Summary
Этот метод использует эмбрионов данио, чтобы эффективно испытать сосудистую инвазивный способность раковых клеток. Флуоресцентные раковые клетки вводят в precardiac пазухи или желтка развивающихся эмбрионов. раковой клетки сосудистой инвазии и экстравазация оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии хвостовой области от 24 до 96 ч позже.
Introduction
Метастатического заболевания является одной из основных причин смертности от рака и многих механизмов, позволяющих распространение раковых клеток остаются быть обнаружены 1. Для того, чтобы раковой клетки, чтобы успешно метастазировать, он должен сначала вторгнуться через стромы, которая окружает первичную опухоль, введите (intravasate) в кровеносную систему, выжить в пути, выход (вытекать из сосудов в ткань) из обращения, и, наконец, создать жизнеспособную колонию на отдаленном участке органа 2. Intravasation и кровоизлияние, таким образом , важные шаги в метастатического каскада, но каждая клетка рака не по своей сути искусными в срыве и миграции через эндотелиальные переходов 3. На самом деле, существует целый ряд уникальных отбора давлений , которые окружают раковых клеток сосудистой инвазии , и процесс может быть в дальнейшем под воздействием самых разных эндогенных и экзогенных факторов 4. По этим причинам методы, проверяющие агрессивное поведение продвинутой стадии рака часто сосредотачиваются на Vascular инвазивной способности в качестве средства для прогнозирования метастазирования.
Различные модельные системы существуют , чтобы облегчить изучение раковых клеток сосудистой инвазии в пробирке. Наиболее часто используемых в анализах пробирке включают либо Transwell системы для оценки миграции раковых клеток через эндотелиального барьера 5 или технологии Electric Cell-подложка сопротивление зондированию (ECIS) для наблюдения за нарушения в реальном времени неповрежденной эндотелиальной монослоя раковых клеток 6. Эти анализы, как правило, не имеют гидродинамику и факторы стромы, которые бы в противном случае повлиять на прикрепление клеток рака к эндотелиальной стенке. Этот вопрос несколько обойдена perfusable сосудистых сетей , которые возникают из 3D культуры эндотелий с поддержкой стромальных клеток, и эти 3D микрофлюидальные системы в настоящее время представляют передовые позиции существующих в пробирке вариантов 7,8. Тем не менее, эти подходы не указывать надежный микросреду функциональной системы кровообращенияи , следовательно , только в части замены для моделей в естественных условиях.
Наиболее широкое применение в естественных условиях модели сосудистой инвазии является мышь, в которой экспериментальные метастазирование анализы обычно выполняются , так как они происходят на относительно коротком временном масштабе и , как правило , свидетельствуют о метастатической способности 9. Эти анализы включают прямой инъекции раковых клеток в оборот и, следовательно, моделировать конечные стадии метастазирования, а именно транссудации и раковых клеток колонизации органов. Экспериментальные метастазирование анализы различаются в зависимости от места инъекции раковых клеток и органов, в конечном счете проанализированы. В первом типе анализа, раковые клетки инъецируют в хвостовую вену мышей и клеток рака посевом в легких контролируется 10,11. Второй анализ включает проведение внутрисердечной инъекции , чтобы направить метастатический высев по направлению к кости микроокружения 12-14, но и мозг 15. В третьем исследовании, рак Cгезов впрыскивают в селезенке, чтобы позволить колонизация печени 16 , тогда как четвертый путь доставки в сонную артерию несет раковые клетки головного мозга 17,18. Независимо от способа доставки раковых клеток, колонизация орган является признанной экспериментальной конечной точки и, как правило, определяется с помощью люминесценции, гистологии, или методов на основе ПЦР. Несмотря на физиологические преимущества проведения экспериментальных анализов метастазов в мышиной хозяина, эти эксперименты все еще требуют недель до нескольких месяцев, чтобы завершить и анализировать.
