Summary
Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.
Introduction
Metastatische Erkrankung ist eine Hauptursache der Krebssterblichkeit und viele Mechanismen, die Krebszelle ermöglichen Verbreitung bleiben bis 1 entdeckt werden. Um für eine Krebszelle, um erfolgreich zu metastasieren, muss er zunächst durch das Stroma eindringen, die eine primäre Tumor umgibt, geben Sie (intravasate) in das Kreislaufsystem, überleben auf der Durchreise, Ausfahrt (extravasate) aus dem Kreislauf und schließlich eine tragfähige Kolonie gründen am entfernten Organstelle 2. Intravasation und Extravasation sind somit entscheidende Schritte in der metastatischen Kaskade, doch jeder Krebszelle ist nicht von Natur geschickt darin zu stören und die Migration durch endotheliale Kreuzungen 3. In der Tat gibt es eine Reihe von einzigartigen Selektionsdruck , die Krebszellen vaskuläre Invasion und der Prozess umgeben kann weiterhin durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Faktoren 4 beeinflusst werden. Aus diesen Gründen Techniken, die das aggressive Verhalten von fortgeschrittenen Stadium Krebs Sonde konzentrieren sich häufig auf vascular invasive Fähigkeit als Mittel Metastasierung zu prognostizieren.
Verschiedene Modellsysteme existieren , um die Untersuchung von Krebszellen Gefäßinvasion in vitro zu erleichtern. Die am häufigsten verwendete in vitro Assays beinhalten entweder Transwell - Systemen Krebszellmigration durch eine endotheliale Schranke 5 oder Elektro Zell-Substrat - Impedance Sensing (ECIS) Technologie zur Überwachung des Echtzeit - Unterbrechung einer intakten endothelialen Monoschicht durch Krebszellen 6 zu bewerten. Diese Tests fehlt typischerweise die Fluiddynamik und Stroma-Faktoren, die sonst Krebszellbindung an eine Endothelwand auswirken würde. Dieses Problem wird etwas von perfundierbaren Gefäßnetze umgangen , die aus dem 3D - Kultur von Endothel entstehen mit Stromazellen zu unterstützen und diese 3D - Mikrofluidik - Systeme nun die Spitze der aktuellen In - vitro - Optionen 7,8 darstellen. Dennoch auslassen diese Ansätze die robuste Mikro eines funktionellen Kreislaufsystemund daher nur teilweise Ersatz für die in vivo - Modellen.
Die am häufigsten in - vivo - Modell von Gefäßinvasion verwendet wird , ist die Maus, bei der experimentellen Metastasierung Assays häufig durchgeführt werden , weil sie auf relativ kurze Zeiträume und sind in der Regel bezeichnend für Metastasierungsfähigkeit 9 auftreten. Diese Tests umfassen die direkte Injektion von Krebszellen in den Verkehr und damit die Endstadien der Metastasierung zu modellieren, nämlich Extravasation und Krebszellbesiedelung von Organen. Die experimentellen Metastasierung Assays unterscheiden sich an der Stelle der Krebszellinjektion basiert und die Organe schließlich analysiert. Im ersten Assay - Typ, Krebszellen in die Schwanzvene von Mäusen und Krebszellaussaat in der Lunge injiziert werden , wird 10,11 überwacht. Der zweite Test beinhaltet die Durchführung intrakardiale Injektionen metastatic seeding in Richtung auf die Knochenmikro 12-14, sondern auch das Gehirn 15 zu lenken. In dem dritten Test, Krebs cells werden in die Milz injiziert , um Besiedlung der Leber 16 zu ermöglichen , während die vierte Lieferroute in die Arteria carotis Krebszellen zum Gehirn 17,18 trägt. Unabhängig von der Krebszelle Liefermethode, Organ Kolonisation ist die akzeptierte experimentellen Endpunkt und wird in der Regel über Lumineszenz, Histologie bestimmt, oder PCR-basierte Techniken. Trotz der physiologischen Vorteile von innerhalb eines murinen Wirt experimentellen Metastasierung Assays Durchführung dieser Experimente erfordern noch Wochen bis Monate abzuschließen und zu analysieren.
