Summary
Denna metod använder zebrafisk embryon för att effektivt testa den vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller. Fluorescerande cancerceller injiceras i prekardiellt sinus eller gulesäcken utvecklings embryon. Cancercell vaskulär invasion och extravasering bedöms via fluorescensmikroskopi av svansregionen 24-96 timmar senare.
Introduction
Metastatisk sjukdom är en viktig orsak till cancer dödlighet och många mekanismer som gör det möjligt för cancercellernas spridning återstår att upptäcka en. För att en cancercell att framgångsrikt metastaser, måste det först invadera genom stroma som omger en primärtumör, anger (intravasate) i cirkulationssystemet, överleva i transit, exit (extravasera) från cirkulationen och slutligen skapa en livskraftig koloni vid den avlägsna organ plats två. Intravasering och extravasering är därför avgörande steg i metastaserande kaskad, men varje cancercell är inte i sig skicklig på att störa och migrera genom endotel korsningar 3. I själva verket finns det en serie av unika selektionstryck som omger cancercell vaskulär invasion och processen kan vidare påverkas av en mängd olika endogena och exogena faktorer fyra. Av dessa skäl, tekniker som pejlar aggressiva beteende framskridet stadium cancer fokuserar ofta på vascular invasiv förmåga som ett sätt att förutsäga metastatisk spridning.
Olika modellsystem finns för att underlätta studier av cancercellen vaskulär invasion in vitro. Den mest använda in vitro-analyser involverar antingen Transwell-system för att bedöma cancercell migration genom en endotel barriär 5 eller elektrisk Cell Substrate Impedans Sensing (ECIS) teknik för att övervaka i realtid störningar i en intakt endotel monolager av cancerceller 6. Dessa analyser saknar typiskt fluiddynamik och stromala faktorer som annars skulle påverka cancercell bilaga till ett endotel vägg. Denna fråga är något kringgås genom perfusable vaskulära nätverk som uppstår vid 3D kultur endotel med stödjande stromaceller och dessa 3D mikroflödessystem utgör nu i spetsen för nuvarande in vitro alternativ 7,8. Ändå dessa metoder utelämna robusta mikro av en funktionell cirkulationssystemetoch därför endast delvis ersättning för in vivo-modeller.
Den mest använda in vivo-modell av vaskulär invasion är musen, i vilken experimentella metastaser analyser är vanligen utföras eftersom de inträffar på relativt korta tidsramar och är i allmänhet ett tecken på metastaserande förmåga 9. Dessa analyser involverar direkt injektion av cancerceller i omlopp och därför modellera slutstadier metastas, nämligen extravasering och cancerceller kolonisering av organ. De experimentella metastas analyser variera beroende på platsen för cancer cellinjektion och organen slutligen analyseras. I det första analystypen, är cancerceller injiceras i svansvenen på möss och cancercellsådd i lungorna övervakas 10,11. Den andra analysen innefattar att intrakardiella injektioner för att rikta metastaser sådd mot benet mikro 12-14, men också hjärnan 15. I den tredje analysen, cancer calnar injiceras i mjälten för att medge kolonisering av levern 16, medan den fjärde leveransrutt in i halspulsådern bär cancerceller till hjärnan 17,18. Oberoende av cancercellen leveransmetod, är organ kolonisering accepterade experimentella slutpunkt och bestäms i allmänhet via luminiscens, histologi, eller PCR-baserade tekniker. Trots de fysiologiska fördelarna med att genomföra experimentella metastaser analyser inom en murin värd, dessa experiment kräver fortfarande veckor till månader att slutföra och analysera.
