Introduction
Sedan den första systematisk beskrivning av bisköldkörtlarna inom human- och i flera andra arter av Sandström 1880 1, att förstå betydelsen av denna lilla endokrina organ för människans fysiologi och sjukdom kontinuerligt har förbättrats. Bisköldkörtlarna utsöndrar parathormon (PTH), den huvudsakliga regulatorn av kalciummetabolismen. PTH är också ett viktigt hormon för fosfat homeostas och benomsättning 1, 2. Oavsiktlig borttagning eller skada av bisköldkörteln under halskirurgi är den vanligaste orsaken till hypoparatyreoidism, en sjukdom som kännetecknas av låg kalciumhalt i blodet, lågt PTH, och förhöjda fosfor 1.
För att bättre studera förvärvade hypoparatyreoidism och test nya terapier, tillförlitlig och lättillgänglig musmodeller krävs. Möss används ofta i forskning eftersom ett stort antal olika genetiska verktyg är enTillgängligt i denna art tillåter avancerade mekanistiska studier in vivo. Men medan kirurgisk paratyreoidektomi (PTX) kan användas i råttor 2, 3, 4, 5 och större däggdjur 6, 7, 8, är det tekniskt mycket utmanande i möss på grund av den lilla storleken på de körtlar och deras variabla anatomisk fördelning 9. Därför thyro-paratyreoidektomi (TPTX) vanligen utförs på möss, där sköldkörteln och bisköldkörtlarna avlägsnas tillsammans 10. Men låga sköldkörtelhormonnivåer är en potentiell confounder i experiment, vilket komplicerar denna modell. Dessutom är C-celler inom sköldkörteln, som producerar kalcitonin, ett hormon viktigt i kalciumhomeostas hos gnagare, också förlorat vid avlägsnande av de thyroids 11.
Flera genetiska musmodeller av hypoparatyreoidism existerar, vilka inkluderar PTH-noll mus 12, den GCM2-noll mus 13, och Nuf mus med en aktiverande mutation i kalcium-sensing receptor (CASR) 14, 15. Dessa genetiska defekter finns redan under fosterutvecklingen, och funktionen av bisköldkörteln därför redan nedsatt under embryogenes. Detta kan påverka utvecklingen av organ såsom skelettet. Detta kontrasterar med patienter med postsurgical hypoparatyreoidism som förvärvar sjukdomen senare i livet. Dessutom har några av dessa musmodeller uppvisar tidig dödlighet och minskad fertilitet, vilket ytterligare försvårar deras användning 12, 13, 14.
Vi utvecklade två nya mus models för förvärvade hypoparatyreoidism. Använda genetiskt modifierade möss som uttrycker GFP specifikt i bisköldkörteln gör bisköldkörtlarna att lätt kunna identifieras för kirurgiskt avlägsnande utan att ta bort sköldkörteln. Denna mus genererades genom att korsa PTH-Cre-mus, som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av den 5,5 kb PTH-promotorn 16 med ROSA mTmG musen. De resulterande PTHcre; mTmG möss uttrycker grönt fluorescerande protein specifikt i bisköldkörtelceller. Den andra musmodell använder samma PTH-Cre, denna gång för att ta bort en STOP-kassetten från den inducerbara DTR mus, vilket resulterar i expression av difteritoxinreceptorn specifikt i bisköldkörteln. Systemisk administrering av DT förstör bisköldkörtelceller, vilket gör djuren hypoparathyroid utan kirurgi.
De två musmodeller som presenteras i denna studie visar en stabil hypokalcemisk fenotyp under de tre månader observations period. Förfarandena är lätta att utföra, är fenotypen reproducerbar, och de hypoparathyroid möss uppvisar en hög överlevnadsfrekvens 17.
Protocol
Denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Massachusetts General Hospital. Skaffa lämplig institutionell godkännande för denna djurstudie innan du börjar. Vissa tekniker kan behöva justeras i enlighet med lokala IACUC krav.
1. GFP-PTX möss
- Skaffa PTHcre + möss och Rosa-mTmG möss vid 8 - 10 veckor gamla för ytterligare parning.
- Tillbakakorsning de PTHcre + möss (blandade 129; FVB bakgrund) med C57BL / 6 möss för 6 generationer att få möss med C57BL / 6 bakgrund.
- Inbreed PTHcre + möss för att erhålla PTHcre + / + möss 17.
OBS: För att utföra genotypning, extrahera DNA från svanstippen och använda den för PCR. PCR-primrarna för att kontrollera om heterozygositet och homozygositet av PTHcre transgenen är följande: framåtriktad primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, omvänd primer A ', TCAGATCACACCACACAGCA, forward primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, omvänd primer B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. - Cross PTHcre + / + möss 16 med Rosa-mTmG möss 18. Avvänja PTHcre; mTmG pups när 4 veckor gammal.
- Söva 8 - 10 veckor gamla PTHcre, mTmG möss genom ip-injektion av tribromoethanol (Avertin) vid 0,6 mg / g kroppsvikt, eller andra medel, såsom ketamin / xylazin. Använd buprenorfin 0,1 mg / kg sc varje 12 timmar som ett smärtstillande medel under 48 timmar efter operationen enligt en godkänd protokoll. Se till lämpligt djup av anestesi genom tå nypa tillbakadragande reflex eller på annat sätt. Placera djuret i ryggläge.
- Förläng och förbereda den ventrala halsområdet genom att raka huden med enstaka kantblad. Desinficera rakade huden med en povidonjod antiseptisk pad.
- Täck djuret med sterila operationsdukar för att minska kontamination av operationsområdet och använda autoklave microsurgical instrument för den kirurgiska proceduren.
- Skär en 2 cm längsgående snitt i huden med en kirurgisk skalpell. Dissekera fascia och skjut spottkörtlarna åt sidan genom trubbig dissektion med böjda sågtandade pincett.
- Enligt dissektion mikroskop med hjälp halogenljus och en 4 - 5 gångers förstoring, skära och separera paratracheal muskler med hjälp av vassa pincett tips och exponera luftstrupen.
- Identifiera sköldkörteln med höger och vänster lob ligger intill luftstrupen.
- Växla ljuskällan till fluorescerande ljus och visualisera de två gröna-fluorescerande bisköldkörtlarna.
OBS: Typiskt är de två bisköldkörtlarna belägna vid eller nära ytan av sköldkörteln, men ibland är de belägna längre bort. - Försiktigt bort den gröna bisköldkörtlarna med kirurgiska pincett och sax. Använd steril gasbinda för hemostas och noggrant kontrollera längs luftstrupen för att säkerställa att all grön vävnad har avlägsnats. Stäng paratracheal muskler genom avbruten sutur med användning av 6-0 polyglaktin 910 suturer. Stäng snittet huden genom Halsted sutur med användning av 6-0 polyglaktin 910 suturer.
- Valfritt: Injicera 10 | il / g kroppsvikt steril normal 0,9% natriumkloridlösning till mössen för vätskeersättning.
- Placera postkirurgiska djur till en separat bur på en varm inkubator (37 ° C) för återvinning av kroppstemperaturen. När möss är vaken och i liggande läge, sätta pellets chow och vatten med lite gelatin mat på burgolvet.
- Efter en postkirurgisk observationsperiod på 2 timmar, återgå musen till djuranläggningen och följa lokala bestämmelser för postsurgical vård.
- 3 dagar efter paratyreoidektomi, få 10 mikroliter svans blod och mäta blodjoniserat Ca ++ med hjälp av en analysator såsom blod gassystemet Ca ++ / pH-analysator. Framgångsrika paratyreoidektomi resulterar i blod joniserad Ca ++ lika eller lägre än -2SD av skenopererade controllmöss (1,20 mmol / L i våra experiment av n = 30).
2. PTH-cre-IDTR möss
- Skaffa PTHcre + och DTR fl / fl möss vid 8 - 10 veckor gamla för parning.
- Tillbakakorsning de PTHcre möss (blandade 129; FVB bakgrund) med C57BL / 6 möss för 6 generationer att få möss med C57BL / 6 bakgrund.
- Inbreed den PTHcre + (C57BL / 6 bakgrund) möss för att erhålla PTHcre + / + möss 17.
OBS: För att utföra genotypning, DNA från mussvan tips extraherades och användes för PCR. Genotypning Primers: framåt primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, omvänd primer A ', TCAGATCACACCACACAGCA, framåt primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, omvänd primer B ", GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. - Mate PTHcre + / + möss 16 med DTR fl / fl möss 19 för att erhålla PTHcre-IDTR möss.
- Framställ DT-lösning genom att späda diphtheriett toxin pulver med steril koksaltlösning till en koncentration av 0,5 mikrogram / ml. Sterilt filter och lagra alikvoter vid -80 ° C.
- Välj 8 - 10 veckor gamla PTHcre-IDTR möss för injektion experiment. Tö DT alikvot till rumstemperatur, administrera DT intraperitonealt vid 5 | ig / kg (10 | il / g) kroppsvikt av djuret. För maximal effektivitet och minst toxicitet, är DT administrering upprepas under totalt 2 injektioner i en 3-dagars intervall 17.
- 3 dagar efter den andra injektionen, ta 10 mikroliter svans blod från varje PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG mus och mäta blod Ca ++ med hjälp av en Blood Gas System Ca ++ / pH-analysator.
OBS: Vi definierar möss med blod joniserat Ca ++ lägre än 1,18 mmol / L som hypoparathyroid möss, vilket motsvarar 2 SD under medelvärdet för fordons-injicerade kontrollmöss (n = 22).
Representative Results
Lokalisering av bisköldkörtlarna
Först spelade vi fördelningen av bisköldkörtlarna av 54 PTHcre-mTmG möss som observerades under den fluorescerande dissektion mikroskop. 74% (40/54) möss hade två gröna bisköldkörtlarna (Figur 1A, C, E), 26% (14/54) möss hade en ytterligare tredje bisköldkörtel (Figur 1B, D, F). Ingen mus med en enda körtel eller fler än tre körtlar observerades. Vanligtvis, var bisköldkörtlarna som ligger nära den överlägsna gränsen av sköldkörteln (58%, 71/122; Figur 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) körtlar belägna nära den nedre gränsen av sköldkörteln (Figur 1C (1), D (3), F (1)), och 13% (16/122) var belägna bort från thyroid körtel (Figur 1B (3), E (1), F (2)). Våra resultat överensstämmer med och utöka tidigare fynd av varierande platser i bisköldkörtlarna 20.
GFP-PTX möss
Hela operationen från anestesi till att stänga snittet huden tog cirka 20 minuter per mus. Överlevnadsgraden av postkirurgiska möss över en 3-månaders observationsperioden var 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) GFP-PTX möss uppvisade joniserade kalciumnivåer som var 2 SD under medelvärdet för skenopererade kontrollmöss eller lägre. Den hypoparathyroid fenotyp i GFP-PTX möss (hypokalcemi, låg PTH och förhöjda serumfosfat) var stabil under hela observationstiden på 3 månader. Viktigt, sköldkörtelfunktion var inte skiljer sig från skenopererade djur 3 månader efter operationen (TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 ng / dL, p = 0,707 (Figur 2).
PTH-cre-IDTR Möss
DT injicerade PTH-Cre-IDTR möss utvecklade hypoparatyreoidism (lågt blodtryck joniserat kalcium, förhöjt blod fosfor, och olämpligt låg normala PTH-nivåerna). Vi har tidigare rapporterat att några PTH positiva celler undkomma ablation av difteritoxin, förklarar mätbara cirkulerande PTH och därför något mildare fenotypen av dessa möss 17.
Hypoparatyreoidism i GFP-PTX möss och PTH-cre-IDTR möss
Betydande minskningar av blod Ca ++ och serum PTH nivåer observerades i GFP-PTX möss 3 dagar efter operationen, jämfört med nivåer som konstaterats i skenopererade möss (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. (figur 3A återges med tillstånd från (referens # 17)). Efter 2 injektioner av 5 | j, g / kg DT vid 3 dagars intervall, en dos och regim optimerad för att använda den minsta mängden DT för att ge den maximala hypoparathyroid fenotypen, DT injicerade PTH-cre-IDTR möss visade signifikant hypokalcemi och minskad PTH jämfört med fordonskontrollmöss, som kvarstod över 90 dagar långa observationsperioden (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / L vs. 1,26 ± 0,05 mmol / L, p <0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs. 572 ± 164 pg / ml, p <0,05) (Figur 3B, återges med tillstånd från (referens # 17)).