Данио модель (Danio rerio) недавно стала новой системы для изучения прогрессии рака 19,20, и позволяет для оценки раковых клеток сосудистой инвазии в пределах функциональной системы кровообращения за гораздо более короткие сроки по сравнению с мышами 21-24. Метод использует прозрачный данио штамм, который имеет свою эндотелий маркированный с зеленым коралловых рифов флуофлуоресцентным белком репортер под контролем промотора kdrl, данио рецептора фактора роста сосудистого эндотелия 25. В анализе, раковые клетки помечены красным флуоресцентным маркером и вводят в precardiac пазухи 2-дневных эмбрионов. Где-то между 48 до 96 ч после инъекции, раковые клетки, которые захватившие из сосудистую сеть и в хвостовую область эмбрионов может быть забит эффективно на флуоресцентный микроскоп. Здесь мы применяем технику к панели обычно используемых линий клеток рака молочной железы человека, чтобы продемонстрировать сильнейшие различия в их сосудистой инвазивной способности. Более того, мы показали, что изменение места инъекции в эмбрион желтка позволяет для изучения гетерогенных взаимодействий клеток, в популяции раковых клеток может быть дифференциально меченные флуоресцентными красителями и вводили в эмбрионов данио рерио, не имеющих флуоресцентный сосудистую сеть. В этом последнем исследовании, раковые клетки, которые наводнили желток и intravasated в vasculaturе засчитываются в каудальной области от 24 до 48 ч после инъекции. Благодаря эффективности и удобства данной модели данио все чаще используют для быстрого тестирования сосудистой инвазивной способность раковых клеток при физиологическом обстановке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: эмбрионов данио были получены в соответствии с утвержденным протоколом IACUC. Эти эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.
1. Организовать зародыши для инъекций и создание маточных растворов
- Произведите необходимый личинок данио для оценки раковых клеток сосудистой инвазии.
- Установите парное или группа перехода через вязки с Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 рыбы.
Примечание: Мы создали Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 данио, пересекая Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, выражающие зеленый риф коралловый флуоресцентный белок в эндотелиальных клетках, с линией , которая испытывает недостаток в пигментные клетки, mitfa b692; ednrb1 B140, разработанный в Международном ресурсном центре данио. - Колорадоllect яйца, очистить и удалить неоплодотворенные или деформированные эмбрионов на следующий день 22.
- Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° С до готовности для инъекций с раковыми клетками, происходит, когда данио эмбрионы 2-х дней после оплодотворения (2 денье).
- Установите парное или группа перехода через вязки с Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 рыбы.
- Сделать инъекционные пластины.
- Растопить 25 мл 1,5% агарозы в дН 2 O для каждой пластины.
- Налейте 12 мл агарозы в 100 мм х 15 мм чашки Петри и дайте затвердеть.
- Переплавить затем влить оставшиеся агарозы в пластине.
- Сразу позиционировать шлифованного стекла плесенью (3 мм х 7,2 см в длину в ширину 7,5 см), так что она находится под углом 30 градусов по отношению к агарозы и расположенный в центре пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаст крутой 60 ° стену и 30 ° наклонную рампу. - Лента стеклянную форму на месте, и пусть агарозном затвердевать.
- Аккуратно снимите стеклянную форму и быть осторожным, чтобы не разорвать агарозы.
Примечание: Пресс - формы могут быть сохранены в дН 2 O при температуре 4 ° С,
- Равновесие инъекционный пластина с рыбой воды (0,3 г / л морской соли).
- Полоскание пластину дважды дистиллированной водой.
- Равновесие пластины путем добавления 10 мл воды рыбы к пластине и помещают на шейкере в течение 10 мин.
- Равновесие пластина во второй раз с рыбой воды.
- Split 2-день после оплодотворения (DPF) эмбрионов в группы для инъекций путем переноса их в чашки , содержащие рыбу воду 22.
- Готовят блюда восстановления для каждой группы, чтобы использовать после инъекции. Убедитесь, что восстановление блюдо содержит 10 мл рыбьего воды, плюс пенициллин (25 мкг / мл) и стрептомицин (50 мкг / мл).
