Bioengineering

Hastalık Teşhis için Taşınabilir Görüntüleme ve Analiz ile birleştiğinde Manyetik Levitasyonunun

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/55012

Stephanie M. Knowlton¹, Bekir Yenilmez², Reza Amin², Savas Tasoglu^1,2

¹Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, ²Mechanical Engineering Department, University of Connecticut

Introduction

Burada, bir teknoloji platformu ve hastalık için bir gösterge olarak hastanın hücrelerinin yoğunluğu dağılımını analiz için otomatik görüntüleme ve analiz ile birleştiğinde manyetik kaldırma kullanan bir teknik sunuyoruz. yoğunluk tabanlı sitometri analizi için bu çok yönlü yaklaşım sonuçta hastalık teşhis bir dizi uygulanabilir. Ancak, sırayla nokta-bakım testi ile uyumlu olacak şekilde ve gelişmekte olan ülkelerde kullanmak, teknik düşük maliyet, taşınabilirlik ve kullanılabilirlik şartını yerine getirmelidir. Cihaz ve sarf malzemeleri kolayca düşük maliyetle elde edilmelidir. numune hazırlama, basit olmalı, analiz kullanıcı girişi veya yorumlanması için asgari gereksinimleri ile otomatik olmalıdır ve sonuçları hızlı bir şekilde iade edilmelidir. Bundan başka, cihaz klinik hem de gelişmekte olan ülkelerde yararlı olduğu kompakt ve taşınabilir olmalıdır. Böylece, nokta-bakım uyumlu technol manyetik olarak kaldırılmasının kullanmak için bir cihaz ve metod geliştirdikbağlantı otomatik görüntüleme ve görüntü analizi ile ogy hastanın hücrelerinin bir nüfus yoğunluğu dağılımı ile ilgili sonuçları döndürmek için.

Nokta-bakım teknolojileri mevcut klinik laboratuvar test prosedürleri üzerinde kayda değer bir avantaj sunuyoruz. mevcut teknoloji bir klinisyen tarafından sahip olunan çok pahalı ya da sağlık personeli tarafından yürütülecek çok karmaşık. Bu işlemlerin çoğu eğitimli bir teknisyen tarafından yapılmalıdır emek-yoğun protokolleri gerektirir. Bu nedenlerle, bu tür kan veya idrar gibi hasta numuneleri genellikle testin sonuçlarını almak için doktor birkaç gün sürebilir klinik test için bir uzaktan, merkezi test laboratuarı, transfer doktorun ofisinde toplanır. Bu (sigorta ödeyenler üzerinde bir mali yük neden) Bu test çok pahalı ve verimsiz hale getirir, bazı durumlarda tedavi sırasında gecikmelere veya komplikasyonlara neden, ve daha fazla sayıda kılardüşük kaynak ayarları ve gelişmekte olan ülkelerde erişilemez teşhis.

Burada, gömülü görüntüleme ve işleme (Şekil 1) ve akıllı telefon-uyumlu bir cihaza (Şekil 2) ile bir cihaz hem de otomatik görüntüleme ve analiz ile birleştiğinde bir manyetik kaldırma tekniği sunuyoruz. Bu manyetik kaldırma tabanlı aygıtlar potansiyele sahip bir geniş uygulanabilir platform teknolojisi farklı tıbbi teşhis uygulamaları bir dizi uygulanacak temsil etmektedir. Manyetik kuvvet ve kaldırma ^{^{^kuvveti, 1,}} ^{^2,} ^3: iki kuvvet arasında bir denge göre bir manyetik kaldırma yaklaşımı çalışır. bir tanecik, bir paramanyetik bir ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş ve iki Magn arasındaki merkez hattına doğru yönde parçacık bir manyetik kuvvet etki, birbirine bakan kutbu olan iki mıknatıs tarafından üretilen manyetik alana yerleştirildiğinde ets. kaldırma kuvveti süspansiyon ortamı ile karşılaştırıldığında partikül bağıl yoğunluk neden olur ve, çevreleyen ortamda daha yoğun parçacıklar halinde az orta daha yoğun ve aşağı doğru parçacık halinde yukarı doğru olan almaktadır. Bu iki gücün dayanarak, parçacıklar bu iki kuvvetleri dengeleyen alanında bir denge kaldırma pozisyonu ulaşacak; Bu pozisyon, doğrudan daha az yoğun parçacıklar daha alanında düşük levitating yoğun parçacıklar parçacık yoğunluğu ile ilgilidir. Bir görüntüleme modülü ya yerleşik bir akıllı telefon makinesi ^{^4,} ^{^5,} ⁶ ya da büyütme merceğinin ^{^7,} ⁸ ile donatılmış bağımsız optik bileşenlerin, parçacık pozisyonları görselleştirmek için kullanılmaktadır. Görüntü işleme, ya bir akıllı telefon uygulaması ile ^{^4,} ^{^5,}= "xref"> 6 veya dahili bir veri işleme ünitesi ^{^7,} ^8, daha sonra, bu nedenle, nüfus yoğunluğu dağılımı dağılımını ölçmek ve çekilen görüntülerin işler. Bu mililitre başına ilgi sadece birkaç partiküllerle gibi daha büyük bir numune (analiz etmek için, akışı, parçacıklar olarak kaldırılan doğrudan cihazın içine entegre edilmiş ve görüntüleme bölgesi boyunca (Şekil 2) geçerken analiz edilebilir.

