Introduction
צמחים מייצרים זרעים, אשר להצמיח את הדור הבא. זרעים לצבור כמויות גדולות של עתודות אחסון, כגון שמנים, פחמימות וחלבונים, לצמיחה שלאחר נביטה. בני אדם לנצל עתודות אחסון זרע כמקורות להאכיל במזון מן החי, ובכך זרעי צמחים הם אחד הספקים העיקריים של חומר אורגני אכיל ברחבי העולם. הגדלת תשואות זרע היא אתגר חשוב במדע צמח.
מאז עתודות אחסון הזרע הם מקורות בעלי ערך מסחרי של מזון וחומרים תעשייתיים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס רגולציה של חילוף החומרים של עתודות אלו נחקרו בהרחבה 1-6. להאיר עוד מנגנונים אלו יהיו שימושיים להגדלת תשואות זרע בגידולים. זרעים להתפתח השחלות צמח לאחר הפריה, והם בשלים דרך סדרה של שלבי התפתחות 1,6,7. בהמשך להבנת התפתחות הזרע הבסיסי המולקולרי מנגנון מחייב מפורט, פרופילי ביטוי גנים מדויקים מתוך סדרה של פיתוח זרעים להיות מיוצר. עם זאת, כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, פחמימות, ופוליפנולים זרעי צמחים להקשות לבודד RNA נקיים במיוחד, אשר מונע פרופיל מדויק של ביטוי גנים.
הנה, אנחנו מציגים שיטה יעילה בידוד RNA מן הבוטנים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, ופוליפנולים. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו להכין RNA הנקי במיוחד. RNA כזה יהיה שימושי עבור ניטור שינויים תעתיק בגנים מפתח שליטה על ויסות חילוף החומרים של עתודות אחסון זרע בפיתוח גרעיני שמן בוגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת RNA הכולל זרעי צמחים
- הכן סטים חיץ, עמודות ספין, 1.5 ו -2.0 צינורות פוליפרופילן מ"ל, ו -1.5 nuclease ללא צינורות פוליפרופילן מ"ל.
- הוסף 1% (w / v) polyvinylpyrrolidone כיתת ביולוגיה מולקולרית (להלן המכונה PVP) לתא חיץ תמוגה להפקת RNA ו מערבולת במרץ. דגירה במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס לחלוטין. לאחר 20 דקות הדגירה, לערבב בעדינות למאגר על ידי סיבוב הצינור במהופך כדי למנוע היווצרות של בועות. אחסן בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש.
- פירות קציר מצמחים ארבידופסיס thaliana ומכניסים 1.5 צינורות פוליפרופילן מ"ל על הקרח. פירות מקום על צלחות אלומיניום שמרו על 4 מעלות צלזיוס ולבודד זרעים מפירות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- מניח את הזרעים המבודדים (כ -200 זרעים) לתוך 1.5 צינורות פוליפרופילן מיליליטר שאוחסנו במעמד אלומיניום על קרח ומייד ומקום צינורות n הנוזלitrogen.
- הסר את הצינורות מן החנקן הנוזלי ולהחזירם מתלים אלומיניום על קרח. הוספת 100 μL של למאגר המכיל 1% PVP ו צנטריפוגות דקות 1 XG ב 1000 ב 4 ° C..
- Homogenize מדגם עם עלי נירוסטה באמצעות מטחנת מנוע עבור 60 s, תוך שמירה על הצינור מתל אלומיניום על קרח.
- להוסיף 550 μL של למאגר המכיל 1% PVP, מערבב את החיץ בעדינות על ידי סיבוב הצינור במהופך, דגירה במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 8000 XG ב 25 ° C, והעברת 550 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 XG ב 25 ° C, והעברת 450 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
- השתמש supernatant ככל lysate התא להפקת RNA. מכאן והלאה, בצע את ההליך מתואר להוראות היצרן בערכה הזמינה המסחרי.