Der Zebrafisch (Danio rerio) -Modell hat sich kürzlich als neuer Systemkrebsprogression 19,20, zu untersuchen und ermöglicht die Beurteilung von Krebszellen vaskuläre Invasion innerhalb eines Funktionskreislauf über einen viel kürzeren Zeitskala als bei Mäusen im Vergleich 21-24. Das Verfahren nutzt einen transparenten Zebrabärbling-Stamm, der seine Endothel mit einem grünen Riffkoralle Fluo markiertrescent Protein Reporter durch die kdrl Promotor, der Zebrabärbling Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 25 angetrieben. In dem Test werden die Krebszellen mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Embryonen injiziert. Irgendwo zwischen 48 bis 96 Stunden nach der Injektion von Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem und in die Schwanzvene Region von Embryonen eingedrungen sind effizient auf einem Fluoreszenzmikroskop erzielt. Hier wir die Technik zu einer Gruppe von üblicherweise verwendeten humanen Brustkrebszelllinien gelten für stark Unterschiede in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass für den Embryo yolk sac die Injektionsstelle zu ändern für die Untersuchung der heterogenen Zell-Interaktionen ermöglicht, als Krebszellpopulationen differentiell mit Fluoreszenzfarbstoffen und injiziert in Zebrabärbling-Embryonen fehlt Fluoreszenz Vaskulatur markiert werden. In diesem letzteren Test, Krebszellen, die das Eigelb eingedrungen sind und intravasated in die vasculature werden im kaudalen Bereich von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion erzielt. Aufgrund der Effektivität und Komfort dieses Modells sind Zebrabärbling zunehmend die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen unter einer physiologischen Umgebung, um schnell zu testen eingesetzt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethik-Statement: Zebrabärbling-Embryonen erzeugt wurden nach einer genehmigten IACUC Protokoll. Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Georgetown University Animal Care und Use Committee durchgeführt.
1. Organisieren Embryonen für Injection und erstellen Stammlösungen
- Generieren erforderlichen Zebrabärblingembryonen zur Krebszelle Gefäßinvasion beurteilen.
- Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Fisch.
HINWEIS: Wir erzeugten Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Zebrabärbling, durch Tg Kreuzung (kdrl: grcfp) zn1 25, die in Endothelzellen grün Riffkoralle fluoreszierende Protein exprimieren, mit einer Linie , die Pigmentzellen fehlt, mitfa b692; ednrb1 b140 am Zebrabärbling international Resource - Center entwickelt. - Collect Eier, sauber und entfernen unfertilized oder deformierte Embryonen am nächsten Tag 22.
- Inkubieren Embryonen bei 28,5 ° C, bis sie bereit zur Injektion mit Krebszellen, zu kommen, wenn die Genaktivität 2-Tage nach der Befruchtung (2 dpf) sind.
- Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Fisch.
- Machen Injektion Platten.
- Melt 25 ml 1,5% Agarose in dH 2 O für jede Platte.
- Gießen Sie 12 ml der Agarose in eine 100 mm x 15 mm Petrischale und lassen Sie es aushärten.
- Re-Schmelze dann gießen Sie die verbleibenden Agarose in der Platte.
- Position unmittelbar einen Schnitt Glasform (3 mm x 7,2 cm breit x 7,5 cm lang), so dass es in einem 30 Grad Winkel zur Agarose und positioniert in der Mitte der Platte ist.
Hinweis: das wird eine steile 60 ° Wand und eine 30 ° geneigte Rampe erstellen. - Kleben Sie die Glasform an Ort und Stelle und lassen Sie die Agarose hart werden.
- Sie vorsichtig die Glasform entfernen und darauf achten, nicht die Agarose zu reißen.
HINWEIS: Formen können in dH 2 O bei 4 ° C gelagert werden.
- Äquilibrieren Injektionsplatte mit Fischwasser (0,3 g / l Meersalz).
- Rinse Platte zweimal mit destilliertem Wasser.
- Äquilibrieren Platte durch Zugabe von 10 ml Fischwasser an der Platte und auf Schüttler für 10 min.
- Äquilibrieren Platte ein zweites Mal mit Fischwasser.
- Split 2-Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen in Injektionsgruppen , indem sie in Gerichte zu übertragen Fischwasser enthält 22.
- Bereiten Sie Erholung Gerichte für jede Gruppe nach der Injektion zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Erholung Schale enthält 10 ml Fischwasser plus Penicillin (25 ug / ml) und Streptomycin (50 ug / ml).
- Bereiten 2x Tricaine Lösung durch Zugabe von 4 ml der gepufferten Tricaine Lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) und 50 ml Fisch Wasser plus Penicillin und Streptomycin.
- Man löst 15 mg mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 10 ml 2x Tricaine Lösung eine Montage Anästhetikum Medium zu erzeugen, die Live-Embryonen für die imagin immobilisieren wirdG.