Zebrafisk (Danio rerio) modellen har nyligen dykt upp som ett nytt system för att studera cancer progression 19,20, och gör det möjligt att bedöma cancercellen vaskulär invasion inom ett funktionellt cirkulationssystemet under en mycket kortare tidsperiod jämfört med möss 21-24. Metoden utnyttjar en transparent zebrafisk stam som har sin endotel märkta med en grön rev korall fluorescent protein reporter drivs av kdrl promotorn, zebrafisk receptorn för vaskulär endotelial tillväxtfaktor 25. I analysen, är cancerceller märkta med en röd fluorescerande markör och injicerades i prekardiellt sinus av två dagar gamla embryon. Någonstans mellan 48 till 96 h efter injektionen, kan cancerceller som har invaderat ut ur vaskulaturen och in i det kaudala området av embryon görs effektivt på ett fluorescensmikroskop. Här tillämpar vi tekniken till en panel av vanliga bröstcancercellinjer mänskliga att visa stora skillnader i deras vaskulära invasiva förmåga. Vidare visar vi att ändring av injektionsstället till embryot gulesäcken möjliggör studiet av heterogena cellinteraktioner, såsom cancercellpopulationer kan differentiellt märkta med fluorescerande färgämnen och injiceras i zebrafiskembryon som saknar fluorescerande vaskulaturen. I detta senare analysen, cancerceller som har invaderat gulan och intravasated in i vasculature poängsätts i den kaudala området 24-48 h efter injektion. På grund av effektiviteten och bekvämligheten av denna modell, är zebrafisk alltmer används för att snabbt testa vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller i en fysiologisk miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: zebrafisk embryon genererades enligt en godkänd IACUC protokollet. Dessa experiment genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Georgetown University Djurvård och användning kommittén.
1. Organisera Embryon för injektion och skapa stamlösningar
- Generera erforderlig zebrafisk larver för att bedöma cancercell vaskulär invasion.
- Ställ in parvis eller grupp i tvär parning med Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, ednrb1 B140 fisk.
OBS: Vi genererade Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafisk, genom att korsa Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, som uttrycker grönt rev korall fluorescerande protein i endotelceller, med en linje som saknar pigmentceller, mitfa b692, ednrb1 B140, som utvecklats vid Zebrafish International Resource Center. - collect ägg, ren, och ta bort obefruktade eller deformerade embryon nästa dag 22.
- Inkubera embryon vid 28,5 ° C tills redo för injektion med cancerceller, att uppstå när zebrafisk embryon är 2-dagar efter befruktningen (2 dpf).
- Ställ in parvis eller grupp i tvär parning med Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, ednrb1 B140 fisk.
- Göra injektions plattor.
- Smält 25 ml 1,5% agaros i dH 2 O för varje platta.
- Häll 12 ml av agaros i en 100 mm x 15 mm petriskål och låt det härda.
- Re-melt häll sedan de återstående agaros i plattan.
- Omedelbart placera en cut glasform (3 mm x 7,2 cm bredd x 7,5 cm lång) så att den befinner sig vid en 30 graders vinkel mot agaros och placerad i mitten av plattan.
OBS: Detta kommer att skapa en brant 60 ° väggen och en 30 ° lutande ramp. - Tejpa glasformen på plats och låta agarosen hårdna.
- Ta försiktigt bort glaset mögel och vara noga med att inte slita agarosen.
OBS: Formar kan lagras i dH 2 O vid 4 ° C.
- Jämvikt injektion tallrik med fisk vatten (0,3 g / L havssalt).
- Skölj plattan två gånger med destillerat vatten.
- Jämvikta plattan genom att tillsätta 10 ml av fisk vatten till plattan och placera på skakare under 10 min.
- Jämvikt platta en andra gång med fisk vatten.
- Split 2-dagars efter befruktning (DPF) embryon i injektionsgrupper genom att överföra dem till rätter som innehåller fisk vatten 22.
- Förbered återvinnings rätter för varje grupp att utnyttja efter injektion. Se till att återhämtningen skålen innehåller 10 ml fisk vatten, plus penicillin (25 ^ g / ml) och streptomycin (50 | j, g / ml).
- Förbereda 2x tricaine lösning genom att tillsätta 4 ml buffrad tricaine lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) till 50 ml av fisk vatten plus penicillin och streptomycin.
- Lös upp 15 mg med låg smältpunkt agaros i 10 ml 2x tricaine lösning för att alstra en monterings anestetikum medium som kommer att immobilisera levande embryon för imaging.
OBS: Monteringsmedium består av 1,5% agaros. - Dra mikroinjektion nålar.
- Placera glas kapillärrör i en vertikal pipett avdragare. Dra långa avsmalnande pipetter med användning av 20 mAmp ström och en 2-spole värmeelement.
2. Märkning cancerceller med lipofil fluorescerande färgämne
- Bibehålla cancerceller i sina rekommenderade odlingsbetingelser.
OBS: Dessa linjer bibehölls i DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, och SK-BR-3. Dessa linjer bibehölls i RPMI + 10% FBS: HCC 1806 och T-47D. Alla cellinjer upprätthölls vid 37 ° C och 5% CO2 under inkubation. - Generera en enkelcellsuspension genom att dissociera ett vidhäftande kultur av cancerceller.
