Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA'nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Published: January 11, 2017 doi: 10.3791/55008

Introduction

Bitkiler nesil doğuran tohum üretmek. Tohumlar, post-germinatif büyüme yağlar, karbohidratlar ve proteinler gibi depolama rezervlerinin büyük miktarda birikir. İnsanlar gıda ve hayvan yemi kaynağı olarak tohum depolama rezervleri kullanmak ve böylece bitki tohumları dünya çapında yenilebilir organik maddenin önemli tedarikçilerinden biri vardır. tohum verimi artan bitki biliminde önemli bir sorundur.

Tohum depolama rezervleri gıda ve endüstriyel malzemelerin ticari olarak değerli kaynaklar olduğundan, bu rezervlerin metabolizmasının düzenlenmesine altında yatan moleküler mekanizmalar yaygın 1-6 incelenmiştir. Bundan başka, bu mekanizmaların tanıtılması bitkileri tohum verimini artırmak için yararlı olacaktır. Tohumlar Döllenmeden sonra bitki yumurtalıklarda gelişir ve bunlar gelişim aşamaları 1,6,7 bir dizi olgun. Dahası, moleküler mekanizma yatan tohum gelişimini anlamak detaylı gerektirirTohum geliştirme bir dizi hassas gen ekspresyon profillerini üretilecek. Ancak, bitki tohumlarında yağlar, proteinler, karbohidratlar, ve polifenoller yüksek miktarlarda zor sentezlenmesinin hassas profil önleyen yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA izole etmek istiyorum.

Burada, sıvı yağlar, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda ihtiva eden yağlı tohumlardan RNA izolasyonu için etkili bir yöntem getirmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar yüksek derecede arıtılmış RNA'nın hazırlanması mümkün olacaktır. RNA geliştirilmesi ve olgun yağlı tohumlar tohum depo edilen metabolik kontrol düzenlenmesi önemli genlerin transkripsiyonel değişikliklerin izlenmesi için yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bitki tohumları toplam RNA'nın 1. Ekstraksiyon

  1. tampon setleri, spin sütunları, 1.5 ve 2.0 ml polipropilen tüpler ve nükleaz içermeyen 1.5 mL polipropilen tüpleri hazırlayın.
  2. (Ağırlık / hacim) (bundan sonra PVP olarak anılacaktır) moleküler biyoloji sınıf polivinilpirolidon kuvvetli RNA ekstraksiyonu ve vorteks için lizis tamponu hücre% 1 ekleyin. tamamen çözülmesi, 25 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin. 20 dakika inkübasyondan sonra, kabarcıkların oluşumunu önlemek için ters tüp çevirerek hafifçe tampon karıştırın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (15-25 ° C) muhafaza ediniz.
  3. Buz üzerinde 1.5 ml polipropilen tüpleri içinde Arabidopsis thaliana bitkileri ve yerden hasat meyveleri. alüminyum plakalar üzerine yerleştirin meyve 4 ° C'de muhafaza ve stereo mikroskop altında meyve tohumlarını izole.
    1. Sıvı n tüpleri hemen buz üzerine bir alüminyum rafın saklanan 1.5 ml polipropilen tüplere izole tohumları (yaklaşık olarak 200 tohum) yerleştirin veitrogen.
  4. sıvı azot tüpleri çıkarın ve buz üzerinde alüminyum raf onları geri. 4 ° C'de 1000 x g'de 1% 1 dakika için PVP ve santrifüj ihtiva eden tampon 100 ul ekle.
  5. Buz üzerinde, alüminyum rafın tüp tutulurken 60 saniye için bir motor-öğütücü kullanılarak paslanmaz çelik bir havan tokmağı ile homojenize örnek.
  6. % 1 PVP içeren tampon 550 mcL ters tüp çevirerek tampon hafifçe karıştırın ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
  7. 5 25 ° C'de 8000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 550 uL santrifüjleyin.
  8. 5 25 ° C'de 10,000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 450 uL santrifüjleyin.
  9. RNA ekstraksiyonu için hücre lizatı gibi süpernatant kullanın. Bundan sonra, piyasada mevcut olan kit üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
  10. ZehirRNA, düşük seviyede transkriptlerinin ekspresyonu kontrolü için RNA yeterince yüksek bir konsantrasyonunu sağlamak için elüsyon tamponunun minimum hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. kullanılıncaya kadar derin dondurucuda RNA saklayın.