HINWEIS: Montagemedium besteht aus 1,5% Agarose. - Ziehen Mikroinjektionsnadeln.
- Legen Sie Glaskapillarröhren in einer vertikalen Pipette Puller. Ziehen Sie lange verjüngte Pipetten mit 20 mA Strom und eine 2-Spule Heizelement.
2. Markierung Krebszellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff
- Pflegen Krebszellen in ihrer empfohlenen Kulturbedingungen.
ANMERKUNG: Diese Linien wurden in DMEM gehalten + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 und SK-BR-3. Diese Linien wurden in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 und T-47D. Alle Zelllinien wurden bei 37 o C und 5% CO 2 während der Inkubation gehalten. - Generieren Sie eine Einzelzellsuspension durch eine haftende Kultur von Krebszellen distanziert.
- Waschen Sie die Zellen zuerst mit PBS und dann mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung zu behandeln.
HINWEIS: Trypsin Belichtungszeit auf der Zelllinie ab. - Neutralisieren Sie die Trypsin-Lösung mit sichRum-haltigen Zellkulturmedien, nachdem die Zellen zu lösen.
- Waschen Sie die Zellen zuerst mit PBS und dann mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung zu behandeln.
- Zentrifugieren Sie die Trypsin-neutralisierten Zellsuspension für 5 Minuten bei 200 · g, dann Zellpellet in frischem Kulturmedien für die Zellzählung.
- Zählen der Zellsuspension unter Verwendung eines automatischen Zählers und bereiten 1 Million Zellen in 200 ul Zellkulturmedien.
- Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss vor der Injektion in Zebrafischembryonen.
ANMERKUNG: Nur tragfähige sollten die Zellpopulationen in Zebrafischembryonen, als Injektion von toten Zellen reflektieren nicht wahr Gefäßinvasion injiziert werden.
- Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss vor der Injektion in Zebrafischembryonen.
- In 2 ul roten lipophilen Farbstoffs an die Krebszellsuspension für eine 1: 100 Verdünnung, gut mischen und brüten dann die Mischung bei 37 ° C für 20 min.
HINWEIS: Die Konzentration des Farbstoffes und Kennzeichnungszeit benötigen für jede Zelllinie optimiert werden. - Nach der Inkubation mit 1 ml frischem Medium mit dem Rohr und dann 5 min zentrifugieren200 x g.
- Waschen Restfluoreszenzfarbstoff aus den Krebszellen entfernt.
- Aspirat der Überstand vom Zellpellet, das Pellet in 1 ml frischem Kulturmedium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
- Wiederholen der Waschschritt ein zweites Mal: absaugen Überstand, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
- Wiederholen Sie den Waschschritt dritten Mal: den Überstand aspirieren, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
- Den Überstand aspirieren und Zellpellet enthält 1 Million markierten Krebszellen in 500 & mgr; l frisches Medium.
HINWEIS: 0,5 mM EDTA können in den Medien zugesetzt werden, um Zell Verklumpung zu verhindern.
3. Injecting Krebszellen in die Pre-Herz-Sinus von Zebrafischembryonen
- Bringen Mikroinjektionsabgabesystem mit einer Druckluftquelle und schalten Sie the Mikroinjektionsquelle Abgabesystem Leistung.
- Prüfdruck durch das Fußpedal drücken. Ein kurzer Impuls der Luft sollte aus dem Nadelhalter emittieren.
- Äquilibrieren der Injektions Platten zweimal mit 2x Tricaine Lösung.
- Für jeden Equilibrierungsschritt, fügen Sie 20 ml 2x Tricaine Lösung für die Einspritzplatte und auf Schüttler für 10 min.
- Verwenden Sie Plastikpipette eine Gruppe von Embryonen in eine kleine Schüssel zu übertragen, die 2x Tricaine Lösung enthält.
- Verfüllen die Mikroinjektion Injektionsnadel mit Krebszellen unter Verwendung eines Gel-Ladepipettenspitze.
- Legen Sie die Nadel in einem Elektrodenvorratsglas mit dem spitzen Ende nach unten, so Zellen in der Nähe der Spitze absetzen.
- Transfer 20 - 30 narkotisierten Embryonen mit einer Injektionsplatte durch die Embryonen mit viel 2x Tricaine in einer Plastikpipette zu sammeln.
- Lassen Embryonen in der Spitze der Pipette zu begleichen.
- Gently Embryonen in den Trog der Injektionsplatte zu vertreiben, um die Embryonen entlang der Länge der Rinne zu verbreiten.