- elute אתRNA באמצעות היקף מינימלי של חיץ elution כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק של RNA לניטור דפוסי הביטוי של תמלילי ברמה נמוכה. אחסן את RNA במקפיא עמוק עד בשימוש.
2. אימות של RNA איכות
- ההפשרה RNA הכולל, ומערבבים על ידי הקשה עדינה, ובמקום הצינור במעמד אלומיניום על הקרח.
- למדוד את ריכוז RNA, יחס A260 / A280, ויחס A260 / A230 באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume.
- לדלל את RNA המוחלט במי RNase ללא לריכוז סופי של 70 ng / μL.
3. שעתוק לאחור של RNA סה"כ מזרעים
- הפשרת סטי רנ"א חיץ המוחלט מן הערכה המסחרית. שמור על אנזימים מתוך הערכה על הקרח לאחר הקשה עדינה. הכן צינורות פוליפרופילן מ"ל 0.2 nuclease חינם.
- הוסף 5 μL של רנ"א הכל, 1 μL של אוליגו פריימר dT (50 מיקרומטר), ו -1 מיקרומטר של Random 6-mer (50 מיקרומטר) ל -0.2 פוליפרופילן מ"לצינור Lene על הקרח.
- דגירה במשך 15 דקות ב 37 ºC ומניחים על קרח.
- מכאן והלאה, בצע את ההליך המתואר להוראות היצרן בערכה שעתוק-PCR הפוך.
- מניחים את מוצרי שעתוק לאחור על הקרח לפני השימוש.
4. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת
- Construct פלסמידים מחסה רצפי גני היעד באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
- התאם את ריכוזי 100-500,000 עותקים / μL עבור תבניות DNA עבור עקומות סטנדרטיות.
- לדלל את פתרונות cDNA (1: 100) עם מים מזוקקים.
- הוסף 2 μL של פתרונות cDNA מדולל פלסמידים עבור עקומות סטנדרטיות מיקס מאסטר מתוך הערכה PCR כמותי בזמן אמת.
- הגדרת PCR בזמן אמת באמצעות התנאים אופניים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולאחר מכן 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות.
- לנתח את מספרי העותק פי דבריו של האישההוראות של ufacturer עבור מערכת ה- PCR בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו ראשונים חקרנו את הריכוז האופטימלי של PVP באמצעות זרעים ארבידופסיס בוגרים. RNA סה"כ היה מבודד מכ -1,000 זרעים לפי הפרוטוקול שתואר לעיל באמצעות חיץ תא תמוגה המכיל 0%, 0.25%, 0.5%, 1.0% או 2.0% PVP. לאחר המגון צנטריפוגה, supernatant נאסף תוך הימנעות שכבת שמן ופסולת זרע (איור 1 א).
איור 1: הערכת ריכוז polyvinylpyrrolidone האופטימלי למאגר תא תמוגה. RNA סה"כ היה חילוץ עם למאגר תא תמוגה המכיל ריכוזים שונים של PVP. (א) תצלום של זרעים לאחר המגון ו צנטריפוגה. (ב) הגרפים של ספיגת אורך גל עבור כל דגימה מסומנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכמויות והטוהר של RNAs מבודד נאמדו מהגרף של ספיגת אורך הגל (איור 1B), אשר הראה כי 1.0% PVP היה ריכוז יעיל ביותר של בידוד כמויות גדולות של RNA מטוהרים מן הזרעים.
זרעים פיתוח בודדו פירות ארבידופסיס thaliana על צלחות אלומיניום מראש צונן על הקרח תחת סטראו (איורים 2A, 2B). הזרעים היו הומוגני עם עלי נירוסטת מטחנת מנוע בתוך שפופרת על מתל אלומיניום על קרח (2C הדמוי, 2D).
