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Biochemistry

对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法

Published: January 11, 2017 doi: 10.3791/55008

Introduction

植物产生的种子,其产生下一代。种子积累大量存储储备,如油,碳水化合物和蛋白质,对于后发芽生长。人类利用种子贮藏储备食品和动物饲料的来源,因此,植物种子是可食用的有机物全球主要供应商之一。提高种子产量是植物科学的一个重要挑战。

因为种子贮藏储量食品和工业材料的商业价值的来源,这些储备的代谢的调节的分子机制已被广泛研究1-6。进一步阐明这些机制将用于提高农作物的种子产量是有用的。发展种子植物子房受精后,他们通过一系列的发展阶段1,6,7的成熟。进一步了解的分子机制基本种子发育需要详细,要生产由一系列发育中的种子的精确基因表达谱。然而,高含量的油,蛋白质,碳水化合物,和多酚类物质在植物的种子使其难以高度纯化的RNA,这排除基因表达的精确分析隔离。

在这里,我们介绍一种从含大量油脂,蛋白质和多酚的油籽RNA提取的有效方法。使用这种方法,研究人员将能够制备高度纯化的RNA。这种RNA将成为监测的关键基因控制种子贮藏储备的开发和成熟的油籽代谢调控转录变化非常有用。

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Protocol

1.从植物种子总RNA提取

  1. 制备缓冲套,离心柱,1.5和2.0毫升聚丙烯管,和无核酸酶的1.5mL的聚丙烯管中。
  2. 添加1%(重量/体积)分子生物学级的聚乙烯吡咯烷酮(以下简称PVP)细胞裂解缓冲液提取RNA并涡旋大力。孵育20分钟,在25℃以完全溶解。 20分钟温育后,通过将管倒置,以防止气泡的形成轻轻混匀缓冲区。在存放使用前室温(15-25°C)。
  3. 拟南芥植物和发生在冰上1.5毫升聚丙烯管丰收果实。关于铝板的地方水果保持在4℃,立体显微镜下分离从果实种子。
    1. 放置分离的种子(大约200颗种子)转换成已经存储在铝机架在冰上1.5毫升聚丙烯管,并立即放置在液体n中的管itrogen。
  4. 从液氮中取出管子并将其返回到铝架上的冰。在1000 xg离心加入100微升含有1%1分钟PVP和离心机缓冲器的在4℃下。
  5. 均质用马达粉碎机60秒,同时保持该管的铝机架上冰的不锈钢杵样品。
  6. 添加含有1%的PVP缓冲器550微升,通过转动管倒置轻轻混匀缓冲区,并在25℃下孵育10分钟。
  7. 离心机在8000 xg离心25℃5分钟,并转移550μL上清液至新的1.5毫升聚丙烯管中。
  8. 离心机以10,000 xg离心,在25℃5分钟,并转移450μL上清液至新的1.5毫升聚丙烯管中。
  9. 使用上清液作为提取RNA的细胞裂解物。以下,按照制造商的说明在市售的试剂盒中描述的方法。
  10. 洗脱使用RNA洗脱缓冲液的最小体积,以确保RNA的足够高的浓度用于监测低水平的转录物的表达模式。存放RNA的冰柜直到使用。

2. RNA质量认证

  1. 解冻总RNA,通过轻轻敲击混合,并放置在管中于冰上的铝架上。
  2. 使用微量分光光度计测量RNA浓度,A260 / A280比率,和A260 / A230比值。
  3. 稀释在无RNA酶的水中的总RNA至70毫微克/微升的最终浓度。

3.从种子总RNA逆转录

  1. 从商业试剂盒解冻总RNA和缓冲器集。保持酶从轻轻敲击后在冰上套件。制备无核酸0.2mL的聚丙烯管中。
  2. 添加5μL的总RNA,1寡μL的dT引物(50μM),和1个随机的μM6聚体(50μM)的0.2毫升polypropy冰上lene的管。
  3. 孵育在37ºC15分钟,并放置在冰上。
  4. 以下,按照制造商的说明在逆转录PCR试剂盒中描述的方法。
  5. 使用前置于冰上逆转录产品。

