Introduction
Växter producerar frön, som ger upphov till nästa generation. Frön samlas stora mängder lagringsreserver, såsom oljor, kolhydrater och proteiner, för post germinativa tillväxt. Människor använder utsäde lagringsreserver som källor till livsmedel och foder, och därmed frön är en av de största leverantörerna av ätliga organiskt material i världen. Ökad utsäde avkastningen är en viktig utmaning i växtlära.
Eftersom lagring av utsäde reserver är kommersiellt värdefulla källor av mat och industriella material, de molekylära mekanismerna bakom regleringen av metabolismen av dessa reserver har i stor utsträckning undersökt 1-6. Ytterligare belysa dessa mekanismer kommer att vara användbart för att öka utsädes avkastning på grödor. Frön utvecklas i växt äggstockar efter befruktningen, och de mognar genom en rad utvecklingsstadier 1,6,7. Vidare förstå den molekylära mekanismen underliggande frö utveckling kräver detaljerad, Precisa genuttrycksprofilerna från en serie av utvecklande frön som skall framställas. Emellertid de höga mängder av oljor, proteiner, kolhydrater och polyfenoler i växtfrön gör det svårt att isolera högrenat RNA, vilket utesluter noggrann profilering av genuttryck.
Här presenterar vi en effektiv metod för RNA-isolering från oljeväxter som innehåller stora mängder av oljor, proteiner och polyfenoler. Med denna metod, kommer forskarna att kunna förbereda högrenat RNA. Sådant RNA kommer att vara användbar för att övervaka transkriptions förändringar i viktiga gener som styr den metaboliska regleringen av lagring av utsäde reserver för att utveckla och mogna oljeväxter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utvinning av Total RNA från växtfrön
- Förbered buffertuppsättningar, spinnkolonner, 1,5 och 2,0 ml polypropenrör och nukleasfria 1,5 ml polypropylenrör.
- Lägg 1% (vikt / volym) molekylärbiologi grade polyvinylpyrrolidon (hädanefter kallad PVP) till cell-lys-buffert för RNA-extraktion och skaka kraftigt. Inkubera i 20 minuter vid 25 ° C för fullständig upplösning. Efter 20 minuters inkubation, blanda bufferten försiktigt genom att vända röret upp och ned för att förhindra bildning av bubblor. Förvara vid rumstemperatur (15-25 ° C) före användning.
- Harvest frukter från Arabidopsis thaliana-plantor och plats i 1,5 ml polypropenrör på is. Placera frukter på aluminiumplåtar hölls vid 4 ° C och isolera frön från frukter under ett stereomikroskop.
- Placera isolerade frön (ca 200 frön) i 1,5 ml polypropenrör som har lagrats i en aluminiumställ på is och omedelbart placera rören i flytande nitrogen.
- Avlägsna rören från det flytande kvävet och återlämna dem till aluminium rack på is. Tillsätt 100 mikroliter av bufferten innehållande 1% PVP och centrifugera under 1 min vid 1000 xg vid 4 ° C.
- Homogenisera provet med en stålmortelstöt rostfritt användning av en motor-kvarn i 60 s och samtidigt hålla röret i aluminium rack på is.
- Lägga 550 mikroliter av bufferten innehållande 1% PVP, blanda bufferten försiktigt genom att vända röret upp och ned, och inkubera i 10 minuter vid 25 ° C.
- Centrifugera i 5 minuter vid 8000 xg vid 25 ° C och överföring 550 mikroliter av supernatanten till ett nytt 1,5 ml polypropylenrör.
- Centrifugera i 5 minuter vid 10.000 xg vid 25 ° C och överföring 450 mikroliter av supernatanten till ett nytt 1,5 ml polypropylenrör.
- Använda supernatanten som cellysatet för RNA-extraktion. Härefter följer du proceduren som beskrivs i tillverkarens anvisningar i den kommersiellt tillgängliga kit.
- elueraRNA med hjälp av en minimivolym av elueringsbufferten för att säkerställa en tillräckligt hög koncentration av RNA för övervakning av uttrycksmönstret för låg transkript nivå. Lagra RNA i en frys fram till användningen.
2. Kontroll av RNA Kvalitet
- Tina totalt RNA, blanda genom försiktig knackning och placera röret i en aluminiumställ på is.
- Mät RNA-koncentrationen, A260 / A280 förhållande, och A260 / A230 förhållande med hjälp av en microvolume spektrofotometer.
- Späd ut den totala RNA i RNas-fritt vatten till en slutlig koncentration av 70 ng / | il.
3. Omvänd transkription av total RNA från frön
- Tina totalt RNA och buffertuppsättningar från kommersiellt kit. Håll enzymer ur satsen på is efter försiktigt packas. Förbereda nukleasfria 0,2 ml polypropylenrör.
- Tillsätt 5 mikroliter av totalt RNA, 1 mikroliter av Oligo dT-primer (50 | iM) och 1 | iM av Random 6-mer (50 ^ M) till 0,2 ml polypropylenlene röret på is.
- Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C och placera på is.
- Härefter följer du proceduren som beskrivs i tillverkarens anvisningar i omvänd transkription-PCR-kit.
- Placera de omvända transkriptionsprodukter på is före användning.
4. Kvantitativ realtids-PCR-analys
- Konstruera plasmider som härbärgerar de mål-gensekvenser med användning av tillverkarens protokoll.
- Justera koncentrationen till 100-500,000 kopior / mikroliter för DNA-mallar för standardkurvorna.
- Späd cDNA lösningarna (1: 100) med destillerat vatten.
- Tillsätt 2 mikroliter av de utspädda cDNA lösningar och plasmider för standardkurvorna till Master Mix från de kvantitativa realtids-PCR-kit.
- Inrättat realtids-PCR med användning av följande cykelbetingelser: 95 ° C i 30 s och därefter 40 cykler vid 95 ° C under 5 s och 60 ° C under 35 s.
- Analysera antalet kopior enligt mannenfrån tillverkaren instruktioner för realtids-PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi undersökte först den optimala koncentrationen av PVP med hjälp av Arabidopsis mogna frön. Totalt RNA isolerades från approximativt 1000 frön enligt det protokoll som beskrivits ovan med användning cell lysbuffert innehållande 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% eller 2,0% PVP. Efter homogenisering och centrifugering, uppsamlades supernatanten och samtidigt undvika oljeskiktet och utsädes skräp (Figur 1A).
Figur 1: Uppskattning av den optimala polyvinylpyrrolidon koncentrationen i cellen lyseringsbuffert. Totalt RNA extraherades med cell lysbuffert innehållande olika koncentrationer av PVP. (A) Ett fotografi av fröna efter homogenisering och centrifugering. (B) De grafer av våglängds absorbansen för varje prov är angivna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mängderna och renheten av de isolerade RNA uppskattades från grafen i våglängds absorbansen (Figur 1B), som visade att 1,0% PVP var den mest effektiva koncentrationen för att isolera stora mängder av renat RNA från frön.
Utvecklande frön isolerades från Arabidopsis thaliana frukter på förhand kylda aluminiumplattor på is under ett stereomikroskop (figurerna 2A, 2B). Fröna homogeniserades med en rostfri mortelstöt stål och motor-kvarn i ett rör på en aluminium rack på is (figurerna 2C, 2D).
2.jpg "/>
Figur 2: Isolering och homogenisering av att utveckla frön av Arabidopsis thaliana. Utvecklande frön är isolerade från frukter på en kall aluminiumplatta under ett stereomikroskop (A). Carpels skalas från pediclen (B), och utvecklande frön samlas. Fröna homogeniseras i lyseringsbuffert innehållande 1% (vikt / volym) polyvinylpyrrolidon med användning av en rostfri stålmortelstöt (C) i rör i en aluminiumställ kyldes på is (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Totalt RNA isolerades från frön på 4, 8 och 12 dagar efter blomning (hädanefter kallad DAF) med hjälp av vår nyligen utvecklade metoden eller den konventionella metoden. Koncentrationerna, A260 / A280 kvoter, och A260 /A230 förhållanden av RNA isolerat från 200 frön visas i tabell 1.
| Metod | DAF | RNA-koncentration | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konventionell | 4 | 72,4 ± 7,4 | 1,90 ± 0,02 | 2,27 ± 0,06 |
| 8 | 10,8 ± 3,0 | 1,50 ± 0,08 | 1,40 ± 0,17 | |
| 12 | 4,9 ± 1,7 | 1,57 ± 0,10 | 0,76 ± 0,18 | |
| Ny | 4 | 63,7 ± 2,6 | 2,10 ± 0,08 | 2,29 ± 0,03 |
| 8 | 46,3 ± 4,9 | 2,15 ± 0,05 | 2,23 ± 0,09 | |
| 12 | 41,77; 3,1 | 2,09 ± 0,04 | 2,17 ± 0,07 |
Tabell 1: koncentrationer, A260 / A280 grader, och A260 / A230 kvoter av RNA isolerat från Arabidopsis frön. Totalt RNA isolerades från ungefär 200 frön (från 190 till 206 frön) vid 4, 8, och 12 DAF med den konventionella metoden eller vår nyligen utvecklade metoden. RNA-koncentrationer, A260 / A280 förhållanden och A260 / A230-förhållanden uppmättes. Värden representerar medelvärde ± SD för tre oberoende experiment.
Resultaten visar att vår metod det möjligt för oss att isolera högrenat RNA från 8 och 12 DAF frön. Den totalt RNA transkriberades omvänt till cDNA och cDNA-lösningarna späddes 100-faldigt. Kopieringsnummer WRI1 (skrynkliga 1: AT3G54320), SDP1 (socker Beroende1: AT5G04040) 7 </ sup>, och EIF3K (eukaryot translationsinitiering faktor 3K: AT4G33250) som en intern kontroll 8 mättes och de relativa mängderna av transkripten uppskattades genom kvantitativ realtids-PCR-analyser (Figur 3).
