 3D agora representam a vanguarda das atuais in vitro opções de 7,8. Ainda, estas abordagens omitir o microambiente robusta de um sistema circulatório funcionale, portanto, apenas em substituto parcial para os modelos in vivo.
O mais amplamente usado no modelo in vivo de invasão vascular é o rato, em que os ensaios experimentais de metástases são normalmente executada porque eles ocorrem em escalas de tempo relativamente curtos e são geralmente indicativas da capacidade metastática 9. Estes ensaios envolvem injeção direta de células cancerígenas em circulação e, portanto, modelar os estágios finais de metástase, ou seja, extravasamento e célula cancerosa colonização de órgãos. Os ensaios experimentais de metástase diferem de acordo com o local da injecção de células de cancro e em última análise, os órgãos analisados. No primeiro tipo de ensaio, as células cancerosas são injectados na veia da cauda de ratos e sementeira de células de cancro nos pulmões é monitorizada 10,11. O segundo ensaio envolve a execução de injecções intracardíaca para dirigir a sementeira metastática para o microambiente do osso 12-14, mas também no cérebro 15. No terceiro ensaio, cancro cells são injectados no baço, a fim de permitir a colonização do fígado 16, enquanto que a quarta via de administração para dentro da artéria carótida transporta as células cancerosas do cérebro 17,18. Independentemente do método de entrega de células de cancro, a colonização de órgãos é o ponto de extremidade experimental aceite e é geralmente determinada através da luminescência, histologia, ou técnicas baseadas em PCR. Apesar das vantagens fisiológicas de condução de ensaios experimentais de metástases dentro de um hospedeiro murino, estas experiências continuam a exigir semanas a meses para completar e analisar.
O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) surgiu recentemente como um novo sistema para estudar a progressão do câncer 19,20, e permite a avaliação de invasão vascular de células cancerígenas dentro de um sistema circulatório funcional através de uma escala de tempo muito mais curto, quando comparado com camundongos 21-24. O método utiliza uma cepa zebrafish transparente que tem a sua endotélio marcado com um fluo recife de coral verderepórter proteína rescent dirigido pelo promotor kdrl, o receptor de peixes-zebra para o factor de crescimento endotelial vascular 25. No ensaio, as células cancerosas são marcadas com um marcador fluorescente vermelha e injectada no seio de 2-precardiac embriões dia de idade. Em qualquer lugar entre 48 a 96 horas após a injecção, as células cancerosas que invadiram fora da vasculatura e para dentro da região caudal de embriões podem ser marcados de forma eficiente num microscópio de fluorescência. Aqui nós aplicamos a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama humano comumente utilizados para demonstrar grandes diferenças em sua capacidade invasiva vascular. Além disso, nós demonstramos que a mudança do local de injecção ao saco vitelino de embriões permite o estudo de interacções de células heterogéneas, como as populações de células de cancro podem ser diferencialmente marcadas com corantes fluorescentes e injectado em embriões de peixe-zebra que faltam vasculatura fluorescente. Neste último ensaio, as células cancerosas que invadiram a gema e intravasated no vasculature são marcados na região caudal de 24 a 48 horas após a injeção. Devido à eficácia e conveniência de este modelo, peixe-zebra são cada vez mais utilizados para testar rapidamente a capacidade invasiva vascular das células cancerosas sob um ambiente fisiológico.
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Protocol
Declaração de Ética: Zebrafish embriões foram gerados de acordo com um protocolo aprovado IACUC. Estes experimentos foram realizados em conformidade com as recomendações do Comité Animal Care e Use da Universidade Georgetown.
1. Organize embriões para injeção e criar soluções de Stock
- Gerar larvas do peixe requisito para avaliar a invasão vascular célula cancerosa.
- Configurar por pares ou grupo em-cross acasalamento com Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peixe.
NOTA: Geramos Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peixe-zebra, cruzando Tg (kdrl: grcfp) Zn1 25, que expressam recife verde proteína fluorescente coral nas células endoteliais, com uma linha que não tem células de pigmento, mitfa b692; ednrb1 b140, desenvolvido no Centro de Recursos internacionais Zebrafish. - coovos llect, limpo, e remover embriões não fertilizados ou deformados no dia seguinte 22.