- Tvätta cellerna först med PBS och därefter behandla med 0,05% trypsin-EDTA-lösning.
OBS: Trypsin exponeringstid kommer att bero på cellinjen. - Neutralisera trypsinlösning med SErom innehållande cellodlingsmedia efter att cellerna lossnar.
- Tvätta cellerna först med PBS och därefter behandla med 0,05% trypsin-EDTA-lösning.
- Centrifugera trypsin-neutraliserade cellsuspension i 5 min vid 200 xg, sedan resuspendera cellpelleten i färskt odlingsmedier för cellräkning.
- Räkna cellsuspensionen med användning av en automatiserad räknare och förbereda 1 miljon celler i 200 | il av cellodlingsmedia.
- Verifiera cellviabilitet med trypanblått uteslutning före injektion i zebrafiskembryon.
OBS: Endast livskraftiga cellpopulationer ska injiceras i zebrafisk embryon, som injektion av döda celler kommer inte speglar verkliga vaskulär invasion.
- Verifiera cellviabilitet med trypanblått uteslutning före injektion i zebrafiskembryon.
- Tillsätt 2 | j, l av rött lipofila färgämnet till cancercellsuspension för en 1: 100 spädning, blanda väl, och sedan inkubera blandningen vid 37 ° C under 20 min.
OBS: Koncentration av färgämnet och märkning tid kan behöva optimeras för varje cellinje. - Efter inkubationen, tillsätt 1 ml färskt medium till röret och centrifugera sedan i 5 min vid200 x g.
- Tvätta bort kvarvarande fluorescerande färgämne från cancerceller.
- Aspirera supernatanten från cellpelleten, återsuspendera pelleten i 1 ml färsk odlingsmedia, och centrifugera under 5 min vid 200 x g.
- Upprepa tvättsteget en andra gång: aspirera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml färskt medium och sedan centrifugera igen under 5 minuter vid 200 x g.
- Upprepa tvättsteget tredje gången: aspirera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml färskt medium och sedan centrifugera igen under 5 minuter vid 200 x g.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten innehållande 1 miljon märkta cancerceller i 500 | il färskt medium.
OBS: 0,5 mM EDTA kan tillsättas till media för att förhindra cellklumpning.
3. Injektion cancerceller i Pre-hjärt Sinus av zebrafiskembryon
- Fäst mikroinjektion doseringssystem till en tryckluftkälla och slå på the mikroinjektion doseringssystem strömkälla.
- Provtryck genom att trycka på fotpedalen. En kort puls av luft ska avge från nålhållaren.
- Jämvikta injektions plattorna två gånger med 2x tricaine lösning.
- För varje jämviktssteg, tillsätt 20 ml av 2x tricaine lösning till injektions plattan och lägg på shaker under 10 minuter.
- Använd plast pipett för att överföra en grupp av embryon till en liten skål med 2x tricaine lösning.
- Återfyllning mikroinjektion injektionsnålen med cancerceller med hjälp av en gel-laddning pipettspetsen.
- Placera nålen i en elektrod förvaringsburk med den spetsiga änden nedåt så celler nöja nära spetsen.
- Transfer 20 - 30 sövda embryon till en injektionsplatta genom att samla in embryon med mycket 2x tricaine i en plastpipett.
- Låt embryon att bosätta sig i spetsen på pipetten.
- gently utvisa embryon in i tråget av insprutningsplattan, sprider embryona längs längden av tråget.
- Rikta embryon med huvud uppåt och magar inför den branta väggen i tråget.
OBS: Tricaine lösning bör omfatta både tråget längd och den plana agaros ytan, med embryon endast bosatta i tråget. Embryon är nu redo för injektion.
- Injicera 50 - 100 cancerceller (2-5 NL) i prekardiellt sinus av zebrafisk embryon med hjälp av mikroinjektion doseringssystem.
- Fäst nålen nålhållaren av en mikromanipulator.
- Placera insprutningsplattan under stereoskop med 60 graders väggen till vänster och fokusera på den övre embryot vid 25x förstoring.
- Placera mikromanipulator så att, när det är utdraget, kommer nålen att genomborra embryot.
- Förlänga nålen genom ögat tills den är nästan vidrör embryot.
- Ser i mikroskop rikta nålen så thatt det tränger embryot på ytterligare förlängning.
