Introduction
Planten produceren zaden, die aanleiding geven tot de volgende generatie te geven. Zaden accumuleren van grote hoeveelheden opslagreserves, zoals oliën, koolhydraten en eiwitten, na kiemkracht groei. Mensen maken gebruik van zaad opslag reserves als bron van levensmiddelen en diervoeders, en dus plantenzaden zijn een van de belangrijkste leveranciers van eetbare organische stof wereldwijd. Het verhogen van zaad opbrengst is een belangrijke uitdaging in de plantkunde.
Sinds zaad opslag reserves zijn in de handel waardevolle bronnen van voedsel en industriële materialen, hebben de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van het metabolisme van deze reserves op grote schaal onderzocht 1-6. Verder ophelderen van deze mechanismen nuttig zijn voor het verhogen van zaadopbrengst in gewassen. Zaden ontwikkelen fabriek eierstokken na de bevruchting, en ze volwassen worden door middel van een reeks van ontwikkelingsstadia 1,6,7. Verder inzicht in de moleculaire mechanisme onderliggende zaad ontwikkeling vereist gedetailleerdeNauwkeurige genexpressieprofielen van een aantal ontwikkelende zaden te produceren. De grote hoeveelheden van oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in plantenzaden bemoeilijken sterk gezuiverd RNA, dat nauwkeurige profilering van genexpressie uitsluit isoleren.
Hier introduceren we een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit oliezaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen. Bij deze methode zal onderzoekers kunnen sterk gezuiverde RNA te bereiden. Dergelijke RNA zal nuttig zijn voor het bewaken van transcriptionele veranderingen in de belangrijkste genen regelen van de metabole regulatie van het zaad opslag reserves in het ontwikkelen en volwassen oliehoudende zaden zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extractie van Totaal RNA van Plant Seeds
- Bereid buffer sets, spinkolommen, 1,5 en 2,0 ml polypropyleen buizen en nuclease-vrij 1,5 ml polypropyleen buizen.
- Voeg 1% (w / v) moleculaire biologie graad polyvinylpyrrolidon (hierna PVP) met lysisbuffer cel voor RNA-extractie en vortex krachtig. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C tot volledig oplossen. Na 20 min incubatie meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven om de vorming van bellen te voorkomen. Bewaren bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor gebruik.
- Oogst fruit uit Arabidopsis thaliana planten en plaats in 1,5 ml polypropyleen buizen op ijs. Plaats vruchten op aluminium platen bewaard bij 4 ° C en isoleren zaden uit de vruchten onder een stereomicroscoop.
- Plaats de zaden geïsoleerd (ongeveer 200 zaden) in 1,5 ml polypropyleen buizen die zijn opgeslagen in een aluminium rek op ijs en onmiddellijk in zijn buizen in vloeibare nitrogen.
- Verwijder de buizen uit de vloeibare stikstof en terug te geven aan de aluminium rek op ijs. Voeg 100 pi van de buffer die 1% PVP en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 xg bij 4 ° C.
- Homogeniseren van het monster met een roestvrijstalen stamper met een motor-slijper voor 60 s terwijl de buis in de aluminium rek op ijs.
- Voeg 550 pi van de buffer die 1% PVP, meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8000 xg bij 25 ° C en overdracht 550 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 xg bij 25 ° C en overdracht 450 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis.
- Gebruik het supernatant als het cellysaat voor RNA-extractie. Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de handel verkrijgbare kit.
- Elueer deRNA met behulp van een minimaal volume van de elutiebuffer om een voldoende hoge concentratie van RNA te zorgen voor de bewaking van de expressie patronen van de lage niveau transcripten. Bewaar het RNA in een vrieskast tot gebruik.
2. Verificatie van RNA Quality
- Ontdooi de totale RNA, meng door zachtjes te tikken, en plaats de buis in een aluminium rack op ijs.
- Meet de RNA-concentratie, A260 / A280-verhouding, en A260 / A230-verhouding met behulp van een microvolume spectrofotometer.
- Verdun het totale RNA in RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 70 ng / ul.
3. Reverse transcriptie van totaal RNA van zaden
- Ontdooi de totale RNA en buffer sets van het commerciële kit. Houd de enzymen uit de kit op ijs na zachtjes te tikken. Bereid nuclease-vrij 0,2 ml polypropyleen buizen.
- Voeg 5 ul totaal RNA, 1 pl Oligo dT primer (50 uM), en 1 pM van willekeurige 6-mer (50 uM) aan de 0,2 ml polypropeenlene buis op ijs.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C en plaats op ijs.
- Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de reverse transcriptie-PCR kit.
- Plaats de reverse transcriptie producten op ijs voor gebruik.
4. Kwantitatieve real-time PCR-analyse
- Construct plasmiden die het doelgen sequenties behulp protocol van de fabrikant.
- Stel de concentraties 100-500,000 kopieën / ul voor DNA-matrijzen voor de standaard curves.
- Verdun de cDNA oplossing (1: 100) met gedestilleerd water.
- Voeg 2 pi van de verdunde oplossingen cDNA en de plasmiden voor de standaard curves de master mix van de kwantitatieve real-time PCR kit.
- Opgericht real-time PCR met de volgende cyclingcondities: 95 ° C gedurende 30 s en vervolgens 40 cycli bij 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 35 s.
- Analyseer de kopie nummers volgens de manbrikant van instructies voor de real-time PCR systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerst onderzoek gedaan naar de optimale concentratie van PVP gebruik van Arabidopsis rijpe zaden. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 1000 zaden volgens bovenstaande behulp cellysis buffer die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% of 2,0% PVP beschreven protocol. Na homogenisatie en centrifugatie werd het supernatant verzameld met vermijding van de olielaag en zaden afval (Figuur 1A).
Figuur 1: Schatting van de optimale concentratie polyvinylpyrrolidon in de cellysis buffer. Totaal RNA werd geëxtraheerd met de cellysis buffer met verschillende concentraties van PVP. (A) Een foto van de zaden na homogenisatie en centrifugatie. (B) De grafieken van absorptiegolflengte voor elk monster zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hoeveelheid en zuiverheid van het geïsoleerde RNA's werden geschat uit de grafiek van absorptiegolflengte (Figuur 1B), waaruit bleek dat 1,0% PVP was de meest effectieve concentratie voor het isoleren van grote hoeveelheden RNA gezuiverd uit zaden.
Ontwikkelende zaden werden uit Arabidopsis thaliana vruchten op voorgekoeld aluminium platen op ijs onder een stereomicroscoop (Figuren 2A, 2B). De zaden werden gehomogeniseerd met een roestvrij stalen stamper en motor-molen in een buis op een aluminium rooster op ijs (figuren 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figuur 2: Isolatie en homogenisering van ontwikkelende zaden van Arabidopsis thaliana. Ontwikkelende zaden zijn geïsoleerd van fruit op een koude aluminium plaat onder een stereomicroscoop (A). Vruchtbladen worden afgepeld van de pedikel (B) en ontwikkelende zaden worden verzameld. De zaden worden gehomogeniseerd in lysisbuffer die 1% (w / v) polyvinylpyrrolidon met een roestvrijstalen stamper (C) in buizen in een aluminium rack gekoeld op ijs (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Totaal RNA werd geïsoleerd uit de zaden bij 4, 8 en 12 dagen na de bloei (hierna DAF) in onze nieuw ontwikkelde methode of de conventionele methode. De concentraties, A260 / A280 verhoudingen en A260 /A230 verhoudingen van RNA geïsoleerd uit 200 zaden worden weergegeven in tabel 1.
| Methode | DAF | RNA-concentratie | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Conventioneel | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1.90 ± 0.02 | 2.27 ± 0.06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1.40 ± 0.17 | |
| 12 | 4.9 ± 1.7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| nieuwe | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2.15 ± 0.05 | 2.23 ± 0.09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2,09 ± 0,04 | 2.17 ± 0.07 |
Tabel 1: Concentraties, A260 / A280 verhoudingen en A260 / A230 verhoudingen van RNA geïsoleerd uit Arabidopsis zaden. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 200 zaden (190-206 zaden) bij 4, 8 en 12 DAF met de conventionele methode of nieuw ontwikkelde methode. Het RNA concentraties A260 / A280 verhoudingen en A260 / A230 verhoudingen werden gemeten. De waarden geven gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten.
De resultaten tonen dat onze methode konden wij sterk gezuiverde RNA te isoleren uit 8 en 12 DAF zaden. Het totale RNA werd aan omgekeerde transcriptie tot cDNA, en de cDNA oplossingen werden 100-voudig verdund. De kopie aantallen WRI1 (GERIMPELDE 1: AT3G54320), SDP1 (SUIKER DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup> en EIF3K (eukaryotische translatie-initiatie factor 3K: AT4G33250) als een interne controle 8 werden gemeten en de relatieve hoeveelheden van de transcripten werden geschat door kwantitatieve real-time PCR-analyses (figuur 3).