- Richten Embryonen mit Köpfen nach oben und Bäuche der steilen Wand des Troges gegenüber.
HINWEIS: Tricaine Lösung sollte sowohl die Troglänge und die flache Agarose Oberfläche bedecken, mit Embryonen nur in der Mulde befinden. Die Embryonen sind jetzt bereit für die Injektion.
- Injizieren von 50 bis 100 Krebszellen (2 bis 5 nl) in den precardiac Sinus der Genaktivität das Mikroinjektionsabgabesystem.
- Bringen Sie die Nadel in den Nadelhalter eines Mikromanipulators.
- Positionieren Sie die Injektionsplatte unter dem Stereoskop mit der 60-Grad-Wand auf der linken Seite und konzentrieren sich auf die Top-Embryo bei 25x Vergrößerung.
- Positionieren Sie den Mikromanipulator, so dass, wenn verlängert, wird die Nadel auf den Embryo durchdringen.
- Ziehen Sie die Nadel durch das Auge, bis es fast ist der Embryo zu berühren.
- Ein Blick unter dem Mikroskop, richten die Nadel so tHut wird es den Embryo auf weitere Verlängerung durchdringen.
- Pierce der Embryo durch den Dottersack Plazieren der Spitze nur an, aber nicht in die vorgeHerzHöhle.
- Injizieren Sie die Zellen durch das Fußpedal drücken. Die Kraft des Injektions ausstößt, die Zellen in das Herzhöhle. Ziehen Sie die Nadel.
- Mit der rechten Hand, zu erweitern und die Injektionsnadel zurückzuziehen. Mit der linken Hand, Feineinstellungen nächsten Embryo zu positionieren.
- Bringen Sie die Nadel in das Gefäß Elektrode Lagerung beim Einrichten auf eine andere Platte zu injizieren.
- Übertragen Sie die Embryonen in die Recovery-Schale einmal die gesamte Platte eingespritzt wird.
- Kippen Sie die Einspritzplatte, die Embryonen am Boden zu bündeln, Waschen alle verbleibenden Embryonen aus dem Trog, und sie mit der Plastikpipette zu sammeln.
- Lassen Sie die Embryonen in den Boden der Pipette zu begleichen.
- Transfer der Embryonen auf das Rückgewinnungsschale in einem minimalen Volumen von Tricaine.
- Incubate Erholung Schale bei 28 ° C für 1 Stunde.
- Separate tragfähige Genaktivität von toten Embryonen und andere Verunreinigungen.
- Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 96 Stunden.
ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling.
4. Wertung Extravasation
- Anesthetize die Charge von Embryonen, indem sie in eine Schüssel mit Tricaine Lösung erzielt werden.
- Legen Sie eine narkotisiert Larven auf eine Depression Mikroskopie Folie in einem Tropfen Tricaine.
- Orient Larven seitlich für eine optimale Abbildung der Schwanzregion.
- Zähle die Anzahl der Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem erfolgreich eingedrungen sind von oben und unten durch den Heckbereich konzentriert klar intakten Zellen erkennen.
HINWEIS: Es ist am besten mindestens zwei Personen in t beteiligt zu haben,seinen Prozess, in dem die einzelnen Fische Scoring auf der experimentellen Bedingung ist blind geprüft.- Score Larven auf einer Verbindung Fluoreszenzmikroskop mit dem 10x-Objektiv. Verwenden Sie das 20x-Objektiv für alle schwierig Anrufe.
5. Montage Embryonen auf Folien und anschließende Fluorescence Imaging
- Schmelze 1,5% Agarose / Tricaine Lösung und bringen auf 37 ° C.
- Anesthetize den Embryo, indem Sie es in Tricaine Lösung abgebildet werden.
- Transfer des Embryos in einem Tropfen Tricaine Lösung auf die Abbildungsfläche. verwenden Sie wahlweise eine Glasbodenschale oder Mikroskop-Objektträger.
- Verwenden einer Glaspipette das überschüssige Tricaine Lösung, Halten der Embryo auf der Abbildungsfläche zu entfernen.
- Overlay ein Tropfen geschmolzenen Agarose-Lösung über den Embryo.
- Schnell, bevor die Agarose polymerisieren, verwenden Sie ein empfindliches Werkzeug, wie ein Wimpernbürste, um den Embryo seitlich zur Bildgebung zu orientieren, besonders vorsichtig zu gebenden Embryo zu gewährleisten ist entlang der Abbildungsfläche abgeflacht.