- Pierce embryot genom gulesäcken placera spetsen bara på, men inte i den pre-hjärt sinus.
- Injicera celler genom att trycka på fotpedalen. Kraften av injektions driver ut cellerna in i hjärt sinus. Dra in nålen.
- Med hjälp av höger hand, förlänga och dra in injektionsnålen. Med vänster hand, göra finjusteringar för att placera nästa embryot.
- Återgå nålen till elektrodförvaringsburk när du ställer upp för att injicera en annan platta.
- Överför embryon till återhämtningen skålen när hela plattan injiceras.
- Luta insprutningsplattan till pool embryona i botten, tvätta alla återstående embryon av tråget, och uppsamling av dem med plastpipett.
- Tillåta embryona att sedimentera i botten av pipetten.
- Överför embryon till återhämtningen skålen i en minimal volym av tricaine.
- Incubate återhämtning skål vid 28 ° C under 1 timme.
- Separata livskraftiga zebrafisk embryon från döda embryon och annat skräp.
- Inkubera skålen vid 33 ° C tills redo för poäng, typiskt 24-96 tim.
OBS: Denna temperatur bestäms som en kompromiss mellan 37 ° C, den idealiska temperaturen för cancerceller, och 28,5 ° C, den idealiska temperaturen för zebrafisk.
4. Scoring Extravasering
- Söva parti embryon som görs genom att placera dem i en skål med tricaine lösning.
- Placera en sövd larver på en depression mikroskopi bild i en droppe tricaine.
- Orient larver i sidled för optimal avbildning av caudal regionen.
- Räkna antalet cancerceller som framgångsrikt har invaderat av kärlsystemet genom att fokusera upp och ner genom svansregionen tydligt urskilja intakta celler.
OBS: Det är bäst att ha åtminstone två personer som är inblandade i thans process, där individen scoring fisken är blind för den experimentella tillstånd som bedöms.- Betyg larver på en förening fluorescensmikroskop med 10x objektiv. Använda 20x objektiv för eventuella svåra samtal.
5. Montering embryon på objektglas och Efterföljande Fluorescens Imaging
- Smält 1,5% agaros / tricaine lösning och ta med till 37 ° C.
- Söva embryot som ska avbildas genom att placera den i tricaine lösning.
- Överföra embryot i en droppe tricaine lösning på bildytan. Valfritt använda en glasbottnad skål eller objektglas.
- Använd en glaspipett att avlägsna överskottet tricaine lösning, behålla embryot på bildytan.
- Överlagra en droppe av smält agaroslösningen över embryot.
- Snabbt, innan agarosen polymeriserar använder ett delikat verktyg, som en ögonfrans borste, att orientera embryot i sidled för avbildning, vilket ger extra omsorgför att säkerställa att embryot är tillplattad längs bildytan.
- Sänk den nu polymeriserade agarosen droppe i tricaine lösning.
- Utsätta levande zebrafisk embryo till mikroskopisk avbildning.
6. Ändring: Att injicera cancerceller till gulesäcken i Zebrafish embryon
- Förbered mikroinjektion doseringssystem och injektionsplattor som tidigare beskrivits i avsnitt (3) i detta protokoll.
- Märk två cellpopulationer med kontrasterande fluorescerande färger som tidigare beskrivits i avsnitt (2) i detta protokoll.
- Injicera 5-10 nl av 2 x 10 ^ 7 celler / ml i gulesäcken. Håll injektionsvolymen konstant för att injicera samma cellantal (100 - 200 cancerceller) från varje cellpopulation
OBS: Man kan använda genomskinliga zebrafisk embryon som saknar fluorescerande kärl för denna analys. Passivt inträde av partiklar in i vaskulaturen kan styras för genom att injicera fluorescerande kulor (<10 ^ m) eller, förändranativt, en cellinje som inte intravsate. - Återställa injicerade embryon som tidigare beskrivits i avsnitt (3) av detta protokoll och sedan screena för framgångsrika injektioner.
- Använd en stereoskop för att screena och överföra livskraftiga embryon som framgångsrikt injicerades till en ny maträtt.
OBS: Alla embryon bör ha en konsekvent storlek massa av celler som finns i äggula. Embryon kasseras om mass storlek skiljer sig eller om några celler är belägna utanför äggulan. - Överför livskraftiga embryon till en ny maträtt om cancerceller syns tydligt i gulesäcken.