Figuur 3: Kwantificering van lage transcripten in ontwikkelende zaden. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 4, 8 en 12 DAF zaden met behulp van onze werkwijze en cDNA werden bereid. De relatieve hoeveelheden van WRI1 (A) en SDP1 (B) transcripten werden gemeten door kwantitatieve real-time PCR. EIF3K werd gebruikt als een interne controle. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde SD van drie onafhankelijke experimenten. DAF; dagen na de bloei. Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hoewel de hoeveelheden WRI1 en SDP1 transcripten relatief weinig ontwikkelende zaden, was het mogelijk om veranderingen expressie tussen de zaden in verschillende ontwikkelingsstadia detecteren. Controleren of onze werkwijze kan worden toegepast in andere oliezaden werd totaal RNA geïsoleerd uit rijpe zaden van Brassica napus en Glycine max. Het RNA concentraties A260 / A280 verhoudingen en A260 / A230 verhoudingen worden getoond in Tabel 2.
| Methode | Fabriek | RNA-concentratie | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Conventioneel | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1.5 ± 0.12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| nieuwe | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| G. max | 152,3 ± 4.4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
Tabel 2: Concentraties, A260 / A280 verhoudingen, en A260 / A230 verhoudingen van RNA geïsoleerd uit rijpe zaden van Brassica napus en Glycine max. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 100 mg van Brassica napus en Glycine max zaden met de gebruikelijke methode of nieuw ontwikkelde methode. De zaden voorheen geplet en ongeveer gehomogeniseerd met mortier en stamper in vloeibare stikstof gekoeld. Het RNA concentraties A260 / A280 verhoudingen, en A260 / A230 verhoudingen werden gemeten. De waarden geven gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genexpressieprofielen bijdragen aan ons begrip van plantenfysiologie; Daarom zijn specifieke RNA isolatiemethoden ontwikkeld voor elk monster staat 9-12. Onderzochten we de processen die tijdens de RNA-isolatie werden geremd uit zaden en vond dat RNA binding aan silica membranen was ernstig geremd. Grote hoeveelheden olie, eiwitten en polyfenolen remmen RNA-isolatie. We pasten de RNA-extractiewerkwijze om deze verbindingen te verwijderen met een lysisoplossing voor het proces van RNA binding aan silica membranen. De belangrijkste wijzigingen waren de toevoeging van 1% PVP (stap 1,2) en het verzamelen van de supernatant van gecentrifugeerde lysisoplossing (stap 1,7, 1,8). Het doel van de toevoeging van 1% PVP is polyfenolen verwijdert. Onderzochten we de meest effectieve concentratie van PVP te gebruiken en bevestigde dat 1% PVP is de meest effectieve concentratie voor dit proces. Als doel het verzamelen van de supernatant van gecentrifugeerde lysisoplossingis om olie en eiwitten te verwijderen. De bovenstaande vloeistof moet zorgvuldig worden verzameld om te voorkomen dat het behoud van een olielaag in het supernatant en het pellet in de buis. Deze twee eenvoudige wijzigingen drastisch verbeterd herstel, A260 / A280 verhoudingen en A260 / A230 verhoudingen van het geïsoleerde RNA uit zaden in het midden en late fasen van ontwikkeling (tabel 1).
Onze methode, waarbij een eenvoudige manipulatie standaardprotocol vertegenwoordigt, gebruikt in de handel verkrijgbare kits voor RNA-isolatie. Aldus onze methode is praktisch voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden zonder dat omslachtige extra stappen zoals fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie middels lithiumchloride. Onze werkwijze is ook effectief voor gebruik met volwassen raapzaad en sojaboon zaden (Tabel 2), wat aangeeft dat de wijzigingen werken goed voor olie- en eiwitrijke plantaardige zaden. Het RNA herstel tarieven van 4 DAF zaden (tabel 1) en jonge wortels, bladeren en stengels waren lager in onze werkwijze, wat aangeeft dat onze methode is niet geschikt voor RNA isolatie van weefsels die arme olie en eiwitten. Derhalve is de werkwijze voordelig alleen voor de isolatie van RNA uit weefsels die olie, eiwitten en polyfenolen, zoals zaden en vruchten.
Algemeen is de werkwijze geschikt voor het verkrijgen van zeer gezuiverde RNA uit plantenzaden zonder het gebruik van fenol, chloroform of aanvullende werkwijzen voor RNA-zuivering. Deze methode zal nauwkeuriger profilering van genexpressie in zaden bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken het personeel van Functional Genomics Facility en spectrografie en Bio-imaging Facility, Nibb Core Onderzoeksfaciliteiten en Model Plant Research Facility, Nibb Bioresource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