- Готовят раствор 2x Tricaine добавлением 4 мл буферного Tricaine запаса (4 мг / мл, 10 мМ Трис, рН 7) до 50 мл рыбьего воды плюс пенициллин и стрептомицин.
- Растворите 15 мг низкой температурой плавления агарозы в 10 мл раствора Tricaine 2x для создания монтажной обезболивающий среду, которая будет иммобилизации живых эмбрионов для Imaginг.
Примечание: Монтажная среда состоит из 1,5% агарозы. - Потянуть микроинъекции иглы.
- Поместите стеклянной капиллярной трубки в вертикальной пипетки съемника. Потяните длинные конические пипеток с использованием 20 MAMP тока и нагревательный элемент 2-катушки.
2. Клетки Этикетировочное рака с липофильными флуоресцентным красителем
- Поддерживать раковые клетки в рекомендуемых условиях культивирования.
Примечание: Эти линии поддерживали в DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, и SK-BR-3. Эти линии поддерживали в RPMI + 10% FBS: HCC 1806 и T-47D. Все клеточные линии поддерживали при 37 о С и 5% СО 2 в течение инкубации. - Генерирование суспензию одноклеточных диссоциацией культуры прикрепленных раковых клеток.
- Промыть клетки сначала с PBS и затем обрабатывают 0,05% раствором трипсина-ЭДТА.
Примечание: Трипсин время экспозиции будет зависеть от клеточной линии. - Нейтрализовать трипсина решение с таковойРом содержащих среды для культивирования клеток после того, как клетки разделиться.
- Промыть клетки сначала с PBS и затем обрабатывают 0,05% раствором трипсина-ЭДТА.
- Центрифуга трипсин-нейтрализованный клеточной суспензии в течение 5 мин при 200g, а затем ресуспендируют осадок клеток в свежей культуральной среды для подсчета клеток.
- Подсчитайте суспензии клеток с использованием автоматического счетчика и подготовить 1 миллион клеток в 200 мкл среды для культивирования клеток.
- Проверка жизнеспособности клеток с трипанового исключения синий краситель перед инъекцией в данио эмбрионов.
Примечание: Только популяции жизнеспособных клеток следует вводить в эмбрионов данио, как инъекция мертвых клеток не будет отражать истинную сосудистую инвазию.
- Проверка жизнеспособности клеток с трипанового исключения синий краситель перед инъекцией в данио эмбрионов.
- Добавляют 2 мкл красной липофильного красителя к суспензии клеток рака в течение разведении 1: 100, хорошо перемешать, а затем инкубируют смесь при температуре 37 ° С в течение 20 мин.
Примечание: Концентрация времени красителя и маркировки, возможно, должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии. - После инкубации добавляют 1 мл свежей среды в трубе, а затем центрифугировать в течение 5 мин при200 х г.
- Смыть остаточного флуоресцентного красителя из раковых клеток.
- Аспирата супернатант из клеточного осадка, вновь суспендируют таблетку в 1 мл свежей культуральной среды и центрифуге в течение 5 мин при 200 х г.
- Повторите на стадии промывки во второй раз: аспирата супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежей среды, а затем снова центрифуге в течение 5 мин при 200 х г.
- Повторите отмывкой третий раз: аспирата супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежей среды, а затем снова центрифуге в течение 5 мин при 200 х г.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток, содержащий 1 миллион меченые раковых клеток в 500 мкл свежей среды.
Примечание: 0,5 мМ ЭДТА могут быть добавлены в средствах массовой информации, чтобы предотвратить образование комков клеток.
3. Клетки рака путем инъекций в предварительно сердечной пазухи эмбрионов данио рерио
- Присоединить систему дозирования микроинъекции с источником сжатого воздуха и включите гое микроинъекции источник Система распределения питания.
- Испытательное давление при нажатии на педаль. Краткий импульс воздуха должен излучать из держателя иглы.
- Равновесие инъекции пластин дважды с раствором 2x Tricaine.
- Для каждого шага для уравновешивания, добавляют 20 мл раствора Tricaine 2x к инъекционной пластины и место на шейкере в течение 10 мин.
- С помощью пластиковой пипетки перенести группу эмбрионов на небольшое блюдо, содержащую раствор 2x Tricaine.
- Засыпка инъекционной иглы микроинъекции с раковыми клетками с помощью гель-загрузки пипеткой наконечник.
- Поместите иглу в банку для хранения электрода с острым концом, обращенным вниз таким образом клетки селиться вблизи вершины.
- Передача 20 - 30 наркотизированных эмбрионов с инъекционной пластины путем сбора эмбрионов с большим количеством 2х Tricaine в пластиковой пипеткой.
- Разрешить эмбрионов поселиться в кончике пипетки.
- джентльменLY изгнать эмбрионов в корыто инъекционной пластины, распространяясь эмбрионов по длине желоба.
- Совместите эмбрионов с головами вверх и животы, стоящих перед крутой стенкой желоба.
Примечание: Tricaine решение должно охватывать как длину желоба и плоскую поверхность агарозы, с эмбрионы только проживающих в корыто. Эмбрионы теперь готовы к инъекции.
- Вводят 50 - 100 раковых клеток (2 - 5 NL) в precardiac пазухи из эмбрионов данио с использованием системы микроинъекции дозирования.
- Прикрепите иглу к держателю иглы микроманипулятора.
- Поместите пластину впрыска под стереоскоп с углом 60 градусов к стене слева и сосредоточиться на верхней эмбриона при 25x увеличении.
- Поместите микроманипулятора так, что, когда они распространяются, игла будет проколоть эмбриона.
- Продлить иглу на глаз до тех пор, пока не будет почти касаясь эмбриона.
- Глядя под микроскопом, совместите иглу так тшляпа будет проколоть эмбриона при дальнейшем расширении.
- Пирс эмбрион через желтка помещая кончик только на, но не в, предварительно кардиальный пазухи.
- Вводят клетки путем нажатия на педаль. Усилие инжекции выгоняет клеток в сердечной синусе. Отвод иглу.
- Используя правую руку, удлиняются и сжимаются инъекционной иглой. С левой стороны, выполнить точную настройку в положение следующего эмбриона.
- Верните иглу в сосуд для хранения электрода при установке, чтобы придать другую тарелку.
- Перенос эмбрионов на блюдо восстановления после того, как вся пластина впрыскивается.
- Наклон инъекционную пластины объединить эмбрионов на дне, промывая все оставшиеся эмбрионы из корыта, и собирать их с пластиковой пипеткой.
- Дайте эмбрионы осесть в нижней части пипетки.
- Перенос эмбрионов на блюдо восстановления в минимальном объеме Tricaine.
- Инкубаторыт.е восстановление блюдо при температуре 28 ° С в течение 1 ч.
- Отдельные жизнеспособных эмбрионов данио из мертвых эмбрионов и другого мусора.
- Инкубируйте блюдо при 33 ° С до готовности к скоринг, как правило, 24 - 96 ч.
Примечание: Эта температура определяется как компромисс между 37 ° C, оптимальная температура для раковых клеток, и 28,5 & deg; С, оптимальная температура для данио рерио.
4. Подсчет очков Экстравазационным
- Обезболить партия эмбрионов забито, помещая их в блюдо с Tricaine раствором.
- Поместите наркозом личинок на депрессии микроскопии горкой в капле Tricaine.
- Orient личинки в боковом направлении для оптимальной визуализации хвостового области.
- Подсчет количества раковых клеток, которые успешно вторгшихся из сосудистую, сосредоточив внимание вверх и вниз через хвостовой области, чтобы четко различить интактные клетки.
Примечание: Лучше всего иметь по крайней мере двух лиц, участвующих в тего процесс, где человек забил рыбу слепа к экспериментальному состояния оценивается.- Оценка личинок на соединение флуоресцентного микроскопа с 10-кратным объективом. Используйте 20x цель для любых сложных вызовов.
5. Монтаж Эмбрионы на предметные стекла и последующей флуоресцентной томографии
- Растопите 1,5% раствор агарозы / Tricaine и доводят до 37 ° С.