- Incubar em embriões de 28,5 ° C até estar pronto para a injecção com células cancerosas, para ocorrer quando os embriões de peixe-zebra são 2-dias pós-fertilização (2 dpf).
- Configurar por pares ou grupo em-cross acasalamento com Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peixe.
- Faça placas de injeção.
- Derreter 25 ml de agarose a 1,5% em dH2O para cada placa.
- Pour 12 ml da agarose em 100 mm x 15 mm de placa de petri e deixa endurecer.
- Re-derreter, em seguida, despeje o agarose restantes na placa.
- posição imediatamente um molde de corte de vidro (3 mm x 7,2 cm de largura x 7,5 cm de comprimento) de modo a que forme um ângulo de 30 graus com a agarose e posicionada no centro da placa.
NOTA: Isto irá criar uma íngreme 60 ° parede e uma rampa inclinada de 30 °. - Tape o molde de vidro no lugar e deixe endurecer agarose.
- Remova cuidadosamente o molde de vidro e ter cuidado para não rasgar o agarose.
NOTA: Os moldes podem ser armazenados em dH 2 O a 4 ° C.
- Equilibrar placa de injeção com água de peixe (0,3 g / L de sal do mar).
- placa de enxaguamento duas vezes com água destilada.
- Equilibrar placa por adição de 10 ml de água de peixe e para a placa lugar num agitador durante 10 min.
- Equilibrar placa uma segunda vez com água peixe.
- Dividir pós-fertilização (DPF) embriões de 2 dias em grupos de injeção, transferindo-os em pratos que contenham água de peixe 22.
- Preparar pratos de recuperação para cada grupo a utilizar após a injecção. Certifique-se de que o prato de recuperação contém 10 ml de água de peixe, mais penicilina (25 ug / ml) e estreptomicina (50 ug / ml).
- Preparar a solução tricaina 2x por adição de 4 ml de estoque tricaina tamponada (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) a 50 ml de água de peixe mais penicilina e estreptomicina.
- Dissolve-se 15 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução 2x tricaina para gerar um meio de montagem que anestésico irá imobilizar embriões vivos para Imaging.
NOTA: Meio de montagem é composto de 1,5% de agarose. - Puxar agulhas microinjeção.
- Coloque tubos capilares de vidro em um extrator pipeta vertical. Puxe pipetas longa cônico utilizando 20 mAmp atual e um elemento de aquecimento 2-coil.
2. Células cancerosas marcação com corante fluorescente lipofílico
- Manter as células cancerosas em suas condições de cultivo recomendadas.
NOTA: Estas linhas foram mantidas em DMEM + FBS a 10%: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 e SK-BR-3. Estas linhas foram mantidas em meio RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 e T-47D. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a incubação. - Gerar uma suspensão de uma única célula, dissociando-se uma cultura aderente de células cancerosas.
- Lave as células primeiro com PBS e, em seguida, trata-se com uma solução de tripsina-EDTA a 0,05%.
NOTA: tempo de exposição Tripsina dependerá da linha celular. - Neutraliza-se a solução de tripsina com SEmeios de cultura celular após as células desanexar contendo rum.
- Lave as células primeiro com PBS e, em seguida, trata-se com uma solução de tripsina-EDTA a 0,05%.
- Centrifugar a suspensão de células de tripsina neutralizada por 5 min a 200 x g, seguida ressuspender o sedimento de células em meio de cultura fresco para contagem das células.
- Contagem de suspensão de células utilizando um contador automático e preparar a 1 milhão de células em 200 ul de meio de cultura celular.
- Verificar a viabilidade celular com trypan exclusão do corante azul antes da injeção em embriões de peixe-zebra.
NOTA: Apenas populações de células viáveis deve ser injetado em embriões de peixe-zebra, como a injeção de células mortas não refletem verdadeira invasão vascular.
- Verificar a viabilidade celular com trypan exclusão do corante azul antes da injeção em embriões de peixe-zebra.
- Adicionar 2 ul de corante lipofílico vermelho para a suspensão de células de cancro para uma diluição de 1: 100, misturar bem, e, em seguida, incuba-se a mistura a 37 ° C durante 20 min.