Şekil 1: Kendi kendine yeten Manyetik Levitasyonunun Platformu. (A) bir görüntü ekranı olan bir manyetik odaklama modülü, görüntüleme bileşenleri (bir ışık yayan diyot (LED), bir optik mercek ve bir kamera detektörü) ve bir işlem ünitesi içeren kompakt bir manyetik kaldırma cihazı. (B) cro Manyetik alan şiddetiNumune eklenir mıknatıslar arasındaki alanın ss bölüm. alan gücü mıknatıslar yüzeyinde büyük olan ve aralarında merkez de sıfırdır. (C) Parçacıklar, örneğin hücreler gibi, manyetik alan deneyimi çeşitli kuvvetler içinde: manyetikler arasında merkez doğru manyetik kuvvet (F _m), büyüklüğü ile parçacığın pozisyonuna göre değişen; süspanse edici ortam o göreceli parçacık yoğunluğuna bağlıdır yerçekimi kuvveti (F _g ') ve partikül hareketi direnen bir sürtünme kuvveti (F _d). Yenilmez gelen izni ile, çoğaltılamaz, vd. ⁸ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
incirure 2: Smartphone uyumlu Akış destekli Manyetik Levitasyonunun Platformu. (A - c) Ön (a) sırt, yan (b) ve (c) manyetik kaldırma cihazı (d) cihazın bileşenleri şunlardır görüşleri: 1) Manyetik kaldırma modülü, sürekli mıknatıslar, bir büyüteç dahil, ve LED ve ışık difüzörü, bir mikrodenetleyici, pompa sürücü ve Bluetooth alıcısı da dahil olmak üzere 2) akıllı telefon kılıfı, 3) elektronik, 4) mikro pompa tutucu, 5) ayarlanabilir delik, 6) atık tüp tutucu, 7) pil tutucu, 8 ) örnek tutucu, 9) çift amaçlı standı ve kapak. (E) manyetik alan sayesinde numunenin pompalama gösteren şematik akış. (F) alan üzerinden pompalanan farklı yoğunluktaki parçacıklar hale nasıl gösteren manyetik kaldırma modülü, kesiti; daha az gibi Parçacık 1, olarak yoğun parçacıklar, daha yüksek bir kaldırma yüksekliği t dengelenmesi olacakBöyle Parçacık 2. olarak han yoğun parçacıklar, vd Amin, gelen izni ile, çoğaltılmıştır. ¹ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu sistemde yoğunluk dağılım analizi için herhangi bir numunenin kullanılması için asgari gereksinimler hücreleri ya da yaklaşık olarak 5 um'den daha büyük ve yaklaşık 250 um (görüntüleme ve görüntü işleme için) boyutu daha düşük parçacıklar ve onun uyumluluğu bir süspansiyonunu elde etmek için yeteneği, burada kullanılan gadobutrol gibi para-manyetik bir solüsyon çözelti içinde karıştırılması. Hastalık teşhis için uyumlu uygulamalar, sağlıklı kontrollere göre bir hastalık taşırken doğal değiştirilmiş bir yoğunluğa sahip olan (I) 'in ilgili hücreler olanlar, (ii) bir yoğunluğa değişikliği bir reaktif ya da eklenmesi ile hücre içinde indüklenebilir içerir kısa bir alternatif tedavicubation süresi, ya da (iii) Farklı hücre tipleri tek bir numunede bulunan tanımlanmış ve doğal (ya da tedavi ile) olan benzersiz özelliklerinden yoğunluklarına sahiptir.