RNA Kalite 2. Doğrulama

  1. Toplam RNA çözülme nazik dokunarak karıştırın ve buz üzerinde bir alüminyum rafa tüp yerleştirin.
  2. Bir microvolume spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu, A260 / A280 oranı ve A260 / A230 oranı ölçün.
  3. 70 ng / ml bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde toplam RNA seyreltilir.

Tohumlar toplam RNA'nın 3. Ters Transkripsiyon

  1. ticari kit toplam RNA ve tampon setleri çözülme. nazik dokunarak sonra buz üzerinde kiti enzimleri tutun. nükleaz içermeyen 0.2 ml polipropilen tüpleri hazırlayın.
  2. 0.2 mL Polipropilen 5 toplam RNA uL, 1 uL Oligo dT primeri (50 uM) ve 1 Random uM 6-mer (50 uM) ilavebuz üzerinde lene tüp.
  3. 37 ° C 'de 15 dakika boyunca inkübe ve buz üzerine yerleştirin.
  4. Bundan sonra, ters transkripsiyon-PCR kiti üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
  5. Kullanmadan önce buz üzerinde ters transkripsiyon ürünlerini yerleştirin.

4. Kantitatif Real-time PCR Analizi

  1. üreticinin protokolünü kullanarak, hedef gen dizilerini barındıran plasmidleri oluşturun.
  2. standart eğrileri için DNA şablonları 100-500,000 kopya / uJ'ye konsantrasyonları ayarlayın.
  3. damıtılmış suyla: cDNA çözümleri (100 1) seyreltin.
  4. 2 seyreltilmiş cDNA çözümleri uL ve kantitatif real-time PCR kiti master karışımı standart eğriler için plazmidler ekleyin.
  5. 30 sn için 95 ° C ve daha sonra 5 saniye boyunca 95 ° C 'de 40 döngü 35 sn için 60 ° C: Aşağıdaki bisiklet koşulları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ayarlayın.
  6. adama göre kopya sayısını analizGerçek zamanlı PCR sistemi olarak üreticinin talimatları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz ilk Arabidopsis olgun tohum kullanılarak PVP optimal konsantrasyonunu araştırdık. Toplam RNA,% 0,% 0.25,% 0.5,% 1.0 veya% 2.0 PVP içeren hücre parçalama tamponu kullanılarak, yukarıda tarif edilen protokole göre yaklaşık 1.000 tohumlardan izole edildi. Yağ tabakası ve tohum artıkları (Şekil 1A) kaçınarak homojenizasyon ve santrifüj sonrasında üst faz toplanmıştır.

Şekil 1
Şekil 1: hücre parçalama tamponu optimal polivinilpirolidon konsantrasyonunun tahmini. Toplam RNA, PVP farklı konsantrasyonlarını ihtiva eden hücre liziz tamponu ile ekstre edilmiştir. (A) homojenizasyon ve santrifüj sonrası tohum bir fotoğraf. (B) her bir numune için dalga boyu absorbans grafikleri gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Izole edilmiş RNA'lar miktarı ve saflık% 1.0 PVP tohumlardan saflaştınldı RNA büyük miktarda izole etmek için en etkili konsantrasyonu gösterdi dalga absorbans grafiği (Şekil 1B), tahmin edildi.

Gelişmekte olan tohumlar stereomikroskop (Şekiller 2A, 2B) altında buz üzerinde önceden soğutulmuş alüminyum plakalar üzerindeki, Arabidopsis thaliana meyve izole edilmiştir. Tohumlar, buz üzerinde bir alüminyum rafın (Şekiller 2c, 2d) bir tüp içinde bir paslanmaz çelik havan tokmağı ve motor-öğütücü ile homojenize edildi.

