Introduction
organismi superiori contengono comunità complesse di tipi cellulari diversi che collaborano per realizzare le funzioni più complesse. Ad esempio, i tumori contengono non solo le cellule cancerose, ma anche fibroblasti, cellule che costituiscono i vasi sanguigni e cellule immunitarie spesso infiltrati 1; sangue contiene una miscela complessa di decine di sottotipi di cellule immunitarie 2; e anche le linee cellulari in coltura possono consistere di più sottopopolazioni, come il lume e sottotipi basali delle cellule di carcinoma mammario 3. Inoltre, tipi di cellule distinte che coesistono può esibire metabolica "collaborazione". Ad esempio, nel cervello, astrociti sono pensati per convertire il glucosio in lattato, che è poi "alimentato" ai neuroni che ossidano il substrato 4; I linfociti T sono in alcuni contesti dipendenti cellule dendritiche adiacenti come fonte di cisteina 5; e le cellule tumorali possono collaborare con Assofibroblasti ciati nei tumori 6. Per comprendere il comportamento metabolico di tali sistemi, è essenziale per separare e misurare le attività metaboliche dei vari tipi di cellule presenti.
Di gran lunga il metodo più utilizzato per separare tipi cellulari è fluorescenza-attivato cell sorting. Questo metodo è ampiamente applicabile, a condizione che il tipo di cellula o lo stato di interesse possono essere "etichettati" con anticorpi fluorescenti, espressione di proteine fluorescenti ingegnerizzate, o altri coloranti. Una possibilità è quella di tipi inizialmente separati cellule attraverso un cell sorter, ri-cultura dei singoli tipi di cellule ottenute, e quindi eseguire studi sul metabolismo di queste culture 7. Tuttavia, ciò è possibile solo se il tipo di cellula o fenotipo è stabile in condizioni di coltura, e non possono catturare comportamento transitorio come stati del ciclo cellulare, né la cooperazione metabolica in co-coltura. Per tali casi, il metabolismo deve essere misurata direttamente su cosìcellule ari. Questa è una sfida dal momento che la cellula di smistamento procedura sottopone cellule alle sollecitazioni che possono falsare il loro metabolismo 8, e siamo consapevoli di solo pochi studi che prendono questo approccio 9, 10. In particolare, abbiamo trovato che i principali metaboliti come aminoacidi può fuoriuscire dalle cellule tenuti in memoria di cella di smistamento, in modo che le misurazioni dell'abbondanza metabolita assoluto non sono più affidabili 11 (anche se il confronto relativo tra le frazioni ordinate può essere ancora valido).
Per aggirare questi problemi, etichettiamo le cellule con isotopi stabili prima di ordinamento e concentriamo sui MID di metaboliti cellulari, piuttosto che abbondanze di metaboliti. Dal momento che i MID si formano su scale temporali più lunghi, essi dovrebbero essere meno influenzati da esposizione a breve termine a condizioni di ordinamento. Abbiamo quantificare MID utilizzando la spettrometria di massa ad alta risoluzione full-scan, che è abbastanza sensibile per fornire data su centinaia di metaboliti a partire da circa 500.000 cellule ordinati, che richiede circa 30-60 minuti di tempo l'ordinamento delle cellule. Un confronto tra un "finto allineati" controllo (cellule passati attraverso lo strumento sorter cella senza gating alcuna specifica popolazione) ed estrazione metabolita direttamente dal piatto di coltura è fatto per assicurare che le MIDs osservati sono rappresentativi di quelli nella cultura originale. A seconda della scelta di isotopi stabili, varie vie metaboliche possono essere studiate con questo metodo.
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Protocol
1. Estrazione Metabolite
- Estrazione da piatto
- cellule di coltura in una piastra da 6 pozzetti in triplicato in isotopi etichettato terreni di coltura stabile + supplementi dializzati (siero o altri integratori di crescita) fino a quando le cellule diventano il 75% confluenti.
NOTA: Qui coltura cellule HeLa per 48 ore in RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U 13 C, 15 N2-glutammina e 5% dializzato FBS (siero fetale bovino). Dializzato FBS viene usato per liberarsi dei piccoli metaboliti peso molecolare che possano contaminare i media etichettati. Si raccomanda coltura di cellule in appendice dializzato prima della esperimento reale per garantire cellule crescono normalmente in mezzo. I supplementi sono dializzati in 0,15 M di NaCl soluzione durante la notte utilizzando pelle di serpente tubo di dialisi. - Al giorno di terreni di coltura di estrazione degli scarti, lavare i pozzi due volte con 500 microlitri HBSS freddo e poi disfarsene.