NOTA: A concentração do corante e tempo de rotulagem pode precisar de ser optimizada para cada linha de células. - Após a incubação, adicionar 1 ml de meio fresco para o tubo e, em seguida, centrifuga-se durante 5 min a200 x g.
- Lavar corante fluorescente residual das células cancerosas.
- Aspirar o sobrenadante do sedimento de células, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de cultura fresco, e centrifuga-se durante 5 min a 200 x g.
- Repetir o passo de lavagem uma segunda vez: aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio fresco e em seguida centrifugar novamente durante 5 min a 200 x g.
- Repetir o passo de lavagem terceira vez: aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio fresco e em seguida centrifugar novamente durante 5 min a 200 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células contendo 1 milhão de células cancerosas marcadas em 500 uL de meio fresco.
NOTA: 0,5 mM de EDTA pode ser adicionado ao meio para evitar a aglutinação de células.
3. Células cancerosas injetar na Sinus Pré-cardíaca de embriões Zebrafish
- Anexar sistema de distribuição de microinjeção a uma fonte de ar pressurizado e ligue the microinjecção fonte de alimentação do sistema de distribuição.
- pressão de teste pressionando o pedal. Um breve pulso de ar deve emitir a partir de suporte da agulha.
- Equilibrar as placas de injecção duas vezes com a solução 2x tricaina.
- Para cada passo de equilibração, adicionar 20 ml de solução 2x tricaina à placa de injecção e lugar num agitador durante 10 min.
- Usar uma pipeta de plástico para transferir um grupo de embriões para um pequeno prato contendo a solução 2x tricaina.
- Aterrar a agulha de injeção microinjeção com células cancerosas utilizando uma ponta de pipeta gel-loading.
- Coloque a agulha em um recipiente de armazenamento de eletrodo com a ponta virada para baixo assim que as células se estabelecer perto da ponta.
- Transferir 20 - 30 embriões anestesiados para uma placa de injeção, recolhendo os embriões com abundância de 2x tricaina em uma pipeta de plástico.
- Permitir que embriões para se instalar na ponta da pipeta.
- cavalheiroLY expulsar embriões na calha da placa de injecção, espalhando-se os embriões ao longo do comprimento da calha.
- Alinhar embriões com cabeças voltadas para cima e barrigas de frente para a parede íngreme da calha.
NOTA: solução tricaina deve abranger tanto o comprimento da calha ea superfície agarose plana, com embriões única residente no cocho. Embriões está agora pronto para a injecção.
- Injectar 50 - 100 células cancerosas (2-5 nl) no seio precardiac dos embriões de peixe-zebra utilizando o sistema de micro-injecção de distribuição.
- Coloque a agulha ao suporte de agulha de um micromanipulador.
- Posicione a placa de injecção sob a estereoscópio com a parede de 60 graus para a esquerda e se concentrar no topo embrião no 25x.
- Posicionar o micromanipulador de modo que, quando estendida, a agulha vai perfurar o embrião.
- Estender a agulha de olho até que seja quase tocando o embrião.
- Olhando sob o microscópio, alinhe a agulha de modo tchapéu que vai perfurar o embrião após nova extensão.
- Pierce o embrião através do saco vitelino colocando a ponta apenas em, mas não no, o seio pré-cardíaca.
- Injectar células de pressionar o pedal de pé. A força da injecção expele as células para dentro do seio cardíaca. Retrair a agulha.
- Usando a mão direita, estender e retrair a agulha de injeção. Com a mão esquerda, fazer ajustes finos para a posição seguinte embrião.
- Voltar a agulha para o frasco de armazenamento eletrodo durante a configuração para injetar outra placa.
- Transferir os embriões para o prato de recuperação uma vez que toda a placa é injectado.
- Incline a placa de injecção para reunir os embriões na parte inferior, lavando quaisquer embriões restantes para fora da calha, e recolhendo-os com a pipeta de plástico.
- Permitir que os embriões para se instalar na parte inferior da pipeta.
- Transferir os embriões para o prato de recuperação num volume mínimo de tricaina.
- Incubate prato recuperação a 28 ° C durante 1 h.
- Separados embriões de peixe-zebra viáveis a partir de embriões mortos e outros detritos.
- Incubar prato a 33 ° C até que esteja pronto para a pontuação, normalmente 24-96 horas.
