Introduction
Høyere organismer inneholder komplekse samfunn av forskjellige celletyper som samarbeider for å få til mer komplekse funksjoner. For eksempel svulster inneholder ikke bare kreftceller, men også fibroblaster, celler som utgjør blodårene, og ofte immunceller infiltrerer en; blod inneholder en kompleks blanding av dusinvis av immuncelle subtyper 2; og til og med dyrkede cellelinjer kan bestå av flere subpopulasjoner, slik som luminal og basal subtyper av brystkreftceller 3. Videre, distinkte celletyper som eksistere kan vise metabolske "samarbeid". For eksempel, i hjernen, blir astrocytter antas å omdanne glukose til laktat, som er så "matet" til neuroner som oksidere dette substratet 4; T-lymfocytter er i noen sammenhenger avhengig tilstøtende dendrittiske celler som en kilde for cystein 5; og kreftceller kan samarbeide med assoavskrives fibroblaster i svulster 6. For å forstå den metabolske oppførselen til slike systemer, er det viktig å separere og måle de metabolske aktiviteter av forskjellige celletypene som er tilstede.
Den klart mest brukte metoden for å skille celletyper er fluorescens-aktivert cellesortering. Denne fremgangsmåten er generelt anvendbar, forutsatt at celletype eller tilstanden av interesse kan være "merket" ved bruk av fluorescerende antistoffer, ekspresjon av konstruerte fluorescerende proteiner, eller andre fargestoffer. Ett alternativ er å begynne med separate celletyper gjennom en celle sorter, re-kulturen de enkelte celletyper som oppnås, og deretter utføre metabolismestudier av disse kulturene 7. Dette er imidlertid bare mulig hvis den celletype eller fenotype er stabil i dyrkningsbetingelser, og kan ikke fange transiente oppførselen såsom cellesyklus tilstander, og heller ikke den metabolske samarbeidet i ko-kulturer. For slike tilfeller må metabolisme måles direkte på sårted celler. Det er utfordrende fordi cellesorteringsprosedyren fag celler for spenninger som kan forvrenge deres metabolisme 8, og vi er klar over bare noen få studier som tar denne tilnærmingen 9, 10. Spesielt har vi funnet at hovedmetabolitter som aminosyrer kan lekke fra celler holdt i cellesortering buffer, slik at målinger av absolutt metabolitt overflod ikke lenger er pålitelig 11 (selv om det relative sammenlikning mellom sorterte avfallsfraksjoner kan likevel være verdifulle).
For å omgå disse problemene, merke vi celler med stabile isotoper før sortering, og fokusere på de MIDs i cellulære metabolitter, snarere enn metabolitt hopetall. Siden MIDs dannes over lengre tidsskala, bør de bli mindre påvirket av kortsiktige eksponering for sortering forhold. Vi kvantifisere MID ved hjelp av hel-skanning med høy oppløsning massespektrometri, som er følsom nok til å gi data på hundrevis av metabolitter som starter fra rundt 500.000 sorterte cellene, som krever ca 30-60 min av celle sortering tid. En sammenligning mellom en «mock sortert" kontroll (celler passerte gjennom cellesorterer instrumentet uten gating noen bestemt populasjon) og metabolitt ekstraksjon direkte fra kulturskålen er gjort for å sikre at den observerte MID er representative for de som er i den opprinnelige kultur. Avhengig av valget av stabile isotopen tracere kan forskjellige metabolske baner bli studert med denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. metabolitt Utvinning
- Utvinning fra fatet
- Dyrke celler i en 6-brønns plate in triplo i en stabil isotop-merket kulturmedium + dialysert kosttilskudd (serum eller andre veksttilskudd) inntil cellene blir 75% konfluent.
MERK: Her kultur HeLa-celler i 48 timer i RPMI som inneholder 40% U- 13C-glukose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin og 5% dialysert FBS (Fetal Bovine Serum). Dialysert FBS brukes til å bli kvitt de små molekylvekt metabolitter som kan forurense merket media. Dyrking av celler i tillegg dialysert før den virkelige forsøket anbefales for å sikre at celler vokser normalt i mediet. Kosttilskudd er dialysert i 0,15 M NaCl-løsning over natten ved hjelp av slangeskinn dialyse tubing. - På dagen for utvinning kast kultur media, skyll brønner to ganger med 500 mL kald HBSS og kast den.