- Обезболить эмбриона в образ, поместив его в Tricaine растворе.
- Перенос эмбриона в каплю Tricaine раствора к поверхности изображения. Необязательно использовать со стеклянным дном блюдо или стекло микроскопа.
- С помощью стеклянной пипетки для удаления избытка раствора Tricaine, сохраняя эмбриона на поверхности формирования изображения.
- Перекрытие одну каплю расплавленного раствора агарозы над эмбрионом.
- Быстро, прежде чем агароза полимеризуется, используйте тонкий инструмент, как ресницы кистью, чтобы ориентировать эмбриона в боковом направлении для формирования изображения, что дает дополнительный уходчтобы обеспечить эмбрион сплющивается вдоль поверхности изображения.
- Погрузитесь в настоящее время полимеризуется агарозы капли под Tricaine раствором.
- Тема живого эмбриона данио к микроскопической визуализации.
6. Модификация: инъекционное Раковые клетки в желтка из эмбрионов данио рерио
- Подготовка системы впрыска и пластин микроинъекции Разлить, как описано выше в разделе (3) данного протокола.
- Добавьте две клеточные популяции с контрастными флуоресцентные красители, как описано выше в разделе (2) этого протокола.
- Вводят 5 - 10 нл 2 х 10 ^ 7 клеток / мл в желтка. Держите постоянного объема инъекции, чтобы ввести одинаковые числа клеток (100 - 200 раковых клеток) от каждой клеточной популяции
Примечание: Можно использовать прозрачные эмбрионов данио, лишенные флуоресцентный сосудистую для этого анализа. Пассивный ввод частиц в сосудистую систему можно контролировать путем введения флуоресцентных бусин (<10 мкм) или, изменятьизначально, клеточная линия, которая не intravsate. - Восстановить инъекционные эмбрионов, как описано выше в разделе (3) этого протокола, а затем экран для успешных инъекций.
- Используйте стереоскоп для скрининга и переноса жизнеспособных эмбрионов, которые были успешно инъецируют новое блюдо.
Примечание: Все эмбрионы должны иметь последовательно размерный массу клеток, расположенных в желтке. Эмбрионы отброшены, если масса размер отличается или если какие-либо элементы расположены за пределами желтка. - Передача жизнеспособных эмбрионов на новое блюдо, если раковые клетки хорошо видны в желтка.
- Используйте стереоскоп для скрининга и переноса жизнеспособных эмбрионов, которые были успешно инъецируют новое блюдо.
- Инкубируйте блюдо при 33 ° С до готовности к скоринг, как правило, 24 - 48 ч.
Примечание: Эта температура определяется как компромисс между 37 ° C, оптимальная температура для раковых клеток, и 28,5 & deg; С, оптимальная температура для данио рерио. - Для того, чтобы забить intravasation, следуйте рекомендациям, описанным в разделе (4) этого протокола, но вместо того, чтобы подсчитать количество CКлетки ancer, которые успешно вторглись в сосудистую систему хвостового области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы тестировали сосудистую инвазивные способность часто используемых клеток рака молочной железы линий в данио модели эмбриона (рисунок 1). Строгие критерии были использованы в выигрыше экстравазации для этих различных клеточных линиях, где положительные события подсчитывались только тогда, когда раковые клетки были явно вырожденными, это делается главным образом для ограничения каких-либо ложных срабатываний, которые могут возникнуть в связи с тем самым увеличив счет клеточного мусора.
Наш анализ показал сильнейшие различия среди линий , когда инвазия оценивали 96 ч после инъекции в precardiac синусе (таблица 1). Из 7 клеточных линий испытываемых, данио эмбрионов , инъецированные клеточной линии MDA-MB-231 , выставлены наибольшее количество вырожденными раковых клеток в эмбрионе, один важный вывод, что согласуется с принятым метастатическим характером линии (рисунок 2). Мы также обнаружили, что BT-474 клетки охотно яnvaded в хвостовую область эмбрионов, в то время как другие клеточные линии, такие как MCF-7, SK-BR-3, Т-47D клетки, были минимально инвазивные (рисунок 3). Любопытное открытие было то, что примерно половина эмбрионов данио инъецированных клеток MDA-MB-468 был отек в области кардиального и они не были забиты. Как следствие этого, были отброшены несколько эмбрионов, которым инъецировали клетки MDA-MB-468, прежде чем мы нашли достаточно жизнеспособных образцов, которые могут быть подвергнуты количественному анализу транссудации. Несмотря на эти мнимые различия, следует отметить, что кровоизлияние произошло с каждой линии раковых клеток тестируемого.
В качестве модификации в анализе precardiac пазухи, мы провели конкурс эксперимент , по которому две популяции клеток MDA-MB-231 , которые отличаются по их способности сосудистой инвазивной 26 одновременно впрыскивается в желтка развивающихся эмбрионов. MDA-MB-231 клетки, распространяющиеся в условиях сливающийся культуры предшествующего уровнядля инъекций демонстрировали снижение intravasation в обращение , и поэтому имели уменьшенный присутствие в каудальной области эмбриона при скоринг (рис 4).
| Клеточная линия | Avg. # Излившейся клеток на Эмбрион | Ассортимент |
| MDA-MB-231 (субконфлюентные) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0,2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Таблица 1: Сравнение сосудистом инвазивным Способность рака молочной железы линий клеток в данио рерио , обычно используемых линий клеток рака молочной железы вводили в precardiac пазухи 2-дневных эмбрионов данио рерио и забили через 4 дня. Раковые клетки вторгшиеся из сосудистой и в хвостовую области были количественному в 10 эмбрионов на клеточной линии. Среднее число вырожденными раковых клеток показана наряду с диапазоном.
Рисунок 1. Визуальное Резюме Cell данио рака Экстравазационным анализа. В этом анализе, раковые клетки метили флуоресцентным красителем и вводили в precardiac пазухи 2-дневных эмбрионов данио рерио, чей васкулатура отмечен контрастным флуоресцентного репортера. После 2-х - 4-х дополнительных дней, раковые клетки, которые вторглись в хвостовую область зародышазабитых и может быть установлен в анестезирующего агарозном среде для последующей визуализации. Каждый шаг , изображенный на этой схеме соответствует части протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изображение Мозаика из данио эмбриона 4 дней после инъекции с MDA-MB-231 клеток. Светлое (А) и флуоресцентные (В) мозаик показано на рисунке. Флуоресцентные изображения отображаются в виде максимальной проекции г-стека, в котором зеленый цвет обозначает сосудистую сеть и красный цвет указывает на раковые клетки. Масштаб бар, 200 мкм. (C) Хвостовой область зародыша увеличивается , чтобы показать излившейся раковые клетки. Мелкоточечный флуоресцентным видно на величественнаяции. Шкала бар, 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Пример экспериментальных результатов. Здесь экстравазация демонстрируется в эмбрионе , инъецированных раковыми клетками BT-474 , но не в эмбрион вводят с MCF-7, SK BR-3-и Т-47D раковых клеток. Наконечники обозначают излившейся клетки. Масштаб бар, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Intravasation из MDA-MB-231 мобильных групп населения 2 дня афтер желтка для инъекций. (A) Желточный мешок с зеленым (инвазивный) и красный (менее инвазивные) помечены MDA-MB-231 клетки. (В) Хвостовой область с клетками MDA-MB-231 , которые вторглись в сосудистую сеть, чтобы достичь хвост обл. (C) число эмбрионов данио с intravasated клеток MDA-MB-231 в хвостовом регионе через 2 дня после инъекции 26. Шкала баров, 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод использует данио модель для эффективного тестирования сосудистую инвазивные способность раковых клеток (рисунок 1). Здесь мы применили технику к панели клеток рака молочной железы линии , с тем , чтобы обеспечить базовый уровень , на которую другие исследователи могут затем создавать свои собственные исследования (см таблицу 1; фиг.2 - 3). Наблюдение, что клетки MDA-MB-231 легко захвачена в хвостовую область эмбрионов данио бы сделать эту клеточную линию идеально подходят для проверки агентов, которые могут ингибировать васкулярной инвазии. Сравнительно менее инвазивные клеточные линии, такие как HCC1806 или MDA-MB-468 клеток, например, могут быть использованы для изучения факторов, которые бы в противном случае потенцируют васкулярной инвазии. Если эти типы экспериментов требуют включения препаратов, то имеет два различных маршрутов доставки, в зависимости от того, ожидается ли эффект лечения, чтобы быть прочным. Раковые клетки могут быть предварительно обработаны с лекарством перед инъекцией вэмбрионы или лекарственное средство может быть непосредственно добавлено к воде для дома эмбрионов, где она будет воздействовать на раковые клетки путем диффузии.