NOTA: Este valor é determinado como um compromisso entre 37 ° C, a temperatura ideal para as células cancerígenas, e 28,5 ° C, a temperatura ideal para o peixe-zebra.
4. Pontuação extravasamento
- Anestesiar o lote de embriões a ser marcado, colocando-os em um prato com uma solução tricaina.
- Coloque um larvas anestesiados em uma lâmina de microscopia de depressão em uma gota de tricaina.
- larvas Orient lateralmente para imagiologia óptima da região caudal.
- Contar o número de células cancerosas que invadiram com sucesso fora da vasculatura, concentrando-se para cima e para baixo através da região da cauda de discernir claramente células intactas.
NOTA: É melhor ter pelo menos dois indivíduos envolvidos em tseu processo, em que o indivíduo marcando o peixe é cego para a condição experimental que está sendo avaliada.- Pontuação larvas num microscópio de fluorescência composto com a lente objectiva de 10x. Use o objetivo de 20x para todas as chamadas difíceis.
5. Embriões de montagem em lâminas e imagens de fluorescência subsequente
- Derreter solução de agarose / tricaina 1,5% e levar a 37 ° C.
- Anestesiar o embrião a ser trabalhada, colocando-o em solução tricaina.
- Transferir o embrião de uma gota de solução tricaina à superfície da imagem. Opcionalmente, use um prato ou lâmina de microscópio com fundo de vidro.
- Usar uma pipeta de vidro para remover o excesso de solução tricaina, retendo o embrião sobre a superfície da imagem.
- Sobrepor uma gota da solução de agarose fundida sobre o embrião.
- Rapidamente, antes da agarose polimeriza, use uma ferramenta delicada, como uma escova de cílios, para orientar o embrião lateralmente para geração de imagens, dando um cuidado extrapara garantir que o embrião é achatada ao longo da superfície da imagem.
- Mergulhe a queda de agarose agora polimerizado sob solução tricaina.
- Sujeitar o embrião de peixe-zebra ao vivo para imagens microscópicas.
6. Modificação: A injecção de células de câncer na gema Sac de embriões Zebrafish
- Preparar o sistema de injecção e placas de micro-injecção do dispensador como descrito anteriormente na secção (3) do presente protocolo.
- Rotular duas populações de células contrastando com corantes fluorescentes, como descrito anteriormente na secção (2) do presente protocolo.
- Injectar 5 - 10 nl de 2 x 10 ^ 7 células / ml para o saco vitelino. Manter constante o volume de injecção para injectar os números de células idênticas (100 - 200 células cancerígenas) a partir de cada população de células
Nota: Pode utilizar-se embriões de peixe-zebra que faltam transparentes vasculatura fluorescente para este ensaio. entrada passiva de partículas na vasculatura pode ser controlada por, injectando partículas fluorescentes (<10 um) ou, alternativamente, uma linha de células que não intravsate. - Recuperar os embriões injectados como descrito anteriormente na secção (3) do presente protocolo e, em seguida, a tela para injectáveis bem sucedidas.
- Use um estereoscópio para triagem e transferência de embriões viáveis que foram injetados com sucesso a um novo prato.
NOTA: Todos os embriões devem ter uma massa dimensionados de forma consistente de células localizadas na gema. Os embriões são descartados se o tamanho de massa diferente ou se quaisquer células estão localizados fora da gema. - Transferir os embriões viáveis a um novo prato se as células cancerosas são claramente vistos no saco vitelino.
- Use um estereoscópio para triagem e transferência de embriões viáveis que foram injetados com sucesso a um novo prato.
- Incubar prato a 33 ° C até que esteja pronto para marcar, tipicamente 24 - 48 h.
NOTA: Este valor é determinado como um compromisso entre 37 ° C, a temperatura ideal para as células cancerígenas, e 28,5 ° C, a temperatura ideal para o peixe-zebra. - Para marcar intravasation, siga as orientações descritas na secção (4) deste protocolo, mas em vez disso contar o número de ccélulas Ancer que invadiram com sucesso na vasculatura da região caudal.
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Representative Results
Aqui nós testamos a capacidade invasiva vascular de linhas celulares de cancro da mama habitualmente utilizada num modelo de embrião do peixe-zebra (Figura 1). rigorosos critérios foram empregados em extravasamento de pontuação para estas linhas celulares diferentes, onde os eventos positivos só foram contados se as células cancerosas tinha claramente extravasada, este ser feito principalmente a limitar os falsos positivos que podem surgir com marcando restos celulares.