MERK: Her bruker HBSS inneholder 40% U-13C-glukose, siden det er også i kulturmediet. - Legg 600 pl 100% metanol pre-avkjølt på tørris.
- Overfør retten til å tørke is og fjerne cellemateriale med en celleskrape.
- Nøye pipette celle ekstrakter til et mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C inntil massespektrometrianalyse.
- Dyrke celler i en 6-brønns plate in triplo i en stabil isotop-merket kulturmedium + dialysert kosttilskudd (serum eller andre veksttilskudd) inntil cellene blir 75% konfluent.
- Utvinning av mock sorterte cellene
- Kultur cellene i en 100 mm tallerken i tre paralleller i stabile isotopen merket Culture Media + dialysert kosttilskudd.
MERK: Her kultur HeLa-celler i 48 timer i 100 mm skål fordi (~ 4 x 10 6) for et høyt antall celler for å oppnå 500.000 sorterte cellene. var nødvendig for dette antall av HeLa-celler ekstrakt for å oppnå en god måling av metabolitter. Kulturmediet som ble anvendt var RPMI inneholdende 40% U- 13C-glukose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin og 5% dialysert FBS. - På dagen for utvinning, kast kultur media, skyll brønner with 1,5 ml varm HBSS og kast den.
- Løsne cellene ved tilsetning av 1,5 ml trypsin / EDTA i 4 min ved 37 ° C. Utfør følgende trinn i 4 ° C eller i is.
- Deaktiver trypsin ved tilsetning av 3 ml iskald HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) + dialysert supplement.
- Samle celler i et 15 ml rør og sentrifuger ved 750 xg i 3 min.
- Resuspender pelleten i HBSS + dialysert supplement + 1 mM EDTA ved en konsentrasjon på 1-2 x 10 celler / ml 6, passere gjennom 40 um celle siler for å oppnå enkeltceller, og overføring til et 5 ml rør.
- Sorteringscellene gjennom cellesorterer gating bare for singletter, og sentrifuger sortert cellene ved 750 x g i 3 min ved 4 ° C.
MERK: her Sorter HeLa-celler med en hastighet 1000 events / s, med instrument trykk 27 psi, og ved hjelp av en 100 mikrometer dyse. HeLa-celler er store, slik at de skal sorteres på en langsom hendelsesrate og stor munnstykket for å få så intakt pellet som mulig. Hold cellene i kalde blokker throughout sortering for å redusere stoffskiftet. En grundig beskrivelse av sortering prosedyren er beskrevet tidligere 12. - Kast supernatanten og resuspender pelleten i 50 mL iskald dH 2 O for å oppnå en homogen pellet før tilsetning av metanol. Tilsetning av kald metanol direkte til pellet danner en fast pellet som er vanskelig å resuspendere.
- Ekstraher metabolitter ved tilsetning av 540 pl metanol holdes i tørris og holde ekstrakter ved -80 ° C inntil væske-kromatografi - høy oppløsning massespektrometri (LC-HRMS) analyse.
- Kultur cellene i en 100 mm tallerken i tre paralleller i stabile isotopen merket Culture Media + dialysert kosttilskudd.
- Utvinning av cellesyklus sortert celler
- Kultur cellene i en 100 mm tallerken i tre paralleller i kultur media + dialysert kosttilskudd.
MERK: Her kultur HeLa celler som inneholder Geminin Fucci Grønn (mAG1-hGem) sonde 13 som gir mulighet for sortering av G1 (negativ) og SG2M (positive) celler. Celler kan dyrkes i stabile isotopen tracing medier for ens lenge som nødvendig. Her har vi dyrket dem i 46 timer i umerkede media, da vi har byttet til RPMI som inneholder 40% U- 13C-glukose og 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin 2 h før sortering. Dette ble gjort for å kunne studere cellesyklus faser som krever en kort puls merking. - På dagen for utvinning, kast kultur media, skyll brønner med 1,5 ml varm HBSS og kast den.