2.jpg "/>
איור 2: בידוד המגון לפתח זרעים של thaliana ארבידופסיס. זרעי פיתוח מבודדים פרות על צלחת אלומיניום קרה תחת סטראו (א). Carpels הם קלופים מן pedicle (B), וזרעים בפיתוח נאספים. הזרעים הומוגני חיץ תמוגה המכיל 1% (w / v) polyvinylpyrrolidone באמצעות עלי נירוסטה (C) צינורות במעמד אלומיניום המקורר על הקרח (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
RNA סה"כ היה מבודד מן הזרעים ב 4, 8, ו -12 ימים לאחר הפריחה (המכונה להלן בשם DAF) בשיטה החדשה שפותחה שלנו או בשיטה הקונבנציונלית. הריכוזים, A260 / A280 יחסי, ו A260 /יחסי A230 של RNA שבודד 200 זרעים מוצגים בלוח 1.
| שִׁיטָה | DAF | ריכוז RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| מוּסכָּם | 4 | 72.4 ± 7.4 | 1.90 ± 0.02 | 2.27 ± 0.06 |
| 8 | 10.8 ± 3.0 | 1.50 ± 0.08 | 1.40 ± 0.17 | |
| 12 | 4.9 ± 1.7 | 1.57 ± 0.10 | 0.76 ± 0.18 | |
| חָדָשׁ | 4 | 63.7 ± 2.6 | 2.10 ± 0.08 | 2.29 ± 0.03 |
| 8 | 46.3 ± 4.9 | 2.15 ± 0.05 | 2.23 ± 0.09 | |
| 12 | 41.77; 3.1 | 2.09 ± 0.04 | 2.17 ± 0.07 |
טבלה 1: ריכוז, A260 / A280 יחסי, ו A260 / A230 יחס של RNA שבודד זרעים ארבידופסיס. RNA סה"כ היה מבודד מכ 200 זרעים (מ 190 כדי 206 זרעים) בשעה 4, 8, ו -12 DAF בשיטה המקובלת או השיטה החדשה שפותחת שלנו. ריכוזי RNA, A260 / A280 היחסי, ו A260 / A230 היחס נמדדו. הערכים מייצגים SD ± ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים.
התוצאות מראות כי השיטה שלנו אפשרה לנו לבודד RNA הנקי במיוחד מ 8 ו -12 זרעי DAF. RNA הכולל היה הפוך-עבד כדי cDNA, ואת פתרונות cDNA דוללו פי 100. מספרי העותק של WRI1 (מקומט 1: AT3G54320), SDP1 (הסוכר DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup>, ו EIF3K (גורם ייזום תרגום אוקריוטים 3K: AT4G33250) בקרה פנימית 8 נמדדו, ואת הכמויות היחסיות של תמלילי נאמדו על ידי בזמן אמת PCR כמותי מנתח (איור 3).
איור 3: כימות של תמלילי רמה נמוכים זרעים מתפתחים. RNA סה"כ היה שחולצו מן 4, 8, ו -12 זרעים DAF בשיטה שלנו, ופתרונות cDNA הוכנו. הכמויות היחסיות של WRI1 (א) ו SDP1 (B) תמלילי נמדדו על ידי PCR כמותי בזמן אמת. EIF3K שמש בקרה פנימית. ערכים מייצגים אומרים SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים. DAF; ימים לאחר הפריחה. אנא לחץ הואמחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
למרות הסכומים של תמלילי WRI1 ו SDP1 נמוכים יחסית בזרעים פיתוח, ניתן היה לזהות שינויים ביטוי בין הזרעים בשלבים התפתחותיים שונים. כדי לוודא כי השיטה שלנו יכולה להיות מנוצלת בוטנים אחרים, RNA הכולל היה מבודד מזרעים בוגרים של napus Brassica ו גליצין מקסימום. ריכוזי RNA, A260 / A280 היחסי, ו A260 / A230 היחס מוצגים בלוח 2.