A análise revelou diferenças acentuadas entre as linhas quando invasão foi avaliada 96 horas após a injecção para dentro do seio precardiac (Tabela 1). Das 7 linhas de células testadas, os embriões de peixe-zebra injectados com a linha celular MDA-MB-231 exibiu o maior número de células cancerosas extravasados por embrião, a conclusão de que é consistente com a natureza metastática aceite da linha (Figura 2). Nós também descobrimos que BT-474 células prontamente invaded na região caudal dos embriões, enquanto que outras linhas de células, tais como MCF-7, células SK-BR-3 e T-47D, eram minimamente invasiva (Figura 3). Uma descoberta foi curioso que cerca de metade dos embriões de peixe-zebra injectados com as células MDA-MB-468 apresentavam edema na região do miocárdio e estes não foram marcados. Como consequência, um número de embriões injectados com células MDA-MB-468 foram descartados antes encontramos espécimes viáveis suficientes que podem ser quantificados para o extravasamento. Apesar destas diferenças aparentes, é notável que o extravasamento ocorreu com cada linha celular de cancro testadas.
Como uma modificação do ensaio precardiac sinusal, foi realizada uma experiência de competição em que duas populações de células MDA-MB-231, que diferem na sua capacidade invasiva vascular 26 foram simultaneamente injectados no saco vitelino de embriões em desenvolvimento. As células MDA-MB-231 propagado em condições de cultura confluente anteriorespara injecção exibiu uma redução em intravasamento para a circulação e, portanto, tinha uma presença reduzida na região caudal dos embriões em cima de pontuação (Figura 4).
| Linha celular | AVG. # As células extravasado por Embryo | Alcance |
| MDA-MB-231 (subconfluentes) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1,5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0,2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Quadro 1: Comparação da capacidade invasiva Vascular de linhas celulares de cancro da mama em Zebrafish Comumente usado linhas de células de câncer de mama foram injetados no seio precardiac de 2 dias de idade embriões de peixe-zebra e marcou 4 dias depois. As células cancerosas invasoras da vasculatura e para dentro da região caudal foram quantificadas em 10 embriões por linha celular. O número médio de células cancerosas extravasados é indicada juntamente com o intervalo.
Figura 1. Resumo visual da célula cancerosa Zebrafish Extravasamento ensaio. Neste ensaio, as células cancerosas são marcadas com um corante fluorescente e injectado para dentro do seio precardiac de 2 dias de idade embriões de peixe-zebra, cuja vasculatura é marcada por um repórter fluorescente contrastante. Seguindo 2 - 4 dias adicionais, as células cancerosas que invadiram na região caudal do embrião sãomarcado e pode ser montado num meio de agarose anestésico para imagiologia subsequente. Cada passo descrito no este corresponde esquemáticos para uma seção do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem Mosaico de um embrião de peixe-zebra 4 dias após a injeção de MDA-MB-231. Brightfield (A) e fluorescentes mosaicos (B) mostrado. As imagens fluorescentes são descritos como a projecção máxima de um z-pilha, em que uma cor verde indica a vasculatura e uma cor vermelho indica as células cancerosas. Barra de escala, de 200 mm. (C) região caudal do embrião é ampliada para mostrar células cancerosas extravasados. marcação fluorescente ponteada é visto em cima magnificação. Barra de escala, 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplo de Resultados Experimentais. Aqui o extravasamento é demonstrado em um embrião injectados com células cancerosas BT-474, mas não num embrião injectados com células MCF-7, SK-BR-3 e T-47D células cancerosas. Pontas de seta indicam células extravasados. Barra de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. intravasation de populações de células MDA-MB-231 2 dias afTer Yolk Sac Injecção. (A) saco vitelino com verde (invasivo) e vermelho (menos invasivo) marcado MDA-MB-231. (B) A região caudal com células MDA-MB-231 que invadiram a vasculatura para alcançar a cauda região. (C) o número de embriões de peixes-zebra com intravasated células MDA-MB-231 na região caudal de 2 dias após a injecção 26. Barras de escala, de 250 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Esta técnica utiliza o modelo de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular (ver Figura 1). Aqui nós aplicada a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama a fim de fornecer uma linha de base sobre a qual outros investigadores pode então construir os seus próprios estudos (ver Tabela 1 e Figuras 2 - 3). A observação de que as células MDA-MB-231 facilmente invadidas na região caudal de embriões de peixe-zebra faria esta linha celular ideal para agentes que possam inibir a invasão vascular testar. linhas de células comparativamente menos invasivos, como HCC1806 ou MDA-MB-468 células, por exemplo, podem ser empregues para estudar factores que de outro modo potenciam invasão vascular. Se estes tipos de experiências exigem a inclusão de drogas, em seguida, um tem duas rotas distintas de entrega, dependendo de se o efeito do tratamento deve ser durável. As células cancerosas podem ser pré-tratados com o fármaco antes da injecção noos embriões ou o fármaco pode ser directamente adicionado à água da carcaça os embriões em que terá impacto sobre a células cancerosas por difusão.