NOTA: Qui utilizzare HBSS contenente il 40% U-13 C-glucosio essendo anche nei mezzi di coltura. - Aggiungere 600 ml metanolo 100% pre-raffreddata in ghiaccio secco.
- Trasferire il piatto di ghiaccio secco e rimuovere il materiale delle cellule con un raschietto cellulare.
- pipetta con attenzione gli estratti di cellule in una provetta e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi spettrometria di massa.
- cellule di coltura in una piastra da 6 pozzetti in triplicato in isotopi etichettato terreni di coltura stabile + supplementi dializzati (siero o altri integratori di crescita) fino a quando le cellule diventano il 75% confluenti.
- Estrazione di cellule ordinati finti
- cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in isotopi etichettato terreni di coltura + supplementi dializzati stabili.
NOTA: Qui coltura cellule HeLa per 48 h in piatto 100 millimetri perché un elevato numero di celle (~ 4 x 10 6) sono necessarie per ottenere 500.000 cellule ordinati. Questo numero di HeLa estratto cellule è stato richiesto per ottenere una buona misura di metaboliti. I terreni di coltura utilizzato era RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U-13 C, 15 N2-glutammina e il 5% dializzato FBS. - Al giorno d'estrazione, terreni di coltura scarti, lavare i pozzi wesimo 1.5 mL caldo HBSS e poi disfarsene.
- Staccare cellule aggiungendo 1,5 ml di tripsina / EDTA per 4 min a 37 ° C. Effettuare le seguenti operazioni a 4 ° C o nel ghiaccio.
- Disattivare tripsina con l'aggiunta di 3 ml di ghiaccio HBSS freddo (soluzione salina bilanciata di Hank) + supplemento dializzato.
- Raccogliere cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e 750 xg per 3 min.
- Risospendere il pellet in HBSS + dializzata supplemento + 1 mM EDTA ad una concentrazione di 1-2 x 10 6 cellule / ml, passano attraverso 40 micron filtri cellulari per ottenere cellule singole, e trasferire in una provetta da 5 ml.
- cellule ordinare attraverso cell sorter gating solo per canottiere, e le cellule centrifugare ordinato a 750 xg per 3 min a 4 ° C.
NOTA: qui Trova cellule HeLa a una velocità di 1.000 eventi / s, con la pressione dello strumento 27 psi, e l'utilizzo di un ugello 100 micron. cellule HeLa sono grandi quindi dovrebbero essere ordinati ad un tasso di eventi lento e grande bocchetta per ottenere pellet più intatto possibile. Mantenere le cellule in blocchi freddi throughout ordinamento per diminuire il metabolismo. Una descrizione approfondita della procedura di selezione è descritto in precedenza 12. - Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 microlitri di ghiaccio dH freddo 2 O per ottenere un pellet omogeneo prima di aggiungere metanolo. L'aggiunta di metanolo freddo direttamente al pellet forma un pellet solido che è difficile da risospendere.
- Estrarre metaboliti aggiungendo 540 ml di metanolo mantenuto in ghiaccio secco e mantenere estratti a -80 ° C fino cromatografia liquida - spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) analisi.
- cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in isotopi etichettato terreni di coltura + supplementi dializzati stabili.
- Estrazione del ciclo cellulare allineati cellule
- cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in cultura dei media + supplementi dializzati.
NOTA: Qui cellule HeLa coltura contenenti Geminin Fucci verde (MAG1-hGem) sonda 13 che consente per l'ordinamento di G1 (negativo) e le cellule SG2M (positive). Le celle possono essere coltivate in un supporto stabile isotopi traccia per uns tempo necessario. Qui li abbiamo in coltura per 46 ore in supporti senza etichetta, allora abbiamo passato a RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U-13 C, 15 N2-glutammina 2 ore prima di iniziare l'ordinamento. Ciò è stato fatto in modo da essere in grado di studiare le fasi del ciclo cellulare che richiede un breve impulso di etichettatura. - Al giorno d'estrazione, terreni di coltura scarti, lavare i pozzetti con 1,5 ml caldo HBSS e poi disfarsene.
- Staccare cellule aggiungendo 1,5 ml di tripsina / EDTA per 4 min a 37 ° C. Effettuare le seguenti operazioni a 4 ° C o nel ghiaccio.
- Disattivare tripsina con l'aggiunta di 3 ml di ghiaccio freddo HBSS + supplemento dializzato.
- Raccogliere cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e 750 xg per 3 min.
- Risospendere il pellet in HBSS + dializzata supplemento + 1 mM EDTA ad una concentrazione di 1-2 x 10 6 cellule / ml, passano attraverso 40 micron filtri cellulari per ottenere cellule singole, e trasferire in una provetta da 5 ml.
- cellule ordinare attraverso il cell sorter gDELL'INDICE DI i detriti e doppietti, quindi gating per il marcatore di cellule; e centrifugare le cellule filtrate a 750 xg per 3 min a 4 ° C.
NOTA: qui Trova cellule HeLa a una velocità di 1.000 eventi / s, con la pressione dello strumento 27 psi, e l'utilizzo di un ugello 100 micron. Mantenere le cellule in blocchi fredde tutto l'ordinamento per diminuire il tasso di metabolismo. - Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 microlitri di ghiaccio dH freddo 2 O per ottenere un pellet omogeneo prima di aggiungere metanolo. L'aggiunta di metanolo freddo direttamente al pellet forma un pellet solido che è difficile da risospendere.
- Estrarre i metaboliti aggiungendo 540 ml di metanolo mantenuto in ghiaccio secco e mantenere estratti a -80 ° C fino all'analisi LC-HRMS.
- cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in cultura dei media + supplementi dializzati.
Analisi 2. Spettrometria di Massa
Nota: Qui si descrive il protocollo per l'analisi di estratti cellulari su un sistema LC-HRMS. Qualsiasi metodo metabolomica per analisi di estratti cellulari possono essere usati. Scansione completaanalisi potrebbe essere utile per rilevare una vasta gamma di metaboliti.
- Calibrare lo strumento utilizzando un mix di calibrazione di riferimento spettrometria di massa.
- estratti cellulari Scongelare in ghiaccio per 30 minuti e vortex per 15 s.
- Trasferire 100 microlitri dell'estratto cellulare ad un filtro rotativo e centrifugare per 10 minuti a 13.000 xga 4 ° C.
- Iniettare 12,5 ml di filtrato nel sistema LC-HRMS.
- metaboliti separate utilizzando una zwitterionici interazione idrofilica cromatografia liquida (ZIC-HILIC) della colonna (150 mm x 4.6 mm 5 micron dimensione delle particelle) dotati di una colonna di guardia ZIC-HILIC (20 mm × 2,1 millimetri) con un gradiente di eluizione dello 0,1% formico L'acido in acqua (a solvente) e acetonitrile (solvente B). Avviare il gradiente di eluizione a 20% di solvente A e aumentare fino al 80% in 17 min. Mantenere questa percentuale durante 4 minuti con un flusso di 400 ml min -1 e temperatura della colonna e vassoio di campione a 23 ° C e 4 ° C, rispettivamente.
- Utilizzare un iNstrument accoppiato alla separazione cromatografica per il rilevamento metaboliti, un elettrospray riscaldata (H-ESI II) sia in modalità positivi e negativi come sorgente di ionizzazione, e una modalità di acquisizione scansione completa ad una massa risolvere potenza di 70.000 Figura Larghezza tempo massimo (FWHM) ( m / z 200).
- Utilizzare azoto (purezza> 99,995%) per il gas guaina e gas ausiliario ad una portata di 45 e 10 au (unità arbitrarie) e temperatura vaporizzatore impostata a 350 ° C e la tensione electrospray a 4 kV in modalità positiva e -3.5 kV in modalità negativa.
Analisi 3. Dati
- Selezionare un numero di metaboliti per i quali sono disponibili gli standard e che mostrano picchi di qualità di campioni. picchi di buona qualità hanno un elevato rapporto segnale-rumore. E 'importante verificare la qualità di picco e assicurarsi di non includere falsi isotopi. picchi isotopici che differiscono in forma e / o tempo di ritenzione sono probabilmente false.
- Per i campioni marcati con isotopi calcolano isotopomero di massa (MI) frazioni dividendo l'area del picco di ogni MI con superficie totale di picco di tutti i MIS.
- Calcolare le frazioni di carbonio / azoto etichettati, arricchimento del 13 C e 15 N, rispettivamente, come
dove n è il numero totale di atomi di carbonio (o atomi di azoto, rispettivamente) nel metabolita, e Mix è la frazione MI di x.
NOTA: Tutti i calcoli possono essere eseguiti utilizzando linguaggi di programmazione.
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Representative Results
Come esempio, qui si descrive un esperimento indagare il metabolismo delle cellule HeLa selezionati secondo fase del ciclo cellulare. Per etichettare una vasta gamma di metaboliti centrali su entrambi i carboni e atomi di azoto, abbiamo coltivato le cellule per 48 h utilizzando U- 13 C-glucosio e U- 13 C, 15 N-glutammina come traccianti. Per ottenere MID ricche per l'esperimento di validazione, abbiamo scelto qui una miscela di 40% U- 13 C-glucosio e il 70% U-13 C, 15 N2-glutammina, come livelli intermedi di isotopi tendono a generare più svariati modelli MI 14.
Per l'esperimento di validazione abbiamo effettuato un'analisi mirata dei 85 metaboliti. Dopo controlli di qualità procedura per rimuovere poveri picchi di qualità LC-MS, siamo stati in grado di rilevare 69 picchi nelle estratti cellulari diretti, di cui 66 erano presenti nelle cellule finti ordinato (96%). 60 di questi sembrava essere etichettati(arricchimento di isotopi sopra abbondanza naturale), e nella maggior parte dei casi i loro MID erano simili tra estratti piatto e cellule finte ordinati (Figura 2A). Ad esempio, il MID di glutammato (che include sia 13 C e 15 N infarti del miocardio) è simile tra il piatto ed estratti finte ordinati (Figura 2b), che indica che il glutammato MID è affidabile anche in popolazioni di cellule ordinati. Tuttavia, alcuni metaboliti sono chiaramente influenzati dalla procedura di ordinamento: per esempio, lattato aveva meno 13 C 3 in cellule filtrate finto, per motivi sconosciuti. Tali metaboliti devono essere valutati con cautela quando si analizzano i dati provenienti da frazioni effettivi ordinati. In cellule ordinati finte, il 91% della frazione MI misurato aveva una deviazione standard inferiore all'1% in tutta triplicato biologici, indicando che i MID erano altamente riproducibile in cellule ordinati.
Abbiamo poi analizzato HeLa allineati in entrambi i G0 / G1 o S / G2 / M del ciclo cellulare sTages utilizzando la sonda FUCCI Geminin 12. Poiché queste fasi del ciclo cellulare durano solo ~ 10 h, noi qui "Pulse" etichettato culture per 2 ore per ottenere diversi etichettatura isotopo tra gli stadi. Ad esempio, abbiamo notato che citidina è etichettato in entrambe le popolazioni, ma per un arricchimento superiore nella S / G2 / M fase, coerente con aumento della sintesi de novo dei nucleotidi durante la fase S (figura 3). In questo caso, il MID mostra lo stesso modello in due frazioni, suggerendo che stessa via di sintesi è utilizzato, ma è più attivo nella S / G2 / M fase. Questi dati mostrano che le differenze metaboliche sono facilmente rilevabili mediante questo metodo ancora tra sottopopolazioni strettamente correlati.
Figura 1: Disegno sperimentale. Flusso di lavoro per la preparazione del piatto, finto allineati e sottopopolazione più allineaticts. Piatto e finte estratti ordinati sono utilizzati nei MID esperimento di validazione di piatto e di estratti ordinati finte sono confrontati per verificare eventuali cambiamenti dovuti a cernita. frazione Complesso di celle è ordinato in base marcatore del tipo cellulare di interesse e quindi estratto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Convalida dei MID contro estrazioni dirette. Grafici a dispersione di (A) 13 C e 15 N arricchimento nel piatto e campioni ordinati finte. Ogni punto rappresenta una replica. Triplicato si uniscono con linee. (B) 13 C-15 N MID di glutammato. (C) 13 C MID di lattato. Le barre di errore sono deviazioni standard di misu triplice copiarements. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: differenze metaboliche tra le fasi del ciclo cellulare in cellule HeLa. Citidina è etichettato in modo diverso in G 1 -G 0 e SG 2 -M cellule. (A) Cytidine 13 C arricchimento in G 1 -G 0 e SG 2 -M fasi del ciclo cellulare. La linea tratteggiata è sinonimo di arricchimento di carbonio da isotopi di massa naturale. (B) Cytidine MID mostrato come trame di array in G 1 -G 0 e SG 2 -M fasi. Le barre di errore sono deviazioni standard delle misurazioni triplice copia. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro metodo si basa sul principio che MIDs in metaboliti cellulari riflettono la "storia" delle attività metaboliche di una cella. Questo rende possibile indagare attività metaboliche in sottopopolazione di cellule, come si è verificato nel complesso comunità di cellule, prima della procedura di cell sorting. Al contrario, le aree di picco di metaboliti differiscono notevolmente tra estratti di cellule ordinati e estrazione diretta dal piatto della cultura 11. In parte ciò è dovuto alla diversa composizione chimica altera la risposta del segnale in spettrometria di massa, un cosiddetto "effetto matrice", ma abbiamo anche dimostrato che gli aminoacidi sono persi da cellule di cernita, mentre le cellule sono tenuti in tampone 11. Questo può alterare lo stato e le attività delle cellule metabolico durante l'ordinamento, ma questo è di per sé irrilevante per il nostro metodo: a condizione che i MID sono ragionevolmente vicino a quelli osservati in estrazione diretta, i dati rimangono un valimisurazione d dello stato metabolico di ciascuna sottopopolazione nella cultura originale complesso.
Inizialmente abbiamo testato un metodo in cui le cellule sono state ordinate direttamente nella soluzione di estrazione (metanolo) per estinguere rapidamente il metabolismo. Purtroppo, gli estratti risultanti erano difficili da analizzare, poiché contenevano elevate quantità di sali e possibilmente altri contaminanti dal liquido guaina cell sorter, con conseguente soppressione ionica massiccia sul nostro sistema spettrometria di massa. Abbiamo quindi scelto il protocollo qui descritto, in cui il liquido in eccesso depositato dallo strumento sorter cella viene lavato prima dell'estrazione.
Il nostro protocollo comporta classificare in HBSS, una soluzione salina fisiologica supplementato con glucosio per mantenere la vitalità cellulare. In un certo senso, può essere preferibile per ordinare cellule nel mezzo di coltura reale per minimizzare stress metabolico come una dispersione di amminoacido. Tuttavia, è difficile lavare il piccolo pellet di cellule filtrate, e therefmetaboliti minerale presenti in media avrebbero contaminare i MID cercato di metaboliti intracellulari. Ogniqualvolta 13 glucosio C-marcato è utilizzato come tracciante, identica glucosio marcato deve essere utilizzato nella soluzione HBSS pure.
Come si vede nella figura 2, molti, ma non tutti i metaboliti, mantengono le loro MID dopo la procedura di ordinamento delle cellule. Non sappiamo il motivo per cui alcuni metaboliti (lattato, per esempio) sono specificamente alterati. Questo risultato sottolinea che è fondamentale verificare che i MID di interesse sono robusti verso la cella di smistamento procedura di smistamento finto. Anche se non è possibile verificare direttamente la MID di una sottopopolazione filtrate, MID quali non incide smistamento finto (glutammato, per esempio) dovrebbe essere influenzata dal reale classificare così, la procedura è identico tranne per la selezione di celle. Questo passo convalida deve essere eseguita ogni volta che viene utilizzato un nuovo tipo di cellula o di coltura condizione. È importante sottolineare che our metodo è limitato a metaboliti per i quali MID robuste può essere verificata in questo modo.
Prevediamo che il metodo descritto qui sarà utile in un certo numero di applicazioni all'interno di biologia cellulare e della biomedicina. Gli esempi includono fenotipi metabolica delle cellule co-coltura, come cellule staminali - culture strato alimentatore, modelli di neuroni-astrociti 4, sottopopolazioni di cellule del sangue 2, e anche le popolazioni di cellule complesse isolate da modelli animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