- Løsne cellene ved tilsetning av 1,5 ml trypsin / EDTA i 4 min ved 37 ° C. Utfør følgende trinn i 4 ° C eller i is.
- Deaktiver trypsin ved å legge 3 ml iskald HBSS + dialysert supplement.
- Samle celler i et 15 ml rør og sentrifuger ved 750 xg i 3 min.
- Resuspender pelleten i HBSS + dialysert supplement + 1 mM EDTA ved en konsentrasjon på 1-2 x 10 celler / ml 6, passere gjennom 40 um celle siler for å oppnå enkeltceller, og overføring til et 5 ml rør.
- Sorter celler gjennom cellesorterer gating ut rusk og dubletter, deretter gating for cellemarkør er av interesse, og sentrifuger sortert cellene ved 750 x g i 3 min ved 4 ° C.
MERK: her Sorter HeLa-celler med en hastighet 1000 events / s, med instrument trykk 27 psi, og ved hjelp av en 100 mikrometer dyse. Hold cellene i kalde blokker gjennom sortering for å redusere metabolismen rate. - Kast supernatanten og resuspender pelleten i 50 mL iskald dH 2 O for å oppnå en homogen pellet før tilsetning av metanol. Tilsetning av kald metanol direkte til pellet danner en fast pellet som er vanskelig å resuspendere.
- Trekke ut de metabolitter ved tilsetning av 540 pl metanol holdes i tørris og holde ekstrakter ved -80 ° C inntil LC-HRMS analyse.
- Kultur cellene i en 100 mm tallerken i tre paralleller i kultur media + dialysert kosttilskudd.
2. massespektrometrianalyse
Merk: Her beskriver vi protokollen for å analysere celleekstrakter på en LC-HRMS system. Eventuelle metabolomics metoder for analyse av celleekstrakter kan benyttes. Full skanningAnalysen kan være nyttig for å detektere et bredt spekter av metabolitter.
- Kalibrere instrumentet med en massespektrometri henvisning kalibrering mix.
- Tine-celleekstrakter på is i 30 min og virvle i 15 s.
- Overfør 100 ul av celleekstrakt til en spinnfilter og sentrifuger i 10 minutter ved 13.000 xg ved 4 ° C.
- Injiser 12,5 pl av filtratet ut på LC-HRMS system.
- Separate metabolitter ved hjelp av et zwitterionisk hydrofil Interaction væskekromatografi (ZIC-HILIC) kolonne (150 mm x 4,6 mm, 5 um partikkelstørrelse) utstyrt med en ZIC-HILIC beskyttelseskolonne (20 mm x 2,1 mm) under anvendelse av en gradient eluering av 0,1% maursyre syre i vann (løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B). Start gradienteluering med 20% oppløsningsmiddel A og øke opp til 80% i 17 min. Oppretthold denne prosentandelen i løpet av 4 minutter med en strømningshastighet på 400 mL min -1 og kolonnetemperaturen og prøven brett ved 23 ° C og 4 ° C, respektivt.
- Bruk en instrument koblet til kromatografisk separasjon for metabolitter deteksjon, en oppvarmet elektro (H-ESI II) i både positive og negative moduser som ionisering kilde, og en full skanningsakkvisisjonsmodus på en masse oppløsningsevne på 70.000 Full Bredde Half Maximum (FWHM) ( m / z 200).
- Bruk nitrogen (renhet> 99,995%) for kappen gass og hjelpegass ved en strømningshastighet på 45 og 10 au (vilkårlige enheter) og innstilt temperatur fordamper ved 350 ° C og den elektrospray spenningen på 4 kV i positiv modus og -3,5 kV i negativ modus.
3. Data Analysis
- Velg en rekke metabolitter for hvilke standarder er tilgjengelige og som viser god kvalitet topper i prøvene. God kvalitet toppene har høyt signal til støyforhold. Det er viktig å kontrollere topp kvalitet og sørg for ikke å inkludere falske isotoper. Isotopiske toppene som varierer i form og / eller oppholdstid er sannsynlig falske.
- For isotop-merkede prøver beregne masse isotopomer (MI) fraksjoner ved å dividere toppområdet til hver MI med total topparealene for alle MIS.
- Beregn de merkede karbon / nitrogen-fraksjoner, anrikning av 13 C og 15 N, henholdsvis, så
hvor n er det totale antall karbonatomer (eller nitrogenatomer, henholdsvis) i metabolitten, og blandingen er MI brøkdel av x.
MERK: Alle beregninger kan utføres ved hjelp programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel her beskriver vi et eksperiment for å undersøke metabolismen av HeLa-celler, sortert i henhold til cellesyklus fase. For å markere en rekke sentrale metabolitter på begge carbonatomer og nitrogenatomer, dyrket vi cellene i 48 timer ved hjelp av U- 13C-glukose og U- 13 C, 15 N-glutamin som tracere. For å oppnå rike MID for validering forsøket, vi her har valgt en blanding av 40% U- 13C-glukose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin, som mellomliggende nivåer av isotoper har en tendens til å generere mer varierte MI mønstre 14.
For validering eksperiment vi gjennomførte en målrettet analyse av 85 metabolitter. Etter kvalitetskontroller skritt for å fjerne dårlig kvalitet LC-MS-topper, var vi i stand til å oppdage 69 toppene i de direkte celleekstrakter, hvorav 66 var til stede i mock sorteres celler (96%). 60 av disse viste seg å være merket(isotop berikelse ovenfor naturlig forekomst), og i de fleste tilfeller deres MID var lik mellom oppvask ekstrakter og mock sortert celler (Figur 2A). For eksempel MID av glutamat (som inkluderer både 13 C og 15 N MI), er lik mellom tallerken og mock sortert ekstrakter (figur 2B), noe som indikerer at glutamat MID er pålitelig også i sorterte cellepopulasjoner. Men noen metabolitter tydelig påvirket av sortering prosedyre: for eksempel laktat hadde mindre 13 C 3 mock sortert celler, av ukjente grunner. Slike metabolitter bør sees med forsiktighet ved å analysere data fra faktiske sorterte fraksjoner. I mock sorterte cellene, 91% av den målte MI fraksjon hadde et standardavvik mindre enn 1% på tvers av biologiske triplikater, noe som indikerer at MID var svært reproduserbare i sorterte cellene.
Vi neste analysert HeLa sortert i enten G0 / G1 eller S / G2 / M cellesyklus stages bruker FUCCI Geminin sonde 12. Fordi disse cellesyklus stadier siste bare ~ 10 h, vi her "puls" merket kulturer for 2 timer for å oppnå forskjellige isotop merking mellom etapper. For eksempel har vi registrert at cytidin er merket i begge populasjoner, men til en høyere anrikning i S / G2 / M fasen, i samsvar med øket de novo syntese av nukleotider i S-fasen (Figur 3). I dette tilfellet viser det MID det samme mønster i begge fraksjoner, noe som tyder på at samme synteseveien er brukt, men er mer aktiv i S / G2 / M fasen. Disse data viser at metabolske forskjellene er lett påvisbar ved denne metoden selv mellom nært beslektede subpopulasjoner.
Figur 1: Eksperimentell design. Arbeidsflyt for utarbeidelse av fatet, mock sortert og sortert undergruppe ekstraCTS. Dish og mock sortert ekstrakter brukes i valideringen eksperiment MIDs av fatet og mock sortert ekstrakter i forhold til test for mulige endringer som følge av sortering. Kompleks populasjon av celler sortert på grunnlag av markør av den celletype av interesse, og deretter ekstrahert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Validering av MID mot direkte uttrekk. Scatter plott av (A) 13 C og 15 N berikelse i fatet og mock sortert prøver. Hver prikk representerer en gjengivelse. Triplicates er sammen med linjer. (B) 13 C- 15 N MID av glutamat. (C) 13 C MID av laktat. Feilstolpene er standardavvikene tre eksemplarer målerements. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Metabolsk forskjeller mellom cellesyklusfaser i HeLa-celler. Cytidine er merket annerledes i G 1-G 0 og SG 2 -M celler. (A) Cytidine 13 C anrikning i G 1 -G 0 og SG 2 -M faser av cellesyklusen. Stiplet linje står for karbon berikelse fra naturlig masse isotop. (B) Cytidine MIDs vist som matrise tomter i G 1-G 0 og SG 2 -M faser. Feilstolpene er standardavvikene tredoble målinger. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metode er basert på prinsippet om at MID i cellulære metabolitter gjenspeile "historie" av metabolske aktiviteter i en celle. Dette gjør det mulig å undersøke metabolske aktiviteter i undergruppe av celler, som de oppsto i den komplekse fellesskap av celler, før cellesorteringsprosedyren. I motsetning til dette topparealene for metabolitter varierer betydelig mellom ekstrakter av sorterte cellene og direkte ekstraksjon fra kulturskål 11. Dette er delvis fordi den annen kjemisk sammensetning forandrer signalrespons i massespektrometri, en såkalt "matrix-effekten", men vi har også vist at aminosyrer er tapt fra cellene under sortering, mens celler blir holdt i buffer 11. Dette kan endre metabolske tilstand og aktiviteter celler under sortering, men dette er i seg selv irrelevant for vår metode: forutsatt at MID er rimelig nær de som ble observert i direkte ekstraksjon, forblir dataene en valid måling av den metabolske tilstand i hver undergruppe i den opprinnelige, kompleks kultur.
Vi først testet en metode hvor celler ble sortert direkte inn ekstraksjon oppløsning (metanol) for raskt å slukke forbrenningen. Dessverre er de resulterende ekstrakter ble vanskelig å analysere, da de inneholdt høye nivåer av salter og eventuelt andre forurensninger fra cellesorterer skjermfluid, noe som resulterer i massiv ion undertrykkelse på vårt massespektrometri system. Vi avgjort derfor på protokollen som er beskrevet her, der overflødig væske avsatt av cellen sorter instrumentet er vasket ut før ekstraksjon.
Vår protokoll innebærer sortering i HBSS, en fysiologisk saltoppløsning supplert med glukose for å opprettholde cellenes levedyktighet. På noen måter, kan det være å foretrekke å sortere celler i selve dyrkingsmediet for å minimalisere metabolsk stress som aminosyre lekkasje. Imidlertid er det vanskelig å vaske liten pellet av sorterte cellene, og Therefore metabolitter som er tilstede i mediet ville forurense de søkte MID av intracellulære metabolitter. Når 13C-merket glukose blir anvendt som en tracer, bør identisk merket glukose anvendes i HBSS løsning også.
Som vist i figur 2, er mange, men ikke alle metabolitter, opprettholde sine MID etter cellesorteringsprosedyren. Vi vet ikke hvorfor enkelte metabolitter (laktat, for eksempel) er spesielt endret. Dette resultatet understreker at det er viktig å kontrollere at MID av interesse er robust mot celle sortering prosedyren ved mock sortering. Selv om det ikke er mulig direkte å kontrollere MID av en sortert undergruppe, bør MID som ikke påvirkes av uekte sortering (glutamat, for eksempel) være upåvirket av selve sorterings så vel som fremgangsmåten er identisk med unntak av celleseleksjon. Dette valideringstrinnet bør utføres når som helst en ny celletype eller dyrkingsbetingelser anvendes. Det er viktig å påpeke at our metoden er begrenset til metabolitter som robuste MID kan verifiseres på denne måten.
Vi regner med at fremgangsmåten som er beskrevet her vil være nyttig i en rekke anvendelser innen cellebiologi og biomedisin. Eksempler innbefatter metabolske fenotyper av ko-dyrkede celler slik som stamceller - mater lagskulturer, neuron-astrocyttkulturer modellene 4, subpopulasjoner av blodceller 2, og også sammensatte celle populasjoner isolert fra dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