2.jpg "/>
Şekil 2: izolasyon ve Arabidopsis thaliana'nın tohum geliştirme homojenleştirme. Gelişen tohumlar, bir stereomikroskop (A) kapsamında soğuk alüminyum plaka üzerinde meyve izole edilir. Carpels pedikül (B) soyulmuş ve gelişmekte olan tohumlar toplanır. Tohumlar, buz (D) üzerinde soğutulmuş bir alüminyum rafa tüpler bir paslanmaz çelik havaneli (C) polivinilpirolidon (ağ / hac),% 1 ihtiva eden liziz tamponu içinde homojenize edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Toplam RNA, yeni geliştirilmiş bir yöntem ya da geleneksel yöntem kullanılarak (bundan böyle DAF olarak anılacaktır) çiçeklenme sonrası 4, 8 ve 12 gün tohumlardan izole edildi. konsantrasyon, A260 / A280 oranlar ve A260 /200 tohumlarından izole RNA A230 oranları Tablo 1 'de gösterilmektedir.

Yöntem DAF RNA konsantrasyonu, A260 / A280 A260 / A230
geleneksel 4 72.4 ± 7.4 1.90 ± 0.02 2.27 ± 0.06
8 10.8 ± 3.0 1.50 ± 0.08 1.40 ± 0.17
12 4.9 ± 1.7 1.57 ± 0.10 0.76 ± 0.18
yeni 4 63.7 ± 2.6 2.10 ± 0.08 2.29 ± 0.03
8 46.3 ± 4.9 2.15 ± 0.05 2.23 ± 0.09
12 41.77; 3.1 2.09 ± 0.04 2.17 ± 0.07

Tablo 1: Arabidopsis tohumlarından izole RNA konsantrasyonları, A260 / A280 oranlar ve A260 / A230 oranları. Toplam RNA, 4, 8, yaklaşık olarak 200 tohum (190 206 tohumlar) izole edildi ve 12 DAF geleneksel yöntem ya da yeni geliştirilen yöntem kullanılarak. RNA konsantrasyonları, A260 / A280 oranlar ve A260 / A230 oranları ölçülmüştür. Değerler üç bağımsız deneyin ortalaması ± SD temsil etmektedir.

Sonuçlar, bizim yöntem 8 ve 12 DAF tohumlarından yüksek oranda saflaştırılmış RNA izole etmek için bize etkin olduğunu göstermektedir. Toplam RNA, cDNA, ters-transkribe edilmiş ve cDNA çözeltiler 100 kat seyreltildi. Kopya WRI1 sayıları (KIRIŞIK 1: AT3G54320), SDP1 (ŞEKER DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ sup> ve EIF3K (ökaryotik çeviri başlatma faktörü 3K: AT4G33250) bir iç kontrol 8 olarak ölçüldü ve transkript nispi miktarları PCR analizleri kantitatif gerçek zamanlı (Şekil 3) ile tahmin edilmiştir.

Şekil 3,
Şekil 3: gelişen tohumlarda düşük seviyeli transkript miktarının belirlenmesi. Toplam RNA, bizim yöntemi kullanılarak, 4, 8 ve 12 DAF tohumlarından ekstre edildi, ve cDNA çözeltileri hazırlandı. WRI1 (A) ve SDP1 (B) transkriptlerinin nispi miktarları kantitatif gerçek zamanlı PCR ile ölçülmüştür. EIF3K bir iç kontrol olarak kullanıldı. Değerler üç bağımsız deneyin ortalama ± SD temsil etmektedir. DAF; Çiçeklenme gün sonra. He tıklayınızBu rakamın büyük halini görmek için yeniden.

WRI1 ve SDP1 transkript miktarı gelişen tohumlarda nispeten düşük olmasına rağmen, farklı gelişim aşamalarında tohumlar arasında sentezleme değişiklikleri tespit etmek mümkün olmuştur. Önerilen yöntem, diğer yağlı tohum kullanılabilecek doğrulamak için, toplam RNA, Brassica napus ve Glycine max erişkin tohumlardan izole edildi. RNA konsantrasyonları, A260 / A280 oranlar ve A260 / A230 oranları Tablo 2'de gösterilmiştir.