- Använd en stereoskop för att screena och överföra livskraftiga embryon som framgångsrikt injicerades till en ny maträtt.
- Inkubera skålen vid 33 ° C tills redo för poäng, typiskt 24-48 tim.
OBS: Denna temperatur bestäms som en kompromiss mellan 37 ° C, den idealiska temperaturen för cancerceller, och 28,5 ° C, den idealiska temperaturen för zebrafisk. - Att göra mål intravasering, följa de riktlinjer som beskrivs i avsnitt (4) i detta protokoll, utan i stället räkna antalet cancer celler som framgångsrikt har invaderat in i vaskulaturen hos den kaudala regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi testat den vaskulära invasiva förmåga av vanliga bröstcancercellinjer i en zebrafisk embryo modell (Figur 1). Strikta kriterier användes i scoring extravasering för dessa olika cellinjer, där positiva händelser endast räknades om cancerceller hade klart extravaserat, varvid detta görs främst för att begränsa eventuella falskt positiva som kan uppstå från att göra poäng cellrester.
Vår analys avslöjade skarpa skillnader mellan raderna när invasion bedömdes 96 h efter injektion i prekardiellt sinus (tabell 1). Av de 7 testade cellinjer, zebrafisk embryon som injicerats med MDA-MB-231-cellinjen uppvisade det största antalet extravaserade cancerceller per embryo, ett konstaterande som är förenliga med den accepterade metastaserad karaktär linjen (Figur 2). Vi fann också att BT-474 celler lätt invaded in i den kaudala området av embryona, medan andra cellinjer, såsom MCF-7, SK-BR-3, och T-47D-celler, var minimalt invasiva (Figur 3). En märklig upptäckt var att ungefär hälften av de zebrafisk embryon som injicerats med MDA-MB-468-celler hade ödem i kardiell regionen och dessa inte gjorde. Som en följd av detta har ett antal embryon som injicerats med MDA-MB-468-celler kasseras innan vi hittade tillräckligt lönsamma exemplar som kan kvantifieras för extravasering. Trots dessa påstådda skillnader, är det anmärkningsvärt att extravasering skedde med varje cancer cellinje testas.
Som en modifikation av prekardiellt sinus-analysen genomförde vi en tävling experiment där två populationer av MDA-MB-231-celler som skiljer sig i deras vaskulära invasiva förmåga 26 var samtidigt injiceras i gulesäcken utvecklings embryon. MDA-MB-231 celler förökade i sammanflytande odlingsbetingelser tidigareinjektion uppvisade en minskning av intravasering i cirkulationen och därför hade en minskad närvaro i den bakre regionen av embryon vid scoring (Figur 4).
| cELLINJE | Avg. # Extravaserat celler per Embryo | Räckvidd |
| MDA-MB-231 (subkonfluent) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1,5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0,2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Tabell 1: Jämförelse av kärl Invasive Förmåga bröstcancercellinjer i Zebrafish Vanligen används bröstcancercellinjer injicerades i prekardiellt sinus av två dagar gamla zebrafisk embryon och gjorde 4 dagar senare. Cancerceller invaderar från kärlsystemet och i den kaudala området kvantifierades i 10 embryon per cellinje. Det genomsnittliga antalet extravaserade cancerceller indikeras tillsammans med intervallet.