В нашем сравнении, мы проанализировали раковых клеток кровоизлияние в данио эмбрионов хвоста 96 ч после инъекции в precardiac пазухи. Для конкурентного анализа клеток MDA-MB-231, intravasation в обращение оценивали через 48 часов после инъекции желточного мешка. В моменты времени, выбранные для анализа, как правило, требуют оптимизации для каждой клеточной линии, где, для некоторых экспериментов, пик кровоизлияние может произойти только через 24 часа после инъекции. Стоит отметить , что данио эмбрионы имеют функциональную систему врожденного иммунитета , когда они вводили раковые клетки 27 и, следовательно, флуоресцентный мусор из раковых клеток , могут быть подтоплены иммунными клетками , такими как макрофаги или нейтрофилов. Поэтому активность врожденной иммунной системы потенциально может создать ложноположительных маркировку флуоресцентный при попытке набрать extravasatиона; внимание должно быть уделено только оценка клеток, которые энергично флуоресцирующие в соответствующем канале. Поскольку исследования тока рак вовлекая иммунную систему в усилении метастазирование рака 28, то модель данио эмбрион может обеспечить уникальный опыт и знания в эту область, позволяя для изучения перекрестных помех между произошедшим раковыми клетками и врожденной иммунной системы. Эта идея иллюстрируется на пару недавних исследований. Первое из этих исследований показали , что ингибирование VEGFR в данио усиливается способность нейтрофилов вызывать метастатическое поведение раковых клеток от 29. Второе исследование показало , что иммунная хемокина CXCR4-CXL12 ось сигнализации цела в данио, как рецептор на раковых клетках человека был способен зондирования и реагирования на данио лиганда 30, а также экспрессию CXCR4 в раковых клетках коррелирует с их инвазивной способности в животной модели. Кроме того, было показано, что данио макрофаги exhibiматери- ально хемотаксисный ответ по отношению к человеческому CXCL12. Данио штамм эмбрион с флуоресцентно меченных нейтрофилы 31, например, могут быть использованы для дальнейшего изучения раковых клеток взаимодействия с иммунной системой , в этой модели.