| שִׁיטָה | צמח | ריכוז RNA | A260 / A280 | A260 / A230 |
| מוּסכָּם | ב napus | 7.7 ± 0.8 | 1.5 ± 0.12 | 0.75 ± 0.11 |
| ג מקסימום | 1.61 ± 0.06 | 0.69 ± 0.09 | ||
| חָדָשׁ | ב napus | 143.2 ± 19.0 | 2.17 ± 0.03 | 2.23 ± 0.13 |
| ג מקסימום | 152.3 ± 4.4 | 2.17 ± 0.02 | 2.30 ± 0.02 |
טבלה 2: ריכוזים, A260 / A280 יחסי, ו A260 / A230 יחס של RNA שבודד זרעים בשלים של napus Brassica ו גליצין מקסימום. RNA סה"כ היה מבודד מכ 100 מ"ג של napus Brassica וזרעי מקסימום גליצין בשיטה המקובלת או השיטה החדשה שפותחת שלנו. הזרעים היו כתוש בעבר בערך הומוגני עם ובמכתש מקורר בחנקן נוזלי. ריכוזי RNA, A260 / A280 יחסים, ויחסי A260 / A230 נמדדו. הערכים מייצגים SD ± ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרופילי ביטוי גנים לתרום להבנתנו פיזיולוגית צמח; ולכן, שיטות בידוד הספציפי RNA פותחו עבור כל דגימת מצב 9-12. חקרנו את התהליכים עוכבו במהלך בידוד RNA מזרעים ומצא כי RNA מחייב ממברנות סיליקה היה עכבות קשות. כמויות גדולות של שמן, חלבונים, ופוליפנולים לעכב בידוד RNA. שינינו את תהליך החילוץ RNA להסיר תרכובות אלה עם פתרון תמוגה לפני תהליך של RNA מחייב ממברנות סיליקה. מהשינויים המהותיים הכלולים תוספת של 1% PVP (שלב 1.2) ואת אוסף של supernatant מפתרון תמוגה centrifuged (שלבים 1.7, 1.8). מטרת התוספת של 1% PVP היא להסיר פוליפנולים. בדקנו את הריכוז היעיל ביותר של PVP להשתמש ואשרתי כי 1 PVP% הוא הריכוז היעיל ביותר עבור תהליך זה. מטרת איסוף supernatant מפתרון תמוגה centrifugedשמן וחלבונים הוא להסיר. את supernatant יש לאסוף בזהירות כדי למנוע שמירת שכבת שמן supernatant ו גלולה בצינור. שינויים פשוטים אלה שני שיפרה את ההתאוששות באופן דרסטי, יחסי A260 / A280, ויחסי A260 / A230 של RNA בודד מזרעים באמצע שלבי מאוחר של הפיתוח (טבלה 1).
השיטה שלנו, אשר מייצגת שינוי פשוט של הפרוטוקול הסטנדרטי, משתמשת ערכות זמינות מסחרי עבור בידוד RNA. לכן, השיטה שלנו היא מעשית לבידוד RNA נקיים במיוחד מזרעים ללא צורך בצעדים נוספים מסורבל כגון מיצוי פנול-כלורופורם משקעים אתנול באמצעות ליתיום כלוריד. השיטה שלנו היא גם יעילה לשימוש עם לפתית בוגרת וזרעי סויה (טבלה 2), המציין כי השינויים לעבוד גם עבור זרעי יבול נפט כבלים ו עשיר בחלבון. שיעורי ההחלמה RNA מ -4 זרעים DAF (טבלה 1) ושורש צעיריםים, עלים וגבעולים היו נמוכים בשיטה שלנו, המציין כי השיטה שלנו אינה מתאימה בידוד RNA מרקמות כי הם עניים בשמן וחלבונים. לכן, השיטה היא יתרון רק עבור בידוד של RNA מרקמות המכיל שמן, חלבונים, פוליפנולים, כגון זרעים ופירות.
בסך הכל, בשיטה שלנו הוא מתאים רכישת RNA מטוהרים מן זרעי צמחים ללא שימוש פנול, כלורופורם, או תהליכים נוספים לטיהור RNA. שיטה זו תאפשר פרופיל מדויק יותר של ביטוי גנים זרעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות של מתקן Genomics פונקציונלית מתקן Spectrography ו bioimaging, אמצעי מחקר Core NIBB, מתקן מחקר הצמח דגם, מרכז Bioresource NIBB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