4.实时定量PCR分析

  1. 构建质粒携带使用制造商的协议的靶基因序列。
  2. 调整浓度100-500,000拷贝/μL为标准曲线的DNA模板。
  3. 稀释的cDNA溶液(1:100)用蒸馏水。
  4. 添加稀释的cDNA溶液2μL,和用于标准曲线,从定量实时PCR试剂盒的主混合物的质粒。
  5. 95℃30秒,然后在95℃下40个循环进行5秒和60℃35秒:使用以下的循环条件成立实时PCR。
  6. 根据人分析拷贝数ufacturer的指示为实时PCR系统。

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Representative Results

我们首先调查了使用拟南芥成熟种子的PVP的最佳浓度。总RNA根据上面使用含0%,0.25%,0.5%,1.0%或2.0%的PVP细胞裂解缓冲液中描述的协议从大约1,000种子中分离。均质化和离心后,同时避免了油层和种子碎片( 图1A)收集上清液。

图1
图1: 在细胞裂解缓冲液的最佳聚乙烯吡咯烷酮浓度的估计。总RNA用含有不同浓度的PVP的细胞裂解缓冲液提取。 (A)均匀化退火和离心后的种子的照片。 (B)的波长的吸光度的每个样品的曲线图表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

分离的RNA的数量和纯度从波长吸光度的曲线图( 图1B),这表明,1.0%的PVP是从种子中分离大量的纯化的RNA的最有效的浓度估计。

发育中的种子从拟南芥水果立体显微镜( 2A,2B)根据隔绝在冰上预冷的铝板。将种子用不锈钢杵和电动研磨机中的管上的冰的铝机架( 2C,2D)匀浆。

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图2:隔离和发展 拟南芥 种子的同质化 开展种子从果实上的立体显微镜(A)在一个寒冷的铝板隔离。心皮从椎弓根(B)的剥离,发育中的种子被收集。种子被均质化使用在管的不锈钢杵(C)中在冰上冷却(D)一种铝机架含有1%(重量/体积)聚乙烯吡咯烷酮的裂解缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。

总RNA从种子使用我们的新开发的方法或常规方法开花(以下简称为DAF)之后在4,8和12天后分离出来。的浓度,A260 / A280比值,和A260 /从200种子中分离的RNA的A230比示于表1中

方法 DAF RNA浓度 A260 / A280 A260 / A230
常规 4 72.4±7.4 1.90±0.02 2.27±0.06
8 10.8±3.0 1.50±0.08 1.40±0.17
12 4.9±1.7 1.57±0.10 0.76±0.18
4 63.7±2.6 2.10±0.08 2.29±0.03
8 46.3±4.9 2.15±0.05 2.23±0.09
12 41.77; 3.1 2.09±0.04 2.17±0.07

表1:来自 拟南芥 种子中 分离的RNA的浓度,A260 / A280比值,和A260 / A230比值 总RNA从约200颗种子(从190到206的种子)4,8分离,并用传统的方法或我们的新开发的方法12的DAF。 RNA的浓度,A260 / A280比值,和A260 / A230的比率进行了测量。值代表三个独立实验的平均值±SD。

结果表明,我们的方法,使我们能够高度纯化的RNA,从图8和12的DAF种子隔离开。总RNA逆转录成cDNA,并将cDNA溶液稀释100倍。 WRI1的拷贝数( 1:AT3G54320),SDP1( DEPENDENT1:AT5G04040)7 </ SUP>和EIF3K(真核翻译起始因子3K:AT4G33250)作为内部对照8进行测定,和转录物的相对量通过定量实时PCR分析( 图3)估计的。