Orak hücre hastalığı aralıklı vazo-tıkayıcı olaylar ve kronik hemolitik anemi ⁹ neden olabilir bir kişinin kırmızı kan hücrelerinin (RBC) üretilecek olan hemoglobin, HbS, mutasyona uğramış bir biçimini, neden bir genetik bozukluktur. Bu hemoglobin izoelektrik son derece hassas ama onlar nokta-bakım ayarları ile uyumsuz olduğundan klinik test laboratuarı yapılmalıdır, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) fraksiyon ya da hemoglobin elektroforezi odaklama kullanılarak teşhis edilir. Orak hücre hastalığı için Çözünürlük ve kağıt bazlı testler önerilmiştir, ancak genellikle sübjektif kullanıcı yorumuna ve doğrulayıcı testler gerektirir edilmiştir. Burada, RB daha yüksek bir yoğunluğa ulaşmak, hangi orak eritrositlerde tanımlamak için bir yoğunluk tabanlı bir yaklaşım kullanırOrak hücre hastalığı olmayan insanlardan Cs. Mekanizma, deoksijene koşulları ^{^10,} ^{^11,} ^{^12,} ¹³ yaşın altındaki orak hücreli anemi eritrositlerde RBC su kaybına yol açar hemoglobin, HbS mutasyona uğramış formu polimerizasyonunu içerir.

Beyaz kan hücreleri (lökosit) ve eritrosit ^7: Bu yoğunluğa dayalı yaklaşım yoğunluğu temelinde farklı türde hücrelerin ayrılması için uygulanabilir. Lökosit genel yapısına enfeksiyonları mücadele sorumludur. WBC sitometri kanda bu hücrelerin sayısını ölçmek için kullanılan ve yararlı bir tanı aracı olarak hizmet vermektedir edilebilir. WBC enfeksiyonu, bağışıklık sistemi bozuklukları, ya da lösemi gösterebilir (genellikle mcL başına daha fazla 11.000 hücreleri kabul edilir) normalden yüksek sayar. WBC normal altındaki hesaplar (uL başına 3.500 hücre), otoimmün bozukluklar veya iklimlendirme kaynaklanabiliriyonları zarar veren kemik iliği. alternatif teknolojilerin aksine, burada sunulan işlem lökosit belirlenmesi amacıyla eritrositlerde veya lekeler parçalanması dayanmaz. WBC popülasyon yoğunluğu yoğunluk gradyan santrifüj ^{^2,} ³ ile daha önceden hesaplanan RBC nüfustan daha düşük olduğu rapor edilmiştir gibi bu hücre bazlı deney, ayırma işlemi için iki hücre türünün tek doğal yoğunlukları yararlanır.

1 dakikadan daha az gerektiren, 15 dakika ve otomatik görüntüleme ve analiz - uzak konumlarda değiştirici test ile karşılaştırıldığında, bu test, basit numune hazırlama (Şekil 3), 10 içindeki cihazda hücrelerinin ayrılması ile hızlıdır. Bu sayede, cihaz daha iyi, tıbbi kararlarını bildirmek tedavi fiziksel ve psikolojik acı hafifletmek için hemen tatbik izin ve komplikasyonlar derneğimizi riskini azaltmak için hızla sonuçları dönebilirsiniztıbbi bakım bir gecikme ile bir-. Bu teknik sayesinde minimum kullanıcı girişi veya yorumlanması ile bir sonuç döndürür basit örnek hazırlama ve otomatik görüntüleme ve analiz için yerinde klinik ortamlarda ya yapılabilir. Çünkü kalıcı numune analizi için mıknatıslar ve bir akıllı telefon veya görüntüleme ve görüntü işleme için basit elektrikli bileşenlerin ya kullanımını kullanarak basit bir yaklaşım kullanımı, cihaz yanı sıra her test maliyetleri bazı gelişmiş test prosedürleri ile karşılaştırıldığında çok az.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Açıklama: İnsan kan örnekleri içeren tüm işlemler, kurumsal düzenlemelere göre yapılmıştır. Tüm protokoller gözden ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bir bilgilendirilmiş onam tüm katılımcılar tarafından verildi.

Orak Hücre Hastalığı Tanı ⁵ 1. Numune ^Hazırlama, ⁸

Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde gadobutrol bir 50 mM çözelti hazırlayın.
gadolinyum çözelti içinde 10 mM sodyum metabisülfit çözeltisi ile çözülmüştür.
NOT: Sodyum metabisülfit Solunduğunda toksik ve güçlü deri ve doku tahriş ediyor. Su ile karıştırılmış bir korozif asittir. Yüksek sıcaklığa ısıtıldığında sülfür ve sodyum toksik oksit gazları yayarlar ayrışabilir.
Parmak çubuğu veya Venipunktür ya vasıtasıyla kan örneği almak.
1. Temiz, tek kullanımlık neşter ile bir delme cihazı kullanarak kan çizin. Apkat deldi sitede yakın basınç ve üç ya da dört kez pipet kullanarak kan toplama önce oluşmuş kan damlacık silin; bakmak değil, bu doku sıvısıyla numunenin kirlenmesine neden olacak gibi, doku sıkarak "süt" parmak için.
2. Alternatif olarak, standart vene girme prosedürleri ¹⁴ kullanılarak kan çizin.
  NOT: Numuneler bir kaç saatten fazla depolanacak ise, EDTA gibi bir antikoagülan olan bir vacutainer içine kan toplamak.
gadolinyum sodyum metabisülfit çözeltisi 100 ul kan az 1 uL ekleyin.

WBC Sitometri ⁷ 2. Numune Hazırlama

bölüm 1 deki gibi, Parmak çubuğu veya Venipunktür ya vasıtasıyla kan örneği almak.
İsteğe bağlı: Bir RBC parçalama tamponu ile Lyse RBCs. Pipet 5 RBC parçalama tamponu 500 uL kanın uL ve 3 için oda sıcaklığında inkübe - 5 dak.
NOT:Bu lökosit izole bir nüfus kaldırma aralığını doğrulamak için yapılabilir. Burada sunulan sonuçlar, eritrositler lökositlerden daha belirgin bir alt konumda havaya göstermektedir Ancak, bu adımı gerçekleştirmek için gerekli değildir.
HBSS 25 mM Gd 1000: tam kan 1 seyreltin
Not: 1 lize Örnek: 250 mM Gd 25 mM Gd içeren bir örnek elde etmek için, hücre liziz uygulandı eğer lize örnek 9 seyreltin.

Manyetik Levitasyonunun Platformu ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸ Kullanılması Örneklerin 3. Analiz

Manyetik kaldırma cihazı başlatın:
1. kendi kendine yeten bir cihaz için, cihazın fişi o kadar güç sağlayacak ve düz bir yüzey üzerine yerleştirin.
2. Akıllı telefon uyumlu sürümü için, akıllı telefon uygulamasını başlatmak ve görüntü girmek için sola kaydırındüz bir yüzeyde çekim modu, ve yer.
Statik manyetik havalanma için:
1. çözeltisi içine sonuna daldırma ve kılcal eylem yoluyla kılcal doldurmak için örnek vererek bir kare cam microcapillary tüpüne hazırlanmış örnek yükleyin.
2. Yavaş yavaş bir ucunu malzemenin içine kılcal iterek bir tüp dolgu ile sonuna mühür.
3. Tüp sadece 1 cm görünür kalır ve böylece manyetik kaldırma cihazının mıknatıslar arasındaki kılcal yerleştirin (bir örnek numune hazırlama için Şekil 3 bakınız).
  Not: Bu adım akıllı telefon uyumlu ve kendi kendine yeten cihazın her ikisi için de aynı kalır.
4. Cihazı veya kılcal bozmadan 10 dakika bekleyin.
Akış destekli manyetik havalanma için:
1. Numune tüpüne örnek yükleyin.
2. Numune kabı ve mi arasındaki giriş hortumunu bağlayıncrocapillary ve mikro-kılcal ve atık kabı arasında çıkış hortumunu bağlayın.
3. LED yoğunluğu ve akış parametreleri ayarlayın.
Daha sonra (kendi kendine yeten cihaz ve akıllı telefon uygulamasında ekranın alt kısmındaki kamera düğmesi düğmesini 3) bir görüntü yakalamak için yakalama düğmesine basın, hücreler görüş alanında görünür olduğundan emin olun.
NOT: USB görüntüleri saklamak için kullanılırsa, "görüntüler" adında bir klasör oluşturun ve önceki cihaza açmadan USB takın. hiçbir sürücü varsa, cihaz dahili bellekteki görüntüleri depolamak ve daha sonra transfer olacak.
NOT: Bazı görüntüler yakalanır ve görüntü yakalama arasındaki ½ cm hakkında içinde veya dışında kılcal hareket ettirerek anomalilerin riskini azaltmak için analiz edilebilir.
NOT: (algılanır ve kullanıcı arayüzünde belirtildiği gibi) görüş alanı içinde hücre sayısı çok yüksek veya çok düşük ise, cihazın içinde veya dışında kılcal kaydırmaya veya başka bir sa hazırlamakmple.
örnek çıkarın ve kurumsal veya yerel yönetmeliklere göre örnek atın. Kılcal damarların keskin olarak bertaraf edilmelidir.

Şekil 3,
Şekil 3: Hazırlık ve Kullanıcı Arabirimi Örnek. (A) örnek hazırlama yöntemi, öznenin parmak neşter kan damlası oluşturularak, örnek test çözeltisine bir kan damlası aktarılması, örnek çalkalanması ve kılcal hareket aracılığı ile bir kılcal boru içine yüklenmesi ve bir manyetik kaldırma içine örnek yerleştirilmesini içerir cihaz. (B) Bu numune hazırlama adımları da numune hazırlama rehberlik cihazın ekranında görüntülenir. (C) Cihaz dört düğme içerir: düzgün ayar düğmesini kullanarak odağı ayarlamak amacıyla numune görüntü içine yakınlaştırmak için bir düğme; Bir düğme tek m elde etmek içineasurement (bir 5 s gecikme örneği eklemek için kullanıcı için zaman tanımak için uygulanmaktadır); time-lapse ölçümü (6 görüntü 5 s aralıklarla alınır); ve bir düğme kullanımdan sonra cihazı kapatmak için. Yenilmez gelen izni ile, çoğaltılamaz, vd. ⁸ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4. Görüntü Analizi ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸

Uygun numune (hücre dağılımı veya hücre tipi ayırma) için cihaz üzerinde bulunan görüntü analiz yazılımı çalıştırın.
NOT: kendi kendine yeten cihaz için, analiz otomatik olarak gerçekleştirilir ve grafik kullanıcı arayüzü görüntülenir. Akıllı telefon uyumlu cihaz için, analiz yapmak, galeri a gidinistediğiniz video dosyasını seçin nd analiz edilecek.
Gözlemlemek ve analiz çıktısı ekranda görüntülenen kaydedin.
NOT: (örneğin orak hücre hastalığı teşhisi gibi) hücre dağılımı analizi için, çıkış hücresi nüfusun hapsi genişliği olacaktır.
NOT: (örneğin WBC kimlik gibi) hücre tipi ayrılması için, çıkış tespit WBC nüfusa sahip bir görüntü olacaktır. mikrolitre başına hücre sayısını hesaplamak için, 2,000 faktörü ile görüntü başına lökosit ortalama sayısını çarpın. 5 lökosit gözlenmiştir Örneğin, bu / ml 10.000 lökosit işaret eder. / UL 11,000 lökosit - normal aralık genellikle 3500 olarak kabul edilir.
veya ½ cm hakkında cihazın dışına numune tüpü hareketli ve yukarıda anlatıldığı gibi analiz edilecek başka bir görüntü yakalama analizler tekrarlayın.
NOT: analizi 5 tekrarlamak için tavsiye edilir - hatalarını önlemek için numune başına 6 kez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

orak hücre hastalığı tanısı için kullanılan bir tekniktir hücre yoğunluğu dağılımı analizi için, hedef hücre popülasyonunun dağılımının genişliği tespit etmektir. orak hücre hastalığı olmayan hastalardan alınan kan hücreleri öngörülebilir bir genişlik içinde sınırlı olacaktır. Orak hücre hastalığı olan hastalardan alınan hücreler hücre dağılımı bir düşüş eğikliği, daha geniş bir bölgesi boyunca dağıtılacak herhangi bir uygulama için (Şekil 4'e bakınız), bir eşik, sağlıklı bu karşı kontrol numuneleri dağılımı genişliği arasındaki ayarlanabilir ^{^5,} ⁸ "hastalık için olumlu" "sağlıklı" arasında bir kesme olarak örnekler.

Şekil 4,
Şekil 4: Densit Analiz Manyetik Levitation örneğiKan Örneklerinde Orak Hücre Hastalığı için Göstergesi Olarak y Dağılımı. Sol tarafta, kırmızı kan hücreleri de dar bir bölge içinde hapsedilir. Sağda, kırmızı kan hücrelerinin bir alt kümesi aşağı dağılımı eğriltme ve lohusalık genişliğini artırarak, daha büyük bir yoğunluk ve dolayısıyla daha düşük bir kaldırma yüksekliği ulaşmak. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir numunenin yoğunluk dağılımını analiz etmek, bir hesaplama algoritması cihazı içinde uygulanır. İlk olarak, dikey ve yatay eksen boyunca piksel yoğunluğu geçişlerini hesaplanır. mıknatıs kenarları ve kılcal kenarlar dikey piksel degrade profillerinde zirveleri olarak algılanır. İç kılcal kenarları arasındaki mesafe, piksel olarak 0.7 mm olduğu bilinmektedir ve bu nedenle, SCALI olarak kullanılanfaktörü ng milimetre piksel mesafeleri dönüştürmek. yatay eksen boyunca piksel yoğunluğu degrade hücreleri nerede olduğunu büyüğüdür. Bu gradyan profili analiz ve Gauss eğrisine uygun olduğu. Bu eğrinin değeri 4 kez standart sapma hapsi genişliği olarak bildirilmektedir.

Şekil 5 Sonuçlar kontrol ve orak hücreli anemi örneklerinin her ikisi için de hapsi genişlikleri göstermektedir. Burada, (50 mikron üstü) daha büyük bir sınırlandırıcı genişliğine sahip numuneler orak hücre hastalığı pozitif olarak düşünülebilir ve bu eşiğin altında olanlar hastalık için negatif olduğu kabul edilecektir. Orak hücre dağılımının analizi için diğer yöntemler ve arkadaşları, incelenmiş ve Yenilmez tarafından bildirilmiştir unutulmamalıdır. ⁸

Şekil 5,
şekil5: Orak Hücre Hastalığı Tanı için Etrafının genişliği miktarının belirlenmesi. kontrol (n = 4 konular üzerinde 48 görüntüler) ve orak hücre hastalığı (n = 93 resim üzerinde 10 konuları), kırmızı kan hücrelerinin hapsi genişliği için deneysel sonuçlar. Sonuçlar, Mann-Whitney-Wilcoxon iki yönlü test (normal yaklaşım, n, ₁ = 3, n = ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074) 'e göre istatistiksel olarak anlamlıdır. bıyık örneklerinden minimum ve maksimum hapsetme genişlikleri test temsil ve yıldızlarla outliers temsil etmektedir. Yenilmez gelen izni ile, çoğaltılamaz, vd. ⁸ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kan örneklerinde lökosit tanımlamak için kullanılabilir partikül ayrılması için, amaç, iki farklı popul tanımlamaktırations. popülasyonlarının farklı yoğunluklara sahip ise, bunlar görüş alanında farklı bölgelerde gözlenecektir. Bu nedenle, farklı yoğunluklara sahip iki veya daha fazla parçalarının homojen popülasyonları ayrılması üzerine, çoklu popülasyonunu resimde görülen ve görüntü analiz algoritması ⁴ kullanılarak tespit edilebilir, levitated edilebilir (bakınız Şekil 6).

iki farklı hücre tiplerinin ayrımı analiz etmek için, bir algoritma dengede iki ayrı popülasyonlarını ayıran hangi uygulanmaktadır. orak hücre hastalığı analizi için tarif edilene benzer şekilde, iki Gauss dağılımı örnek, yerine tek bir eğri uyum vardır. Piksel yoğunluğu geçişlerini her zirve farklı bir hücre popülasyonu temsil eder. Bu verilere uygun Gauss eğriler iki Gauss eğrisinin ortalama olarak (alt mıknatısın konumuna göre) ortalama kaldırma yüksekliği vermek vesınırlandırıcı eğrisinin ⁷ standart sapması olarak genişliği.

Şekil 6,
Şekil 6: Farklı Sıklıklarının ile mikropartiküllerin Karma Nüfus Manyetik Levitation örneği. (A) 12.5, 200 mM arasında değişen beş farklı Gd konsantrasyonlarda kaldırma yüksekliği mikrosfer yoğunluğu ilişkilendirmek Kalibrasyon eğrileri. Eğim dolayısıyla daha büyük bir çözünürlük (küçük yoğunluk farklılıkları yani duyarlılık) sunan Gd en düşük konsantrasyonlarda yüksektir. eğim algılama artan dizi gösteren Gd yüksek konsantrasyonlarda için ancak daha düşük çözünürlüğe sahip en düşük düzeydedir. (B), iki dakika boyunca iki farklı yoğunluklara sahip homojen bir örneği küreciklerin zaman bağımlı ayrılması. denge (sağ) at, iki ayrı bantlar görüntü anal tarafından tespit edilirSalman kararı algoritması. Yenilmez gelen izni ile, çoğaltılamaz, vd. ⁷ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Herhangi bir belirli bir uygulama için farklı yoğunluklara sahip tek tek hücre türlerini belirlemek için, ilk olarak istenen kaldırma yüksekliği ölçmek için her seferinde bir hücre tipi havaya tavsiye edilir. Şekil 7a eritrositler parçalanır edildiği bir kan örneğinden lökosit kaldırma yüksekliğini gösterir. Bu daha fazla analiz için lökosit lohusalık bölgeyi tanımlar. Sonuçlar eritrosit Böylece, lökosit kaldırma pozisyonuna göre, kan numuneleri ayırt edilebilir lökosit ve daha düşük havaya olduğunu göstermektedir. görüş verilen herhangi bir alanda hacmi 0.5 uL olduğunu. 1 oranında seyreltildi örneklerde: 1000, lökosit sayısı / ml sayılarak hesaplanır2.000 ⁷ kat görünümü ve çarparak alanında lökosit sayısı.

Şekil 7,
Şekil 7: Tüm Kan WBC Sitometri. (A) RBC lisizini takiben kan lökosit Levitasyonunun. Bu lökosit 25 mM Gd manyetik alanda havaya hangi aralığını tanımlar. (B) WBC sayım Örnek (lökosit mavi oklarla işaretli). Üst çerçeve dolgu lökosit gösterir ve alt çerçeve ve alt çerçeve kakma RBC nüfusu gösterir. Yenilmez gelen izni ile, çoğaltılamaz, vd. ⁷ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Bu süreçte kritik faktörler mıknatıslar düzgün hizalama içerir. mıknatıslar yerinden hale veya cihaz içinde normalden daha fazla ayrılmış, bu sonuçları etkileyebilir. İşlemin bu hata veya diğer kontrol etmek için, bir yoğunluk kontrol edilen bir parçacık, örneğin polistiren mikro-küreler olarak, zaman içinde değişim kontrol etmek için periyodik olarak kullanılabilir. Dahası, kaldırma zamanı hücreleri dengeye ulaşması için izin vermek önemlidir. kırmızı kan hücreleri için, 10 dakika tüm hücreler dengeye ulaşmasını sağlamak için yeterlidir. Ancak, daha küçük parçacıklar ya da hücrelerin dengeye ulaşması için daha uzun bir zaman gerektirebilir dikkat etmek önemlidir. Bu 5 s aralıklarla zaman atlamalı görüntü alarak ve zamanla hapsi genişliği komplo ile tespit edilebilir; Denge sınırlandırıcı genişlik değişim ihmal edilebilir nokta olarak tespit edilebilir.

protokolü dahilinde diğer kritik adımlar pre dahilBu kadar hassas konsantrasyonda gadolinyum solüsyonunun Terkip büyük ölçüde örnek kaldırma yüksekliğini etkiler. Bu önceden yapılan bir stok çözeltiden kullanılabilir, ancak çözeltisi ve konsantrasyon istenmeyen bir artış buharlaşmayı önlemek için uygun bir şekilde sızdırmaz hale getirilmelidir edilebilir. Dahası, bakım kullanılan hücrelerin sağlık durumunu korumak için alınmalıdır. Parmak çubuğu ile alınan insan kanı için, kan alındıktan sonra bir saat içinde kullanılan ve kapalı bir kap içinde depolayarak kurumasına izin verilmelidir. damarından alınan insan kanı için, numuneler antikoagülan (etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), burada kullanılan ortak bir antikoagülan) olan en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de depolanmalıdır. yapışan hücre hatları için, ölü hücreler tripsinizasyon ve hücreler, kullanılana kadar inkübe edilmelidir önceden kültüründen yıkanmalıdır. Hücre Sağlık yoğunluğu ve dolayısıyla kaldırma yüksekliğe etkilediği bilinmektedir, çünkü havalanma zamanda hücre sağlığı kritiktirt.