Figur 1. Visuell Sammanfattning av Zebrafish Cancer Cell Extravasering analys. I denna analys är cancerceller märkta med ett fluorescerande färgämne och sprutas in i prekardiellt sinus av två dagar gamla zebrafisk embryon, vars kärl präglas av en kontrasterande fluorescerande reporter. Efter 2 - 4 ytterligare dagar, cancerceller som har invaderat in den bakre regionen av embryot ärskåras och kan monteras i en anestesi agaros medium för efterföljande avbildning. Varje steg som visas i denna schematiska motsvarar en del av protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bild Mosaik av en Zebrafish Embryo 4 dagar efter injektion med MDA-MB-231-celler. Brightfield (A) och fluorescerande (B) mosaik visas. Fluorescerande bilder är avbildade som den maximala projektionen av en z-stack, i vilken en grön färg betecknar vaskulaturen och en röd färg indikerar cancercellerna. Skala bar, 200 nm. (C) embryots caudal regionen förstoras för att visa extravaserade cancerceller. Punktat fluorescensmärkning ses på Magnification. Skala bar, 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på experimentella resultat. Här extravasering demonstreras i ett embryo injiceras med BT-474 cancerceller men inte på ett embryo injiceras med MCF-7, SK-BR-3 och T-47D cancerceller. Pilspetsar betecknar extravaserade celler. Skala bar, 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. intravasering av MDA-MB-231 cellpopulationer 2 dagar after gulesäcken Injection. (A) gulesäcken med grön (invasiv) och rött (mindre invasiv) märkt MDA-MB-231-celler. (B) Den caudal regionen med MDA-MB-231-celler som invaderade kärl att nå svansen region. (C) Antalet zebrafisk embryon med intravasated MDA-MB-231-celler i den bakre regionen 2 dagar efter injektion 26. Skalstrecken, 250 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik använder zebrafisk modell för att effektivt testa vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller (se figur 1). Här har vi använt tekniken till en panel av bröstcancercellinjer i syfte att tillhandahålla en baslinje på vilken andra forskare då kan bygga sina egna studier (se tabell 1, fig 2 - 3). Observationen att MDA-MB-231-celler lätt invaderat in den kaudala området av zebrafiskembryon skulle göra denna cellinje idealisk för att testa medel som kan inhibera vaskulär invasion. Jämförelsevis mindre invasiva cellinjer, såsom HCC1806 eller MDA-MB-468-celler till exempel, skulle kunna användas för att studera faktorer som annars skulle potentiera vaskulär invasion. Om dessa typer av experiment kräver införande av läkemedel, då en har två olika vägar för leverans, beroende på om behandlingseffekten förväntas vara hållbara. Cancerceller kan förbehandlas med läkemedlet före injektion in iembryona eller läkemedlet kan direkt sättas till vattnet som inrymmer embryona där det kommer att påverka de cancerceller genom diffusion.
I vår jämförelse, analyserade vi cancercell extravasering i zebrafisk embryot svansen 96 h efter injektion i prekardiellt sinus. För cellkonkurrensanalys av MDA-MB-231, var intravasering i omlopp bedömdes 48 h efter gulesäcken injektion. De tidpunkter som valts för analys kräver normalt optimering för varje cellinje där, för vissa experiment, kan topp extravasering inträffar bara 24 timmar efter injektionen. Det är värt att notera att de zebrafisk embryon har en funktionell medfödda immunförsvaret när de injiceras med cancerceller 27 och följaktligen kan fluorescerande skräp från cancerceller att uppslukas av immunceller som makrofager eller neutrofiler. Aktivitet av det medfödda immunförsvaret kan därför potentiellt skapa falskt positiva fluorescensmärkning när man försöker att göra mål extravasatJon; omsorg måste ges endast poäng celler som kraftigt fluorescerar i rätt kanal. Eftersom nuvarande cancerforskningen blandar immunsystemet att förbättra cancermetastaser 28, kan zebrafisk embryo modell ge unika insikter i detta område genom att tillåta granskning av överhörning sker mellan cancerceller och det medfödda immunförsvaret. Denna idé exemplifieras av ett par av de senaste studierna. Den första av dessa studier har visat att VEGFR-hämning i zebrafisk förbättrad förmåga hos neutrofiler att framkalla metastaserande beteende från cancerceller 29. En andra studie visade att CXCR4-CXL12 immun kemokin signalering axel är intakt i zebrafisk, som receptorn på humana cancerceller kunde avkänning och svara på zebrafisk ligand 30, och uttrycket av CXCR4 i cancerceller korrelerade med sin invasiva förmåga inom djurmodell. Dessutom visades det att zebrafisk makrofager utställningenTed en kemotaktiska svaret mot mänskliga CXCL12. En zebrafisk embryo stam med fluorescerande neutrofiler 31, till exempel, skulle kunna användas för att ytterligare undersöka cancercell interaktioner med immunsystemet i denna modell.
Några steg i protokollet kräver särskild uppmärksamhet. För det första är det väsentligt att cancerceller kan dissocieras till en enkelcellsuspension i syfte att förhindra igensättning av nålen under injektion i embryon. Cellulära aggregat kan också blockera blodflödet och störa förmågan hos cancerceller att resa in i den kaudala regionen och därmed missvisande analysen. Cellulära aggregat kan också framkalla blodkärl att brista och, om detta inträffar ledningen med invasiva förmågan hos levande cancerceller i dessa områden varken tillförlitlig eller rekommenderas. Ett annat potentiellt problem område avser märkning av cancerceller med fluorescerande färg. I experiment som drivs av vårt laboratorium, har vi funnit att lipofila färgämnenliknande Dil till exempel, tenderar att producera den bästa märkningen, men dess fluorescensnivån kan variera mellan cellinjer. Av denna anledning bör den fluorescerande märkning av cancerceller optimeras före insprutning i embryona i syfte att förhindra övermärkning. Det är kritiskt att överskottsfärg tvättas bort från de cancerceller efter att de har märkts, och detta uppnås genom att de olika centrifugeringsstegen som anges under avsnittet märkning av protokollet; dessa steg kan tyckas överflödigt, men de är absolut nödvändiga. För mycket fluorescerande färgämne kan vara toxiska för celler eller läcka in i blodomloppet, som producerar en arte fluorescerande bakgrund. Många av dessa frågor kan kringgås genom användning av cancerceller som uttrycker fluorescerande proteiner, och det rekommenderas att dessa system kan användas i stället för fluorescerande färg när det är möjligt. Slutligen, när scoring embryon för cancer extravasering är det absolut nödvändigt att tillämpa enhetliga kriterier för alla förhållanden. Vi finner thinvolvera åtminstone två personer i scoring steg bidrar till att upprätthålla den vetenskapliga stringens: en individ har till uppgift att förbereda bilderna och registrering av resultaten, medan den andra personen gör extravasering domen och hålls blinda för det tillstånd som utvärderas. När scoring, en kan antingen kvantifiera extravaserade cancerceller i svansregionen eller skapar binära kriterier för enkel jämförelse. Fluorescerande färgning cancerceller producerar punktat märkning som kommer att vara synlig på mycket hög förstoring (Figur 2c), men hela celler är lättare att urskilja vid lägre förstoring (Figur 3), är den senare som rekommenderas för poängsättning. Att döma mer tvetydiga fall av extravasering kan underlättas genom förvärvet av optiska skivor på en konfokalmikroskop, där kvantifiering extravasering som en procent av alla celler i svansregionen kan styra för ojämn belastning av cancerceller i embryot.
yolk sac injektion väg skiljer sig från prekardiellt sinus eftersom det möjliggör ett större antal celler och därmed bättre inrymmer heterogenitet inom en cellpopulation. Såsom visas i figur 4, kan flera differentiellt märkta cellpopulationer samtidigt sprutas in i gulesäcken för att jämföra deras invasiv förmåga och mönster. Den angiogena förmågan hos injicerade celler och ökad rekrytering av blodkärl kan underlätta cancercell inträde i svansregionen men denna aspekt har ännu inte analyserats. Tekniskt sett gulsäck injektioner är lättare att utföra än en prekardiellt sinus injektion men å andra sidan, är gulesäcken en näringsrik miljö som kan hindra utförsel av cancerceller. Det är också möjligt att injektion nära blodkärl i äggulan i förtid kan införa cancerceller i cirkulationen och därför måste man noggrant undersöka om klantiga injektioner och utelämna dessa embryon från poäng. Slutligen är det viktigt to notera att äggulan mikro är något konstlad, eftersom den saknar en analog primära platsen hos möss eller människor.
De olika modellsystem som syftar till att förutsäga cancer metastaser är inte utan sina fördelar och nackdelar, och zebrafisk extravasering analysen är inget undantag. Som en stor fördel, kan denna analys för bedömning av vaskulär invasiv förmåga inom ett funktionellt cirkulationssystemet och experimentella frågor kan besvaras efter bara några dagar. Med tanke på den snabba produktionstiden, kan ett sådant system utnyttjas för att sondera den aggressiva beteende inte bara etablerade cellinjer, men också nyligen isolerade prover från humana cancerpatienter. Den största nackdelen är att denna modell utelämnar de tidigaste och senaste händelserna i metastaserande kaskad genom att endast fokusera på vaskulär invasion. Dessutom är de humana cancerceller injiceras i dessa zebrafisk embryon uppenbarligen inte arbetar i en syngen milieu och vissa samspel med than stromat kan följaktligen förlorad. Trots dessa begränsningar, har zebrafisk embryo modell en välförtjänt plats i både grundläggande och translationell cancerforskning, som vi har använt det visar en roll för Hippo signalväg 26 och keratin-associerat protein 5-5 32 i kärl invasiv förmåga cancer celler. Därför har denna modell potential för att underlätta utredningen av en viktig metastatisk kännetecken för långt framskriden cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