Yöntem Bitki RNA konsantrasyonu, A260 / A280 A260 / A230
geleneksel B. napus 7.7 ± 0.8 1.5 ± 0.12 0.75 ± 0.11
G. max 1.61 ± 0.06 0.69 ± 0.09
yeni B. napus 143.2 ± 19.0 2.17 ± 0.03 2.23 ± 0.13
G. max 152.3 ± 4.4 2.17 ± 0.02 2.30 ± 0.02

Tablo 2: RNA konsantrasyonları, A260 / A280 oranları ve A260 / A230 oranları Brassica napus ve Glycine max olgun tohumlarından izole edilmiştir. Toplam RNA, Brassica napus ve geleneksel yöntem ya da yeni geliştirilen yöntem kullanılarak Glycine max tohumların yaklaşık olarak 100 mg izole edilmiştir. Tohumlar daha önce ezilir ve sıvı azot içinde soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı ile yaklaşık homojenize edildi. RNA konsantrasyonları, A260 / A280 oranlar ve A260 / A230 oranları ölçülmüştür. Değerler üç bağımsız deneyin ortalaması ± SD temsil etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gen ekspresyon profilleri bitki fizyolojisinin anlayışımıza katkıda; Bu nedenle, belirli bir RNA izolasyon yöntemleri her bir örnek durum 9-12 geliştirilmiştir. Tohumları RNA izolasyonu sırasında inhibe ve RNA silika membranlanna bağlanan ölçüde inhibe olduğu bulundu işlemleri incelenmiştir. Yağ, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda RNA izolasyonu inhibe eder. Biz RNA silika membranların bağlanma işleminden önce bir parçalama solüsyonu ile bu bileşikleri kaldırmak için RNA ekstraksiyon işlemi güncellenmiştir. önemli değişiklikler (1.7 adımları 1.8)% 1 PVP (adım 1.2) ve santrifüj lizis çözeltisinden süpernatant toplanması eklenmesi dahil. % 1 PVP ilave amacı, polifenoller kaldırmaktır. Kullandığımız PVP en etkili konsantrasyonu incelenmiş ve% 1 PVP, bu işlem için en etkili konsantrasyon olduğunu doğruladı. santrifüj parçalama solüsyonu süpernatant toplama amacıyağ ve proteinleri uzaklaştırmak için. Süpernatan yüzen bir yağ katmanı ve bir tüp içinde pelet tutma önlemek için dikkatli bir şekilde toplanması gerekir. Bu iki basit değişiklikler büyük ölçüde ortasında tohum ve gelişim geç evrelerinde (Tablo 1) kurtarma, A260 / A280 oranları ve izole RNA'nın A260 / A230 oranları düzeldi.

Standart protokol basit bir değişiklik temsil eden yöntem, RNA izolasyonu için ticari olarak temin edilebilen kitler kullanır. Böylece, bir yöntem, lityum klorür kullanılarak fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesiyle hantal ek adımlar gerek kalmadan tohumlardan yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA izole etmek için kullanışlıdır. Önerilen yöntem, modifikasyonlar yağ ve protein açısından zengin bitki tohumları için iyi sonuç verdiğini göstermektedir olgun kolza ve soya tohumu (Tablo 2) ile birlikte kullanım için etkilidir. 4 DAF tohumları (Tablo 1) ve genç kökten RNA iyileşme oranlarıs, yaprak ve gövde eden yöntem, yağ ve protein olarak kötü dokularından gelen RNA izolasyonu için uygun olmadığını gösterir eden bir yöntemi kullanarak daha düşüktü. Bu nedenle, yöntem, sadece, tohum ve meyve gibi yağ, protein ve polifenoller içeren dokulardan RNA izolasyonu için avantajlıdır.

Genel olarak, yöntem, bir RNA saflaştırma için fenol, kloroform, veya ek işlemler kullanılmadan bitki tohumlarından yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA elde etmek için uygundur. Bu yöntem, tohum gen ifadesinin daha kesin profil kolaylaştıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz İşlevsel Genomik Tesisi ve spektrografisi ve Biyogörüntüleme Tesisi, NIBB Çekirdek Araştırma Hizmetleri ve Model Bitki Araştırma Tesisi, NIBB Bıoresource Merkezi'nin çalışanlarına teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904
polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P5288-100G
HOMOGENIZER S-303 AS ONE 1-1133-02
NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) TAKARA RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit Kapa biosystems KK4601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Tags

Biyokimya Sayı 119 bitki tohumları RNA izolasyonu kantitatif gerçek zamanlı PCR, Arabidopsis thaliana
Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M.More

Kanai, M., Mano, S., Nishimura, M. An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55008, doi:10.3791/55008 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter