Introduction
Высшие организмы содержат сложные сообщества различных типов клеток, которые взаимодействуют, чтобы вызвать более сложных функций. Например, опухоли содержат не только раковые клетки, но также и фибробласты, клетки , которые составляют кровеносные сосуды, и часто иммунной клетки инфильтратах 1; Кровь содержит сложную смесь десятков подвидов клеток иммунной системы 2; и даже культивируемые клеточные линии могут состоять из нескольких субпопуляций, таких как полостную и базальных подтипов клеток рака молочной железы 3. Более того, различные типы клеток, которые сосуществуют могут проявлять метаболическую "сотрудничество". Например, в головном мозге, астроциты , как полагают , для превращения глюкозы в лактат, который затем "кормили" на нейроны , которые окисляют этот субстрат 4; Т - лимфоциты , в некоторых контекстах , зависящих от соседних дендритных клеток в качестве источника цистеина 5; и раковые клетки могут взаимодействовать с AssoФибробласты в лем, связанных опухолей 6. Чтобы понять метаболическую поведение таких систем, необходимо отделить и измерить метаболической активности различных типов клеток, присутствующих.
До сих пор наиболее широко используемый метод для разделения типов клеток является флуоресценция активированных сортировки клеток. Этот метод широко применим, при условии, что тип клеток или состояние интереса может быть "меченый" с использованием флуоресцентных антител, экспрессию сконструированных флуоресцентные белки или другие красители. Одним из вариантов является изначально отдельных типов клеток через ячейку сортировщика, повторно культуры отдельные типы клеток , полученные, а затем проводить исследования метаболизма этих культур 7. Тем не менее, это только осуществимо, если тип клеток или фенотип стабилен в условиях культивирования, и не могут захватывать переходное поведение, такие как состояния клеточного цикла, ни метаболического сотрудничества в совместных культурах. Для таких случаев, обмен веществ должно быть измерено непосредственно на такrted клетки. Это является сложной задачей , так как клетка процедуры сортировки подвергает клетки к стрессам , которые могут исказить их метаболизм 8, и мы отдаем себе отчет лишь несколько исследований такой подход 9, 10. В частности, мы обнаружили , что основные метаболиты , такие как аминокислоты могут вытечь из клеток , хранящихся в буфере сортировки клеток, таким образом , что измерения абсолютной метаболита изобилии перестают быть надежными 11 (хотя относительное сравнение между отсортированных фракций все еще может быть ценным).
Чтобы обойти эти проблемы, мы обозначаем клетки со стабильными изотопами до сортировки, и сосредоточить внимание на MIDs в клеточных метаболитов, а не метаболит содержаний. Так как MIDs формируются в течение более длительных временных масштабах, они должны быть менее подвержены воздействию кратковременного воздействия условий сортировки. Мы количественно с помощью масс-мобильные интернет-устройства спектрометрии высокого разрешения полного сканирования, которое является достаточно чувствительным, чтобы обеспечить йата на сотни метаболитов, начиная с приблизительно 500 000 отсортированных клеток, требующих около 30-60 мин времени сортировки клеток. Сравнение между "издеваться" сортируется управления (клетки, передаваемые через клеточный сортер инструмента без стробирования какой-либо конкретной популяции) и экстракции метаболита непосредственно из культуры блюдо сделано, чтобы гарантировать, что наблюдаемые MIDs являются репрезентативными в исходной культуре. В зависимости от выбора стабильных изотопных индикаторов, различные метаболические пути могут быть изучены с помощью этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. метаболита Extraction
- Извлечение из тарелки
- Культура клеток в 6-луночного планшета в трех повторах в стабильных изотопных маркированы культуральной среды + Диализованные добавки (сыворотки или другие добавки роста) до тех пор, пока клетки не станут 75% сплошности.
Примечание: Здесь культуры HeLa клетки в течение 48 ч в среде RPMI , содержащей 40% U- 13 С-глюкозы и 70% U- 13 C, 15 N 2-глутамина и 5% FBS , диализуют (эмбриональной бычьей сыворотки). Диализовали FBS используется, чтобы избавиться от мелких метаболитов молекулярным весом, которые могут загрязнить меченого СМИ. Культивирование клеток в диализу добавки до начала реального эксперимента рекомендуется, чтобы обеспечить клетки растут, как правило, в среде. Добавки диализовали в 0,15 М растворе NaCl в течение ночи с помощью змеиной кожи диализной трубки. - В день экстракции сброшенных культуральной среды, промыть лунки дважды промывали 500 мкл холодного HBSS и затем выбросить его.
Примечание: Здесь используют HBSS, содержащий 40% U-13 С-глюкозой , так как он также в культуральной среде. - Добавить 600 мкл 100% метанола предварительно охлаждены на сухом льду.
- Передача блюдо с сухим льдом и удаления клеточного материала с клеточным скребком.
- Тщательно пипеткой экстракты клеток в микроцентрифужных пробирку и хранить при температуре -80 ° С до масс-спектрометрического анализа.
- Культура клеток в 6-луночного планшета в трех повторах в стабильных изотопных маркированы культуральной среды + Диализованные добавки (сыворотки или другие добавки роста) до тех пор, пока клетки не станут 75% сплошности.
- Добыча фиктивных отсортированных клеток
- Культуры клеток в 100 мм блюдо в трех повторах в стабильных изотопов помечены медиакультуры + диализованных добавки.
Примечание: Здесь культуры HeLa клетки в течение 48 ч в 100 мм чашку , так как большое число клеток (~ 4 х 10 6) необходимы для получения 500000 отсортированных клеток. требовалось Это число клеток экстракта HeLa для получения хорошего измерения метаболитов. Культуральные среды использовали среду RPMI , содержащей 40% U- 13 С-глюкозы и 70% U- 13 C, 15 N 2-глутамина и 5% диализовали ФБС. - В день экстракции, сброшенных культуральной среды, промыть лунки WIth 1,5 мл теплой HBSS, а затем выбросить его.
- Отделить клетки путем добавления 1,5 мл трипсин / ЭДТА в течение 4 мин при 37 ° С. Выполните следующие действия в 4 ° С или на льду.
- Деактивировать трипсина путем добавления 3 мл ледяной HBSS (Hank сбалансированный солевой раствор) + диализированную добавки.
- Собирают клетки в 15 мл пробирку и центрифугируют при 750 х г в течение 3 мин.
- Ресуспендируют осадок в HBSS + диализу добавки + 1 мМ ЭДТА при концентрации 1-2 х 10 6 клеток / мл, проходят через клеточные сита 40 мкм , чтобы получить отдельные клетки, и переносят в 5 мл пробирку.
- Сортировка клеток через клеточный сортер стробирования только для синглета, и центрифуга сортируется клетки при 750 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
Примечание: Сортирование HeLa клетки со скоростью 1000 событий / сек, с давлением 27 фунтов на квадратный дюйм прибора, а также с помощью сопла 100 мкм. HeLa клетки большие, поэтому они должны быть отсортированы с медленной скоростью событий и большого сопла, чтобы получить как нетронутыми гранул, как это возможно. Держите клетки в холодных блоков throughouт сортировки, чтобы уменьшить метаболизм. Подробное описание процедуры сортировки описано ранее 12. - Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 50 мкл охлажденного льдом дН 2 O для получения гомогенной гранул перед добавлением метанола. Добавление холодного метанола непосредственно к осадку образует твердый осадок, который трудно ресуспендирования.
- Экстракт метаболитов путем добавления 540 мкл метанола хранить в сухом льду и держать выдержки при температуре -80 ° С до жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии высокого разрешения (LC-HRMS) анализа.
- Культуры клеток в 100 мм блюдо в трех повторах в стабильных изотопов помечены медиакультуры + диализованных добавки.
- Выделение клеточного цикла отсортирован клеток
- Культуры клеток в 100 мм блюдо в трехкратном повторе в культуральной среде + диализуют добавок.
Примечание: Здесь культура клетки HeLa , содержащие Geminin Fucci Green (MAG1-hGem) зонд 13 , который позволяет для сортировки G1 (отрицательной) и SG2M (положительных) клеток. Клетки могут культивироваться в стабильных изотопов отслеживания носителей вS длиной по мере необходимости. Здесь мы культивировали их в течение 46 часов в немаркированной средах, а затем мы перешли к RPMI , содержащую 40% U- 13 С-глюкозы и 70% U- 13 C, 15 N 2-Глютамин 2 часа до начала сортировки. Это было сделано для того, чтобы иметь возможность изучить фазы клеточного цикла, который требует короткого импульса маркировки. - В день экстракции, сброшенных культуральной среды, промыть лунки 1,5 мл теплой HBSS, а затем выбросить его.
- Отделить клетки путем добавления 1,5 мл трипсин / ЭДТА в течение 4 мин при 37 ° С. Выполните следующие действия в 4 ° С или на льду.
- Деактивировать трипсина путем добавления 3 мл ледяной HBSS + диализовали добавки.
- Собирают клетки в 15 мл пробирку и центрифугируют при 750 х г в течение 3 мин.
- Ресуспендируют осадок в HBSS + диализу добавки + 1 мМ ЭДТА при концентрации 1-2 х 10 6 клеток / мл, проходят через клеточные сита 40 мкм , чтобы получить отдельные клетки, и переносят в 5 мл пробирку.
- Сортировка клеток через клеточный сортер гтем создания из обломков и дублетов, а затем стробирования для клеточного маркера интерес, и центрифуга отсортирован клетки при 750 мкг в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: Сортирование HeLa клетки со скоростью 1000 событий / сек, с давлением 27 фунтов на квадратный дюйм прибора, а также с помощью сопла 100 мкм. Хранить клетки в холодных блоках по всей сортировке, чтобы уменьшить скорость метаболизма. - Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 50 мкл охлажденного льдом дН 2 O для получения гомогенной гранул перед добавлением метанола. Добавление холодного метанола непосредственно к осадку образует твердый осадок, который трудно ресуспендирования.
- Экстракт метаболиты путем добавления 540 мкл метанола, хранить в сухом льду и держать выдержки при температуре -80 ° C до проведения анализа LC-HRMS.
- Культуры клеток в 100 мм блюдо в трехкратном повторе в культуральной среде + диализуют добавок.
Анализ 2. Масс-спектрометрия
Примечание: Здесь мы опишем протокол для анализа клеточных экстрактов на системе LC-HRMS. Могут быть использованы любые методы метаболомики для анализа клеточных экстрактов. Полное сканированиеанализ может быть полезен для обнаружения широкого спектра метаболитов.
- Калибровка прибора с помощью масс-спектрометрии эталонного калибровочного смеси.
- Оттаивания клеточные экстракты на льду в течение 30 мин и вортексе в течение 15 с.
- Перенести 100 мкл клеточного экстракта в спиновый фильтр и центрифугировать в течение 10 мин при 13000 х г при температуре 4 ° С.
- Вводят 12,5 мкл фильтрата на систему LC-HRMS.
- Отдельные метаболиты, использующие цвиттерионная Гидрофильные Interaction жидкостной хроматографии (ZIC-HILIC) колонка (150 мм х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), снабженными защитной колонки ZIC-HILIC (20 мм × 2,1 мм) с использованием градиента элюции 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель) и ацетонитрил (растворитель B). Запустите градиентное элюирование при 20% растворителя А и увеличение до 80% в 17 мин. Поддерживать этот процент в течение 4 мин с расходом 400 мкл мин -1 и температуре колонки и поднос образца при температуре 23 ° С и 4 ° С, соответственно.
- Используйте Instrument в сочетании с хроматографического разделения для обнаружения метаболитов, нагретую электрораспылением (H-ESI II) в положительных и отрицательных мод как источника ионизации, а также полный режим сканирования сбора при разрешающей способности масс-70000 Полная ширина половины максимума (FWHM) ( м / з 200).
- Использование азота (чистота> 99,995%) для газа оболочки и вспомогательного газа при скорости потока 45 и 10 а.е. (в произвольных единицах) и заданной температуры испарителя при температуре 350 ° С, напряжение электроспрея при 4 кВ в положительном режиме и -3.5 кВ в отрицательном режиме.
3. Анализ данных
- Выберите ряд метаболитов, для которых стандарты доступны и которые показывают хорошие качества пиков в образцах. Хорошие пики качества имеют высокое отношение сигнала к шуму. Важно, чтобы проверить качество пика и убедитесь, что не включают в себя ложные изотопы. Изотопные пики, которые различаются по форме и / или времени удерживания, вероятно, ложно.
- Для получения изотопно-меченных образцов расчета масс изотополога (MI), фракции путем деления площади пика каждого инфаркта миокарда с общей суммой площадей пиков всех MIS.
- Вычислить меченые фракции углерод / азот, обогащение 13 С и 15 N, соответственно,
где N является общее число атомов углерода (или атомам азота, соответственно) в метаболит, и микширование ИН фракция х.
Все расчеты могут быть выполнены с использованием языков программирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера, здесь мы опишем эксперимент следственную метаболизм клеток HeLa, отсортированный по фазе клеточного цикла. Для того, чтобы маркировать широкий диапазон центральных метаболитов на обоих атомов углерода и азота, мы культивировали клетки в течение 48 ч с использованием U- 13 C-глюкозу и U- 13 C, 15 N-глутамина в качестве изотопных индикаторов. Для того, чтобы получить насыщенные средние частоты для эксперимента проверки, мы здесь выбрали смесь 40% U- 13 С-глюкозы и 70% U- 13 C, 15 N 2-глутамин, а промежуточные уровни изотопов , как правило, генерируют более разнообразных моделей MI 14.
Для эксперимента проверки мы провели целенаправленный анализ 85 метаболитов. После того, как качество управления шаги, чтобы удалить плохие качества пиков LC-MS, мы смогли обнаружить 69 пиков в экстрактах прямых клеток, из которых 66 находились в фиктивных сортируется клеток (96%). 60 из них, как представляется, помечены(изотопное обогащение выше изобилие природных ресурсов), и в большинстве случаев их MIDs были похожи между чашей экстрактами и напускной отсортированных клеток (Фигура 2А). Например, в середине глютамата (который включает в себя как 13 С и 15 N MIS) аналогично между чашей и напускной отсортированных экстрактов (Фигура 2В), что свидетельствует о том , что глютамат MID надежен также в популяциях отсортированных клеток. Тем не менее, некоторые метаболиты явно затронуты сортировкой процедуры: например, лактат было меньше 13 C 3 в фиктивных отсортированных клеток, по неизвестным причинам. Такие метаболиты следует рассматривать с осторожностью при анализе данных от фактических отсортированных фракций. В фиктивных отсортированных клеток, 91% от измеренного MI фракции имели стандартное отклонение менее чем на 1% через биологические трехкратном повторе, что свидетельствует о том, что MIDs были высоко воспроизводимыми в отсортированном клетках.
Далее мы проанализировали HeLa рассортированы либо G0 / G1 или S / G2 / M клеточного цикла sTages с использованием Fucci Geminin зонда 12. Поскольку эти этапы клеточного цикла длятся только ~ 10 ч, мы здесь "пульс" меченый культуры в течение 2 ч для достижения различных маркировки изотопа между стадиями. Например, мы отмечали , что цитидин метят в обеих популяциях, но к более высокому обогащению в / G2 / M стадии S, в соответствии с увеличением синтеза De Novo нуклеотидов во время фазы S (рисунок 3). В этом случае, MID показывает ту же картину в обеих фракциях, предполагая, что используется тот же путь синтеза, но более активен в / G2 / M стадии S. Эти данные показывают, что метаболические различия легко обнаружить с помощью этого метода, даже между близкородственных подгруппах.
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. Рабочий процесс для приготовления блюда, издеваться сортируются и сортируются субпопуляции дополнительныеКТС. Блюдо и напускной отсортированные экстракты используются в эксперименте проверки MIDs блюдо и напускной отсортированных экстрактов по сравнению с тестом для возможных изменений, вызванных сортировки. Комплекс популяция клеток сортируется основана на маркер типа клеток, представляющих интерес, а затем экстрагируют. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Проверка MIDs от прямых извлечений. Точечные участки (А) 13 C и 15 N обогащение в блюдо и напускной отсортированные образцы. Каждая точка представляет собой копировщика. Утраивает соединяются с линиями. (B) 13 C- 15 N MIDs глутамата. (C) 13 C MIDs лактата. Столбики ошибок представляют собой стандартные отклонения трех экземплярах колбыбований. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Метаболические различия между фазами клеточного цикла в клетках HeLa. Цитидин обозначен по- разному в G 1 -G 0 и SG 2 -M клеток. (А) цитидин 13С обогащение в G 1 -G 0 и SG 2 -M фазы клеточного цикла. Пунктирная линия означает обогащение углерода из природного массового изотопа. (Б) цитидин MIDs показаны в виде участков массива в G 1 -G 0 и SG 2 -M фаз. Столбики ошибок представляют собой стандартные отклонения трех измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш метод основан на принципе, что MIDs в клеточных метаболитов отражает "историю" метаболической активности клетки. Это дает возможность исследовать метаболические деятельности в субпопуляции клеток, так как они имели место в сложном сообществе клеток, до процедуры сортировки клеток. В отличие от этого , площади пиков метаболитов заметно различается между экстрактами отсортированных клеток и прямой экстракции из культуральной чашке 11. Отчасти это происходит потому , что различные химические композиции изменяет отклик сигнала в масс - спектрометрии, так называемый "эффект матрицы», но мы также показали , что аминокислоты теряются из клеток в процессе сортировки, в то время как клетки сохраняются в буфере 11. Это может привести к изменению метаболического состояния и деятельности клеток во время сортировки, но это само по себе не имеет значения для нашего метода: при условии, что MIDs достаточно близки к тем, которые наблюдаются в прямой экстракции, данные остаются Валиd измерение метаболического состояния каждой субпопуляции в оригинальной, сложной культурой.
Сначала мы протестировали метод, где клетки сортировали непосредственно в раствор для экстракции (метанол) быстро утолить обмен веществ. К сожалению, полученные экстракты трудно анализировать, поскольку они содержали большое количество солей и, возможно, других загрязняющих веществ из клетки сортировщик оболочки жидкости, что приводит к массовому подавлению ионов от нашей системы масс-спектрометрией. Поэтому мы остановились на методике, описанной здесь, где осаждается на клеточный сортер инструмент лишняя жидкость вымывается до экстракции.
Наш протокол предполагает сортировку в HBSS, физиологического солевого раствора с добавлением глюкозы для поддержания жизнеспособности клеток. В некотором смысле, может быть предпочтительным, чтобы сортировать клетки в фактической культуральной среде, чтобы свести к минимуму метаболического стресса, таких как утечка аминокислоты. Тем не менее, трудно промывать небольшой осадок отсортированных клеток, и therefрудных метаболитов, присутствующих в среде будет загрязнять искомых средние частоты внутриклеточных метаболитов. Всякий раз , когда 13 С-меченого глюкоза используется в качестве изотопного индикатора, идентичный меченой глюкозы следует использовать в растворе HBSS , а также.
Как видно на рисунке 2, многие, но не все метаболиты, сохраняют свои мобильные интернет - устройства после процедуры сортировки клеток. Мы не знаем, почему некоторые метаболиты (лактат, например) специально изменены. Этот результат подчеркивает, что крайне важно, чтобы убедиться, что MIDs интересов устойчивы к клетке процедуры сортировки по притворным сортировкой. Несмотря на то, что невозможно проверить непосредственно середине сортированного субпопуляции, MIDs, нечувствительных к притворным сортировкой (глутамата, например) не должны влиять фактическая сортировка, а также, как процедура идентична для выбора ячейки, за исключением. Этот этап проверки следует проводить всякий раз, когда новый тип клеток или культуры условие используется. Важно отметить, что OУр способ ограничен метаболиты, для которых надежные MIDs могут быть проверены таким образом.
Мы предполагаем, что описанный здесь метод будет полезен в ряде применений в области клеточной биологии и биомедицины. Примеры включают метаболические фенотипы сотрудничестваСостояния культивируемые клетки , такие как стволовые клетки - культур фидерного слоя, модели нейрон-астроцитов 4, субпопуляции клеток крови 2, а также сложные клеточные популяции , выделенные из животных моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