Figur 3: Kvantifiering av låga transkript nivå i utvecklings frön. Totalt RNA extraherades från 4, 8, och 12 DAF frön med hjälp av vår metod, och cDNA-lösningar bereddes. De relativa mängderna av WRI1 (A) och SDP1 (B) transkript mättes med kvantitativ realtids-PCR. EIF3K användes som en intern kontroll. Värden representerar medelvärde ± SD för tre oberoende experiment. DAF; dagar efter blomningen. Klicka hanre att se en större version av denna siffra.
Även mängderna WRI1 och SDP1 transkript är relativt låg i utvecklande frön, var det möjligt att detektera uttryck förändringar mellan frön i olika utvecklingsstadier. För att verifiera att vår metod kan användas i andra oljeväxter, isolerades totalt RNA från mogna frön av Brassica napus och Glycine max. RNA-koncentrationer, A260 / A280-förhållanden, och A260 / A230-förhållanden visas i tabell 2.
| Metod | Växt | RNA-koncentration | A260 / A280 | A260 / A230 |
| Konventionell | B. napus | 7,7 ± 0,8 | 1,5 ± 0,12 | 0,75 ± 0,11 |
| G. max | 1,61 ± 0,06 | 0,69 ± 0,09 | ||
| Ny | B. napus | 143,2 ± 19,0 | 2,17 ± 0,03 | 2,23 ± 0,13 |
| G. max | 152,3 ± 4,4 | 2,17 ± 0,02 | 2,30 ± 0,02 |
Tabell 2: koncentrationer, A260 / A280 grader, och A260 / A230 kvoter av RNA som isolerats från mogna frön av Brassica napus och Glycine max. Totalt RNA isolerades från ungefär 100 mg av Brassica napus och Glycine max frön med användning av den konventionella metoden eller vår nyligen utvecklade metoden. Fröna var tidigare krossats och ungefär homogeniserades med en mortel och mortelstöt kylda i flytande kväve. Den RNA-koncentrationer, A260 / A280-förhållanden och A260 / A230-förhållanden mättes. Värden representerar medelvärde ± SD för tre oberoende experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genuttrycksprofilerna bidra till vår förståelse av växtfysiologi, Därför har specifik RNA isoleringsmetoder utvecklats för varje prov tillstånd 9-12. Vi undersökte de processer som hämmades under RNA-isolering från frön och fann att RNA-bindning till kiselmembran var allvarligt hämmas. Stora mängder olja, proteiner och polyfenoler hämmar RNA-isolering. Vi ändrade RNA-extraktion för att avlägsna dessa föreningar med en lys lösning innan processen av RNA-bindning till kiselmembran. De viktiga ändringar ingår tillsats av 1% PVP (steg 1,2) och insamlingen av supernatanten från centrifugerade lys lösning (steg 1,7, 1,8). Syftet med tillsats av 1% PVP är att avlägsna polyfenoler. Vi undersökte den mest effektiva koncentrationen av PVP att använda och bekräftade att en% PVP är den mest effektiva koncentrationen för denna process. Syftet med att samla in supernatanten från centrifuger lys lösningär att avlägsna olja och proteiner. Supernatanten bör samlas noggrant för att undvika att behålla ett oljeskikt i supernatanten och pelleten i röret. Dessa två enkla ändringar drastiskt förbättrad återhämtning, A260 / A280 kvoter, och A260 / A230 kvoter av det isolerade RNA från frön på mitten och sena utvecklingsfaser (tabell 1).
Vår metod, som representerar en enkel modifiering av standardprotokollet, använder kommersiellt tillgängliga kit för RNA-isolering. Således är vår metod praktisk för att isolera högrenat RNA från frön utan behov av besvärliga ytterligare steg såsom fenol-kloroform-extraktion och etanolutfällning genom att använda litiumklorid. Vår metod är också effektiv för användning med mogen raps och sojabönor frön (tabell 2), vilket indikerar att de ändringar som fungerar bra för olje- och proteinrika vegetabiliska frön. RNA återvinningen från 4 DAF frön (tabell 1) och unga rots, blad och stjälkar var lägre med hjälp av vår metod, vilken indikerar att vår metod är inte lämplig för RNA-isolering från vävnader som är fattiga på olja och proteiner. Därför är metoden fördelaktig endast för isoleringen av RNA från vävnader som innehåller olje, proteiner och polyfenoler, såsom frön och frukter.
Totalt sett är vår metod som är lämplig för att förvärva högrenat RNA från växtfrön utan användning av fenol, kloroform, eller ytterligare processer för RNA-rening. Denna metod kommer att underlätta mer exakt profilering av genuttryck i frön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar personalen på funktionsgenomik Facility och spektrografi och Bioimaging Facility, NIBB huvudsakliga forskningslokaler, och modellväxten Research Facility, NIBB Bioresource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