- Tauchen Sie die jetzt polymerisiert Agarose Tropfen unter Tricaine Lösung.
- Thema der Live-Zebrafischembryo auf mikroskopische Bildgebung.
6. Änderung: Die Einspeisung von Krebszellen in den Dottersack von Zebrafischembryonen
- Herstellung der Mikroinjektionsabgabesystem und die Einspritzplatten, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls.
- Etikett zwei Zellpopulationen mit kontrasFluoreszenzFarbstoffen, wie vorstehend in Abschnitt (2) dieses Protokolls.
- Injizieren von 5 bis 10 nl von 2 x 10 ^ 7 Zellen / ml in den Dottersack. Halten Sie das Injektionsvolumen konstant gleiche Zellzahlen zu injizieren (100-200 Krebszellen) aus jeder Zellpopulation
HINWEIS: Eine transparente Genaktivität verwenden können fluoreszierende Gefäße für diesen Test fehlt. Passive Eindringen von Partikeln in das Gefäßsystem kann für Perlen durch Injizieren fluoreszierendes gesteuert werden (<10 um) oder verändernnativ, eine Zelllinie, die nicht intravsate. - Recover die injizierten Embryonen, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls und dann Screening für eine erfolgreiche Injektionen.
- Verwenden Sie ein Stereoskop zu screenen und tragfähige Embryonen übertragen, die erfolgreich auf eine neue Schale injiziert wurden.
HINWEIS: Alle Embryonen eine gleich bleibend bemessen Masse von Zellen in dem Eigelb entfernt haben sollte. Die Embryonen werden verworfen, wenn die Masse Größe unterscheidet, oder wenn alle Zellen außerhalb des Eigelbs befinden. - Übertragen Sie die tragfähige Embryonen auf ein neues Gericht, wenn Krebszellen in den Dottersack deutlich zu erkennen.
- Verwenden Sie ein Stereoskop zu screenen und tragfähige Embryonen übertragen, die erfolgreich auf eine neue Schale injiziert wurden.
- Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 48 Stunden.
ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling. - Um zu punkten intravasation, befolgen Sie die im Abschnitt Richtlinien (4) dieses Protokoll, sondern die Anzahl der c zählenancer Zellen, die in das Gefäßsystem des kaudalen Region erfolgreich eingedrungen sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier testeten wir die vaskuläre invasive Fähigkeit von häufig verwendeten Brustkrebszelllinien in einem Zebrafischembryo - Modell (Abbildung 1). Rigorose Kriterien wurden in Scoring-Extravasation für diese verschiedenen Zelllinien eingesetzt werden, wo positive Ereignisse nur dann, wenn die Krebszellen gezählt wurden deutlich extravasierten hatte, dieses Wesen hauptsächlich getan keine Falsch-Positiven zu begrenzen, die von Scoring Zelltrümmer entstehen könnten.
Unsere Analyse ergab , krassen Unterschiede zwischen den Linien , wenn Invasion 96 Stunden nach der Injektion in die precardiac Sinus (Tabelle 1) bewertet. Von den 7 - Zelllinien getestet, Zebrabärbling mit dem MDA-MB-231 Zelllinie injizierten Embryonen zeigten die größte Anzahl von extravasated Krebszellen pro Embryo, ein Befund, der mit dem akzeptierten metastasierendem Art der Linie (Abbildung 2) im Einklang steht. Wir fanden auch, dass BT-474-Zellen leicht invaded in den kaudalen Bereich der Embryonen, während andere Zelllinien, wie MCF-7, SK-BR-3 und T-47D - Zellen, minimal invasive waren (Abbildung 3). Eine kuriose Entdeckung war, dass etwa die Hälfte der Zebrabärbling mit den MDA-MB-468-Zellen Ödem in der kardialen Region injizierten Embryonen hatten, und diese wurden nicht erzielt. Als Folge wurden verworfen eine Anzahl von Embryonen mit MDA-MB-468-Zellen injiziert, bevor wir genügend lebensfähige Proben gefunden, die für die Extravasation quantifiziert werden konnte. Trotz dieser scheinbaren Unterschiede ist es bemerkenswert, dass Extravasation mit jeder Krebszelllinie aufgetreten getestet.