图3
图3: 在发育中的种子低水平转录物的定量。总RNA是使用我们的方法从4,8和12的DAF种子中提取,并分别制备的cDNA溶液。 WRI1(A)SDP1(B)的转录物的相对量通过定量实时PCR测定。 EIF3K用作内部对照。值代表平均值的三个独立实验的SD。 DAF;开花后几天。 请点击他再查看该图的放大版本。

虽然WRI1SDP1转录物的量是在发育中的种子比较低,这是能够检测在不同发育阶段的种子之间表达变化。为了验证我们的方法可以在其他油籽被利用,总RNA来自欧洲油菜大豆的成熟种子中分离。 RNA的浓度,A260 / A280比值,和A260 / A230的比率示于表2中

方法 RNA浓度 A260 / A280 A260 / A230
常规甘蓝型油菜 7.7±0.8 1.5±0.12 0.75±0.11
G.最大 1.61±0.06 0.69±0.09
甘蓝型油菜 143.2±19.0 2.17±0.03 2.23±0.13
G.最大 152.3±4.4 2.17±0.02 2.30±0.02

表2:RNA浓度,A260 / A280比值,和A260 / A230比值从 甘蓝型油菜 大豆 的成熟种子中分离 总RNA从约100毫克甘蓝型油菜和使用常规方法或我们的新开发的方法, 大豆种子分离。种子以前粉碎并用研钵和杵在液氮中冷冻大致均化。该RNA浓度,A260 / A280比,和A260 / A230的比率进行了测量。值代表三个独立实验的平均值±SD。

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Discussion

基因表达谱有助于我们植物生理学的理解;因此,特定的RNA分离方法已经开发了用于每个样品的条件9-12。我们调查了被RNA分离过程中从种子抑制,发现RNA结合硅胶膜是严重抑制的过程。油,蛋白质和多酚的大量抑制RNA分离。我们修改了RNA提取过程以除去这些化合物与的RNA结合到二氧化硅膜上的处理前的裂解溶液。重要的修改包括添加1%PVP(步骤1.2)和从离心裂解液上清液的收集(步骤1.7,1.8)。在加入1%的PVP的目的是去除多酚。我们研究的PVP的最有效的浓度使用,并且确认了1%的PVP是最有效的浓度为这一过程。从离心裂解液收集上清的目的是除去油和蛋白质。上清液应仔细收集,以避免保留在上清液的油层,并在管的沉淀。这两个简单的修改大幅提高回收率,A260 / A280的比率,并且从中间的种子和发展的后期阶段( 表1)分离的RNA的A260 / A230比值。

我们的方法中,其表示标准协议的一个简单的修改,使用了市售的试剂盒进行RNA分离。因此,我们的方法是用于分离从种子高度纯化的RNA,而不需要麻烦的额外步骤,诸如苯酚 - 氯仿提取和乙醇沉淀使用氯化锂实用。我们的方法也有效用于与成熟油菜籽和大豆种子( 表2)使用,这表明修饰输油富含蛋白质的作物种子工作良好。来自4 DAF种子( 表1)和青年根RNA的回收率S,叶和茎较低使用我们的方法,这表明我们的方法不适合于从在油和蛋白质差组织的RNA分离。因此,该方法仅用于RNA的从含有油,蛋白质和多酚,如种子和果实组织的隔离是有利的。

总的来说,我们的方法是合适的,用于获取从植物种子高度纯化的RNA,无需使用酚,氯仿或其他进程的用于RNA纯化。这种方法将有利于在籽基因表达的更精确的分析。

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Acknowledgments

我们感谢功能基因组学基金和光谱法和生物成像设备,涅槃核心研究设施,以及植物型研究设施,涅槃生物资源中心的工作人员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904
polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P5288-100G
HOMOGENIZER S-303 AS ONE 1-1133-02
NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) TAKARA RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit Kapa biosystems KK4601

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References

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Tags

生物化学,第119,植物种子,RNA分离,定量实时PCR,
对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法
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Cite this Article

Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M.More

Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M. An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55008, doi:10.3791/55008 (2017).

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