Na nossa comparação, analisou-se a extravasão de células de cancro no embrião do peixe-zebra cauda 96 horas após a injecção para dentro do seio precardiac. Para o ensaio de competição de células MDA-MB-231, intravasamento em circulação foi avaliada 48 horas após a injecção do saco vitelino. Os intervalos de tempo escolhidos para análise tipicamente requerem optimização para cada linha celular em que, para algumas experiências, pico extravasão pode ocorrer apenas 24 horas após a injecção. Vale a pena notar que os embriões de peixe-zebra tem um sistema imune inato funcional quando são injetados com células cancerosas 27 e, consequentemente, os restos fluorescentes das células cancerosas podem ser tragado pelas células imunes, como macrófagos ou neutrófilos. Atividade do sistema imune inato pode, portanto, potencialmente criar marcação fluorescente falso-positivo ao tentar marcar extravasatíon; cuidado deve ser dado apenas as células que apresentam fluorescência de forma robusta no canal apropriado marcar. Desde a pesquisa de cancro atual está implicando o sistema imunológico para reforçar a metástase do câncer 28, o modelo de embrião de peixe-zebra pode fornecer uma visão única para esta área, permitindo a análise de crosstalk ocorre entre células cancerosas e do sistema imune inato. Esta ideia é exemplificado por um par de estudos recentes. O primeiro destes estudos demonstraram que a inibição de VEGFR dentro de peixe-zebra reforçada a capacidade dos neutrófilos para induzir o comportamento metastático a partir de células de cancro 29. Um segundo estudo mostrou que a quimiocina imune CXCR4-CXL12 eixo de sinalização está intacta dentro do peixe-zebra, como o receptor em células cancerígenas humanas foi capaz de sentir e responder ao ligando peixe-zebra 30, e a expressão de CXCR4 nas células cancerosas correlacionada com a sua capacidade invasiva no modelo animal. Além disso, demonstrou-se que os macrófagos do peixe-zebra exposiTed uma resposta quimiotáctica em direcção CXCL12 humana. Uma estirpe de embriões de peixe-zebra com neutrófilos marcados com fluorescência 31, por exemplo, poderia ser utilizada para explorar as interacções celulares de cancro com o sistema imune neste modelo.