Als eine Modifikation der precardiac sinus Assay führten wir eine Konkurrenzexperiment wobei zwei Populationen von MDA-MB-231 - Zellen , die 26 in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit unterscheiden , wurden gleichzeitig in den Dottersack der sich entwickelnden Embryonen injiziert. MDA-MB-231-Zellen vermehrt unter konfluenten Kulturbedingungen voreine Verringerung in intravasation in den Kreislauf zur Injektion aufwies und daher eine reduzierte Präsenz im kaudalen Bereich der Embryonen auf scoring (Abbildung 4).
| Zelllinie | Durchschn. # Extravasierten Zellen pro Embryo | Angebot |
| MDA-MB-231 (Subkonfluierende) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0,2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Tabelle 1: Vergleich der invasiven Gefäß Fähigkeit von Häufig in Zebrabärbling Brustkrebs-Zelllinien Brustkrebs-Zelllinien injiziert von 2 Tage alten Zebrafischembryonen in die precardiac Sinus wurden verwendet , und erzielte 4 Tage später. Krebszellen aus dem Gefäßsystem und in den kaudalen Bereich eindringenden wurden in 10 Embryonen pro Zelllinie quantitativ bestimmt. Die durchschnittliche Anzahl der extravasated Krebszellen wird zusammen mit dem angegebenen Bereich.
Abbildung 1. Visuelle Zusammenfassung der Zebrabärbling Cancer Cell Extravasation Assay. In diesem Test Krebszellen werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Zebrafischembryonen injiziert, deren Gefäße durch eine kontrastier fluoreszierenden Reporter markiert ist. Nach 2 bis 4 weitere Tage, Krebszellen, die in den kaudalen Bereich des Embryos eingedrungen sinderzielt und können für nachfolgende Bildgebung in ein Anästhetikum Agarosenährmedium montiert werden. Jeder Schritt in diesem Schema entspricht einem Abschnitt des Protokolls dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bildmosaik eines Zebrafischembryo 4 Tage nach der Injektion mit MDA-MB-231 - Zellen. Hellfeld- (A) und Fluoreszenz (B) Mosaiken gezeigt. Fluoreszenzbilder werden als maximale Projektion eines z-Stapel dargestellt ist, in dem eine grüne Farbe, die Krebszellen des Gefßsystems und eine rote Farbe zeigt bezeichnet. Maßstabsbalken, 200 & mgr; m. (C) kaudalen Bereich des Embryos wird vergrößert extravasated Krebszellen zu zeigen. Punktförmige Fluoreszenzmarkierung wird auf magnifica gesehention. Maßstabsbalken, 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Beispiel für experimentelle Ergebnisse. Hier wird eine Extravasation in einem Embryo injiziert mit BT-474 Krebszellen , aber nicht in einem Embryo mit MCF-7, SK-BR-3 und T-47D Krebszellen injiziert demonstriert. Pfeilspitzen bezeichnen extravasated Zellen. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Intravasation von MDA-MB-231 Zellpopulationen 2 Tage after Yolk Sac Injection. (A) Dottersack mit grünen (invasiv) und rot (weniger invasive) markiert MDA-MB-231 - Zellen. (B) Die Schwanz Region mit MDA-MB-231 - Zellen, die die Blutgefäße eingedrungen den Schwanz zu erreichen Region. (C) die Zahl der Genaktivität mit intravasated MDA-MB-231 - Zellen in der Schwanzbereich 2 Tage nach der Injektion 26. Maßstabsbalken, 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diese Technik nutzt die Zebrabärbling Modell zur effizienten Steuerung des Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen (siehe Abbildung 1). Hier verwendeten wir die Technik zu einer Gruppe von Brustkrebszelllinien , um eine Basislinie zu schaffen , auf die andere Forscher können dann ihre eigenen Studien bauen (siehe Tabelle 1; Figuren 2 - 3). Die Beobachtung, dass MDA-MB-231-Zellen leicht in die Schwanzregion Genaktivität fallen würde diese Zelllinie ideal machen für Agenten zu testen, die Gefäßinvasion hemmen könnten. Vergleichsweise weniger invasive Zelllinien, wie HCC1806 oder MDA-MB-468-Zellen könnte beispielsweise verwendet werden, Faktoren zu untersuchen, die sonst vaskuläre Invasion potenzieren würde. Wenn diese Arten von Experimenten, die Aufnahme von Medikamenten erfordern, dann hat man zwei verschiedene Verabreichungswege, je nachdem, ob der Behandlungseffekt zu erwarten ist langlebig. Krebszellen können mit dem Medikament vor der Injektion vorbehandelt werden, indie Embryonen oder das Arzneimittel direkt an die Wasser Gehäuse der Embryonen gegeben werden, wo sie die Krebszellen durch Diffusion auswirken.