Figur 1:
Figur 2: TSH och T4 nivå av GFP-PTX möss. 3 månader efter GFP-PTX ades serum erhölls för TSH och T4 measurem ent. GFP-PTX möss visade TSH koncentrationer (42 ± 24 mU / L) (A) och T4-koncentrationer (3,0 ± 0,6 ng / dl) (B) som inte skilde sig från kontrollmöss (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Blood Ca ++ och PTH-nivån i GFP-PTX möss och DT injicerade PTH-cre-IDTR möss. Båda GFP-PTX möss (A) och DT injicerade PTH-cre-IDTR möss (B) uppvisade stabil hypokalcemi och minskade PTH-nivåerna över tre månader långa observationsperioden (N = 6-8, *** p <0,001) (re-tryckt med tillstånd från referens # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi visar tekniken med GFP styrd paratyreoidektomi använder transgena möss med GFP uttryck selektivt i bisköldkörtlarna. I PTHcre, mTmG möss, dubbel fluorescens (grön GFP i Cre-uttryckta celler och röd tomat i icke-Cre uttryckte celler) gjorde det möjligt att tydligt identifiera och att exakt ta bort alla bisköldkörtlar utan att ta bort sköldkörteln. Även om vi föredrar att använda dubbel fluorescens mTmG möss för förmågan att identifiera fluorescerande röd icke-parat vävnad, bör vårt förfarande även fungerar bra med enskilda fluorescerande djur såsom tomat röda (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Proceduren är relativt lätt att utföra, kräver ca 20 min per mus, och resulterar i en allvarlig och varaktig hypoparathyroid fenotyp.
Dessutom är en annan fördel med de GFP-positiva bisköldkörtlarna hur lätt detektering av avvikande bisköldkörtlarna. Våra studier visarmislocalization av bisköldkörteln i ungefär en fjärdedel av B6-möss (figur 1), vilka lätt detekteras i vår musmodell av grön fluorescens. I motsats till thyro-paratyreoidektomi, undviker vår teknik avlägsnande av sköldkörteln med efterföljande behov av sköldkörtelhormonersättning och den okända effekten av avlägsnande av kalcitonin-producerande sköldkörtel C-celler. Fluorescensmärkta bisköldkörtlar kunde även användas för andra undersökningar som kräver isolering av bisköldkörtlarna. Begränsningen av denna modell inkluderar krav på kirurgi. Grundläggande mikrokirurgi kompetens och en dissektion mikroskop med en fluorescerande ljuskälla behövs.
En andra teknik för att generera hypoparathyroid möss som eliminerar behovet av kirurgi, demonstreras. Difteritoxin-behandlade PTHcre-IDTR möss uppvisar en mildare hypoparatyreoidism fenotyp, men helt enkelt kräva att injicera DT intraperitonealt i musen. Den kritiska delen for att generera denna modell optimering av dosen och behandlingsperiod. Höga doser av DT ledde till toxicitet men låga doser minskade effekten av tillvägagångssättet. Vi bestämde att dosen regemente 2 injektioner på 5 mikrogram / kg, administrerad 3 dagars mellanrum, resulterade i tillförlitlig och stabil hypokalcemi utan / minimal dödlighet.
I slutändan hoppas vi att dessa två tillvägagångssätt ge användbara musmodeller för förvärvade hypoparatyreoidism. Med hjälp av en ny långverkande PTH, rapporterade vi den första användningen av båda dessa modeller för att bestämma effekten av nya läkemedel för hypoparatyreoidism 17.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-DK100584 och Kina staten Key Laboratoriet för munsjukdomar Open finansiering SKLOD2015OF01 (RB). Vi tackar Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, och Kelly Lauter för hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
| PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
| iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
| 6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
| Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
| Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
| Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
| 0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
| 1 mL 29 G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
| Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
| Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
| Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
| 2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
| Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1 mg/mL as the stock solution in -80 °C |
| Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
| RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |
References
- Brandi, M. L., Brown, E. M. Hypoparathyroidism. , Springer. (2015).
- van Abel, M. Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone. Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).
- Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure. Bone. 43, 1022-1030 (2008).
- Rodriguez-Ortiz, M. E. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).
- Liao, H. W. Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy. PloS one. 10, e0133278 (2015).
- Fox, J., Care, A. D. Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs. Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).
- Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. Selective parathyroidectomy of the dog. Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).
- Can, I. Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation. Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).
- Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
- CRIVER. , Available from: http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures (2010).
- Sakai, A. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).
- Miao, D. Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium. Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).
- Gunther, T. Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone. Nature. 406, 199-203 (2000).
- Hough, T. A. Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).
- Hannan, F. M. The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1). Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).
- Libutti, S. K. Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism. Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).
- Bi, R. Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog. J Bone Miner Res. , (2015).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Buch, T. A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration. Nat Methods. 2, 419-426 (2005).
- Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