Несколько шагов в протоколе, требуют особого внимания. Во-первых, необходимо, чтобы раковые клетки диссоциировать в одной клеточной суспензии для того, чтобы предотвратить засорение иглы во время инъекции в эмбрионах. Клеточные агрегаты могут также блокировать поток крови и мешает способности раковых клеток путешествовать в хвостовую область, таким образом, искажая анализ. Клеточные агрегаты могут также вызвать кровеносных сосудов на разрыв, и если это происходит, тем самым увеличив счет инвазивную способность раковых клеток живых в этих регионах не является ни надежным и не рекомендуется. Еще одна потенциальная проблема области относится к маркировке раковых клеток с флуоресцентным красителем. В экспериментах, проводимых нашей лаборатории, мы обнаружили, что липофильные красители,как DiI, например, как правило, для получения наилучшего маркировки, пока ее уровень флуоресценции может варьироваться между клеточными линиями. По этой причине, флуоресцентное мечение раковых клеток должны быть оптимизированы перед инъекцией в эмбрионы, с тем, чтобы предотвратить чрезмерное маркировки. Крайне важно, чтобы избыток краситель вымывается из раковых клеток после того, как они были помечены, и это достигается за счет различных стадий центрифугирования, указанных в разделе маркировки протокола; эти шаги может показаться излишним, но они абсолютно необходимы. Слишком много флуоресцентный краситель может быть токсичным для клеток или утечки в кровь, создавая флюоресцентный фон об искусственной. Многие из этих проблем можно избежать с помощью использования раковых клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки, и рекомендуется, чтобы эти системы можно использовать вместо флуоресцентного красителя, когда это возможно. Наконец, когда забил эмбрионов для транссудации рака, крайне важно применять согласованные критерии для всех условий. Мы находим йпри вовлечении по крайней мере, два человека, на этапе подсчета очков помогает поддерживать научную строгость: один человек поручено подготовить слайды и записи результатов, в то время как другой человек делает экстравазационным приговор и хранится слеп к условию оценивается. Когда забил, можно либо количественно оценить излившейся раковых клеток в области хвоста или создавать бинарные критерии для простоты сравнения. Флуоресцентно крашения раковые клетки производит маркировку , которая точечный будет виден при очень большом увеличении (фиг.2с), хотя целые клетки легче различить при меньшем увеличении (рис 3), последний из которых рекомендуется для озвучивания. Судя по более неоднозначные случаи экстравазации может способствовать приобретению оптических срезов на конфокальной микроскопии, где кровоизлияние количественной оценки в процентах от всех клеток в хвостовой области могут контролировать неравные нагрузки раковых клеток в эмбрионе.
летЛ.К. САК инъекции маршрута отличается от precardiac пазухи, поскольку он позволяет большему числу клеток и, следовательно, лучше приспосабливает гетерогенности в популяции клеток. Как показано на фиг.4, несколько дифференцированно меченных клеточные популяции могут быть одновременно впрыскивают в желтка , чтобы сравнить их инвазивной способности и характер. Развитие кровеносных сосудов, способность клеток и инжектированных расширение набора кровеносных сосудов могут способствовать проникновению раковых клеток в хвостовой области, но этот аспект еще не анализировались. С технической точки зрения желтка инъекции легче выполнить, чем инъекции precardiac пазухи, хотя, с другой стороны, желточный мешок является богатой питательными веществами среды, которые могут препятствовать выходу раковых клеток. Также возможно, что инъекции вблизи кровеносных сосудов в желтке может преждевременно вводить раковые клетки в кровоток и, следовательно, необходимо тщательно экранировать для инъекций и неудачных опустить эти эмбрионы забросить его. И, наконец, важно, тO отметить, что желток микросреда является несколько искусственным, поскольку в нем отсутствует аналогичный первичный сайт у мышей или людей.
Различные модельные системы, которые стремятся предсказать метастазирования рака не без их преимуществ и недостатков, а также анализ данио экстравазация не является исключением. В качестве основных преимуществ, этот анализ позволяет оценить сосудистой инвазивной способности в пределах функциональной системы кровообращения и экспериментальные вопросы можно ответить после того, как всего за несколько дней. С учетом быстрого оборотное время, такая система может быть использована, чтобы исследовать агрессивное поведение не только установленных клеточных линий, но и свежевыделенные образцы от больных раком человека. Основным недостатком является то, что эта модель не включает самые ранние и последние события метастатического каскада, сосредоточившись исключительно на васкулярной инвазии. Кроме того, раковые клетки человека вводят в этих эмбрионов данио, очевидно, не работает в среде сингенных и некоторые взаимодействия с тон стромы может, следовательно, быть потеряны. Несмотря на эти ограничения, данио модель эмбриона имеет достойное место как в фундаментальных и трансляционных исследований рака, как мы использовали это показывают роль Бегемота сигнального пути 26 и кератин-ассоциированный белок 5-5 32 в сосудистом инвазивной способности рака клетки. Следовательно, эта модель имеет потенциал, чтобы помочь исследование ключевого метастатическим отличительной чертой поздних стадий рака стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