In unserem Vergleich haben wir analysiert, Krebszelle Extravasation im Zebrafischembryo Schwanz 96 h nach Injektion in den precardiac Sinus. Für die MDA-MB-231 Zell Kompetitionsassay, intravasation in Zirkulation wurde 48 Stunden nach der Injektion beurteilt Dottersack. Die Zeitpunkte für die Analyse ausgewählt, erfordern typischerweise die Optimierung für jede Zelllinie, wo bei einigen Experimenten peak Extravasation von 24 h nach der Injektion auftreten können. Es ist erwähnenswert , dass die Genaktivität eine funktionelle angeborene Immunsystem haben , wenn sie mit Krebszellen injiziert werden , 27 und damit Fluoreszenz Schmutz von den Krebszellen können durch Immunzellen , wie Makrophagen oder Neutrophilen verschlungen werden. Die Aktivität des angeborenen Immunsystems kann daher möglicherweise falsch-positive Markierung Fluoreszenz erzeugen, wenn extravasat punkten versuchtIon; Pflege muss nur punkten Zellen gegeben werden, die robust in den entsprechenden Kanal fluoreszieren. Da aktuelle Krebsforschung ist bei der Verbesserung der Krebsmetastasierung 28 das Immunsystem Verwicklung, die Zebrafischembryo Modell zur Untersuchung des Übersprechens , indem sie einzigartige Einblicke in diesem Bereich zur Verfügung stellen kann zwischen Krebszellen und das angeborene Immunsystem auftritt. Diese Idee wird durch ein Paar von jüngsten Studien veranschaulicht. Die erste dieser Studien zeigten , dass VEGFR - Hemmung in Zebrabärbling die Fähigkeit von Neutrophilen verbesserte metastatischen Verhalten zu entlocken von Krebszellen 29. Eine zweite Studie zeigte , dass die CXCR4-CXL12 immune Chemokinsignalisierung Achse innerhalb Zebrabärbling intakt ist, wie der Rezeptor auf menschlichen Krebszellen, die Erfassungs war und 30, auf die Zebrabärbling Liganden reagiert , und die Expression von CXCR4 in Krebszellen mit ihren invasive Fähigkeit korreliert im Tiermodell. Darüber hinaus war es, dass Zebrabärbling Makrophagen exhibi demonstriertted eine chemotaktische Reaktion auf menschliches CXCL12. Ein Zebrafischembryo Stamm mit fluoreszierend markierten Neutrophile 31, beispielsweise könnte weiter verwendet werden , um Krebs Zell - Interaktionen mit dem Immunsystem in diesem Modell erkunden.
Ein paar Schritte in dem Protokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens ist es wichtig, dass die Krebszellen in eine Einzelzellsuspension, um die Nadel während der Injektion in die Embryonen zu verhindern dissoziiert werden verstopfen. Zellaggregaten kann auch den Blutfluss blockieren und die Fähigkeit der Krebszellen stören in den kaudalen Bereich zu reisen, wodurch die Analyse Verkanten. Cellular Aggregate können auch Blutgefäße platzen und, wenn dies der Fall ist, erzielte die invasive Fähigkeit von lebenden Krebszellen in diesen Regionen weder zuverlässig noch empfohlen induzieren. Ein weiteres potentielles Problem Gebiet betrifft die Krebszellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff zu Etikettieren. In Experimenten, die von unserem Labor ausgeführt, haben wir, dass lipophile Farbstoffe gefunden,wie Dil zum Beispiel neigen dazu, die beste Kennzeichnung, noch seine Fluoreszenz Ebene zwischen Zelllinien zu erzeugen, variieren. Aus diesem Grund sollte die Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen optimiert werden vor der Injektion in den Embryonen um eine Über Kennzeichnung zu verhindern. Es ist wichtig, dass der überschüssige Farbstoff entfernt von den Krebszellen gewaschen wird, nachdem sie markiert worden sind, und dies wird durch die verschiedenen Zentrifugationsschritte angegeben in dem Kennzeichnungsteil des Protokolls erreicht; Diese Schritte können überflüssig erscheinen, aber sie sind absolut notwendig. Zu viel Fluoreszenzfarbstoff kann für Zellen toxisch sein oder in den Blutstrom austreten, eine artifizielle fluoreszierenden Hintergrund zu erzeugen. Viele dieser Probleme können durch die Verwendung von Krebszellen exprimieren fluoreszierende Proteine umgangen werden, und es wird