A poucos passos do protocolo exigem uma atenção especial. Em primeiro lugar, é essencial que as células cancerosas ser dissociadas numa suspensão de célula única, a fim de evitar o entupimento da agulha durante a injecção em embriões. agregados celulares também podem bloquear o fluxo de sangue e interferir com a capacidade das células cancerosas a deslocar-se para a região caudal, distorcendo assim a análise. agregados celulares também podem induzir os vasos sanguíneos se rompem e, se isso ocorrer, marcando a capacidade invasiva de células vivas de câncer nestas regiões que não é confiável nem recomendado. Outra área de potencial problema refere-se a marcação das células cancerosas com o corante fluorescente. Em experimentos dirigidos por nosso laboratório, descobrimos que corantes lipofílicos,como DII por exemplo, tendem a produzir a melhor rotulagem, mas o seu nível de fluorescência pode variar entre linhagens celulares. Por esta razão, a marcação fluorescente das células cancerosas deve ser optimizada, antes da injecção em embriões, a fim de evitar o excesso de rotulagem. É fundamental que o excesso de corante é removido por lavagem das células cancerosas depois de terem sido etiquetados, e isto é conseguido por vários passos de centrifugação os indicados na secção de rotulagem do protocolo; estes passos pode parecer supérfluo, mas eles são absolutamente necessárias. O excesso de corante fluorescente pode ser tóxico para as células ou vazar para a corrente sanguínea, produzindo um fundo fluorescente artefactual. Muitos destes problemas podem ser contornados mediante a utilização de células cancerosas que expressam proteínas fluorescentes, e recomenda-se que estes sistemas sejam utilizados no lugar de corante fluorescente quando possível. Finalmente, quando marcou os embriões para o extravasamento de câncer, é imperativo aplicar critérios consistentes para todas as condições. Encontramos tha envolver pelo menos dois indivíduos na etapa de pontuação ajuda a manter o rigor científico: um indivíduo tem a tarefa de preparar os slides e gravar os resultados, enquanto o outro indivíduo torna o veredicto extravasamento e é mantido cega à condição a ser avaliada. Quando conseguir, uma pode quantificar as células cancerosas extravasados na região da cauda ou criar critérios binários para facilidade de comparação. Fluorescentemente tingir as células cancerosas produz rotulagem ponteada que será visível em ampliação muito alta (Figura 2c), que as células inteiras são mais fáceis de discernir a ampliação inferior (Figura 3), o último dos quais é recomendada para a pontuação. A julgar casos mais ambíguas de extravasamento pode ser auxiliada pela aquisição de fatias ópticos em um microscópio confocal, onde a quantificação extravasamento como uma percentagem de todas as células na região da cauda pode controlar o carregamento desigual de células cancerosas para o embrião.
o yolk saco via de injecção é diferente a partir do seio precardiac medida em que permite um maior número de células e, portanto, melhor acomode a heterogeneidade dentro de uma população de células. Como mostrado na Figura 4, várias populações de células marcados diferencialmente podem ser simultaneamente injectados no saco vitelino para comparar a sua capacidade invasiva e padrão. A capacidade angiogénica de células injectadas e melhora o recrutamento de vasos sanguíneos pode facilitar a entrada de células de cancro na região da cauda, mas este aspecto ainda não foi analisada. Tecnicamente, yolk sac injecções são mais fácil de realizar do que uma injecção de precardiac seio embora, por outro lado, o saco vitelino é um ambiente rico em nutrientes que podem dificultar a saída de células cancerosas. Também é possível que a injeção perto de vasos sanguíneos na gema pode prematuramente introduzir células cancerosas para a circulação e, portanto, deve-se cuidadosamente selecionar para injecções mal feitos e omitir estes embriões a partir de pontuação. Por último, é importante to note que o microambiente gema é um pouco artificial, uma vez que carece de um site principal análoga em ratos ou de seres humanos.
Os vários sistemas modelo que buscam prever a metástase do câncer não são sem suas vantagens e desvantagens, e no ensaio de extravasamento de peixe-zebra não é excepção. Como uma grande vantagem, este ensaio permite a avaliação da capacidade invasiva vascular dentro de um sistema circulatório funcional e perguntas experimentais podem ser respondidas depois de apenas alguns dias. Dado o tempo de resposta rápido, um tal sistema pode ser utilizado para sondar o comportamento agressivo de linhas celulares estabelecidas, não só, mas também a partir de amostras de pacientes de cancro humanas isoladas de fresco. A principal desvantagem é que este modelo omite os eventos mais antigos e mais recentes da cascata metastática, concentrando-se exclusivamente na invasão vascular. Além disso, as células cancerígenas humanas injetadas estes embriões de peixe-zebra, obviamente, não estão operando em um ambiente singênica e alguns interação com tele estroma pode, consequentemente, ser perdido. Apesar dessas limitações, o modelo de embrião de peixe-zebra tem um merecido lugar em investigação básica e translacional cancro, como já empregava mostrar um papel para o Hippo via de sinalização 26 e proteína associada a queratina 5-5 32 na capacidade invasiva vascular de câncer células. Assim, este modelo tem o potencial para auxiliar a investigação de uma marca chave do cancro metastático fase avançada.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