empfohlen, dass diese Systeme anstelle von Fluoreszenzfarbstoff, wenn möglich, verwendet werden. Schließlich, wenn die Embryonen für Krebs Extravasation Scoring ist es zwingend notwendig, einheitliche Kriterien für alle Bedingungen gelten. Wir finden thbei mindestens zwei Personen in der Scoring-Schritt, der eine hilft wissenschaftliche Strenge halten: ein Individuum mit der Herstellung der Folien und die Aufzeichnung der Ergebnisse beauftragt ist, während die andere Person das Urteil Extravasation macht und ist blind für die Zustand gehalten ausgewertet. Wenn scoring kann entweder extravasated Krebszellen im Schwanzbereich Quantifizieren oder binärer Kriterien schaffen zur Erleichterung des Vergleichs. Fluoreszenz die Krebszellen Färben punctate Kennzeichnung erzeugt , die bei sehr hoher Vergrßerung (Abbildung 2c) sichtbar ist, wenn ganze Zellen sind leichter bei niedrigeren Vergrßerung (Abbildung 3) zu erkennen, von denen die letztere für scoring empfohlen. Beurteilen mehrdeutiger Fälle von Extravasation kann durch den Erwerb von optischen Scheiben auf einem konfokalen Mikroskop unterstützt werden, wobei das Quantifizieren Extravasation als Prozentsatz aller Zellen im Schwanzbereich für ungleiche Belastung von Krebszellen in den Embryo steuern.
Die yolk sac Injektionsweg unterscheidet sich von der precardiac sinus, wie es für eine höhere Anzahl von Zellen ermöglicht und daher besser nimmt die Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation. Wie in 4 gezeigt ist , können mehrere differentiell markierten Zellpopulationen gleichzeitig in den Dottersack injiziert werden , um ihre Fähigkeit , invasive und Muster zu vergleichen. Die angiogene Fähigkeit von injizierten Zellen und verstärkte Rekrutierung von Blutgefäßen können Krebszellen Eintritt in den Heckbereich erleichtern, aber dieser Aspekt analysiert wurde noch nicht. Technisch yolk sac Injektionen sind einfacher durchzuführen ist als eine precardiac sinus Injektions aber auf der anderen Seite der Dottersack ist eine nährstoffreiche Umgebung, die den Ausgang von Krebszellen hemmen kann. Es ist auch möglich, dass die Injektion in der Nähe von Blutgefäßen im Dotter vorzeitig Krebszellen in den Kreislauf einführen kann, und daher muss man sorgfältig für verpfuschte Injektionen screenen und diese Embryonen aus Scoring weglassen. Schließlich ist es wichtig, to beachten Sie, dass das Eigelb Mikro etwas künstlich ist, da es einen analogen primären Standort in Mäusen oder Menschen fehlt.
Die verschiedenen Modellsystemen, die zur Vorhersage von Krebsmetastasen zu suchen sind nicht ohne ihre Vor- und Nachteile, und der Zebrabärbling Extravasation Test ist keine Ausnahme. Als großer Vorteil, erlaubt dieser Test für die Beurteilung der Gefäß invasive Fähigkeit innerhalb eines Funktionskreislauf-System und experimentelle Fragestellungen können nach nur wenigen Tagen beantwortet werden. Gegeben könnte die schnelle Durchlaufzeit, ein solches System verwendet werden, um das aggressive Verhalten der nicht nur etablierten Zelllinien zu untersuchen, sondern auch frisch isolierte Proben von menschlichen Krebspatienten. Der größte Nachteil ist, dass dieses Modell ausschließlich auf Gefäßinvasion durch Fokussierung der frühesten und spätesten Ereignisse der metastatischen Kaskade auslässt. Außerdem sind die menschlichen Krebszellen in diesen Zebrafischembryos injiziert offensichtlich nicht mit t in einem syngenen milieu und einige Zusammenspiel Betriebser Stroma folglich verloren gehen. Trotz dieser Einschränkungen hat das Zebrafischembryo Modell einen verdienten Platz in der Grundlagen- und translationalen Krebsforschung, wie wir es eine Rolle für den Hippo zeigen beschäftigt haben Signalweg 26 und Keratin-assoziierten Protein 5-5 32 in der Gefäß invasiven Fähigkeit von Krebs Zellen. Daher hat dieses Modell das Potenzial, die Untersuchung eines Schlüssels metastasierendem Kennzeichen fortgeschrittenen Stadium Krebs zu unterstützen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