Değişiklikler ve Sorun Giderme
Biz manyetik alanda predicable yerlerde iki farklı yoğunluktaki hücrelerinin ayrılmasını ve hapsi göstermiştir. Diğer uygulamalarda, bu teknik uzatmak için, para-manyetik ortamın farklı formülasyon alternatif uygulamalar ³ saptanması arzu edilen bir aralığını elde etmek için kullanılabilir. Gadolinyumun konsantrasyonu (6a Şekil bakınız) tespit çözünürlüğü yanı sıra aralığı yönetir. gadolinyumun daha büyük konsantrasyonları, hücrelere uygulanan manyetik kuvvetin gücü, süspansiyon solüsyonunda gadolinyum yüksek konsantrasyonda artırmak için küçük bir kaldırma yüksekliği farkı hücre yoğunluğunda bir fark olacaktır. Bu hücre yoğunluğu küçük farklılıklar ayırt yeteneği olarak tanımlanan çözünürlüğü, sınırlandırırken, bu analiz edilebilir yoğunlukları aralığını arttırırd. Benzer şekilde, gadolinyum konsantrasyonunu azaltarak çözünürlüğünü artırmak, ancak algılama aralığı azalacaktır. Dahası, orta yoğunluklu yukarı ya da aşağı algılama sınırları kaydırmak için değiştirilebilir. kaldırma yüksekliği kontrol ikinci kuvvet süspansiyon ortamı ile karşılaştırıldığında hücre yoğunluğuna bağlıdır kaldırma kuvveti vardır. Burada, su bazlı süspansiyon çözeltisi (daha az yoğun veya yoğun hücreleri, sırasıyla, merkez üstünde ya da altında levitating iki mıknatıs arasındaki merkez ortam içinde Levitate ile aynı olan bir yoğunluğu olan bu hücrelerin, yani kullanılan daha önce tarif edildiği gibi aralık) manyetik kuvvet tarafından kontrol edilir. Çünkü kaldırma kuvveti hücre yoğunlukları daha yüksek bir dizi algılama aralığı kayacak ortamının yoğunluğunu artırmak yoğunluğuna bağlıdır. Benzer şekilde, bir düşük yoğunluklu orta kullanılarak hücre yoğunlukları daha düşük bir aralıkta doğru algılama aralığı kayacak. < / P>

Biz de kılcal genişliği boyunca normalize parçacık sayısı (bir parçacığın yani olasılık kılcal genişliği boyunca bir mesafede akmaya) miktarının akış destekli manyetik odaklama cihazın performansını araştırdık. Alt akış oranları parçacıkların en çok tutulmasını ancak yüksek hacimli numunelerinde az nesne algılama için bir dezavantaj olabilir daha düşük bir miktarda, ile sonuçlanır. Ancak, bu manyetik alanda veya daha uzun mıknatıslar vasıtasıyla birden fazla geçiş ile ele alınabilir. birden fazla hücre tipleri arasındaki ayrım, manyetik alanın sonunda bir mikroakışkan ayırıcı yararlanarak farklı yoğunluktaki parçacıklarını izole etmek için sonraki çalışmalarda kaldıraçlı edilebilir.

çok sayıda hücre türleri ayırırken, ortalama yüksekliği ve homojen bir popülasyonun levitating öncesinde her bir hücre tipinde çeşitlerini oluşturmak için her bir popülasyon havaya kaldırmak için yararlı olabilir.

e_content "> Tekniği Sınırlamalar
Burada sunulan işlemi ayrı yoğunlukları parçacıklarının ayrılması ile sınırlıdır. birden fazla hücre tipleri güvenilir kimlik elde etmek amacıyla, üst üste olmayan ayrık yoğunluk aralıkları sahip olması önemlidir. Bundan başka, tespit edilebilir partiküller boyut olarak sınırlıdır. Onlar microcapillary tüp içinde serbestçe hareket edebilmek olmalıdır - 200 mikron partikül çapı önerilen üst sınırıdır. Dahası, parçacıklar açıkça yansıması kadar büyük olmalıdır - 5 mikron çaplı önerilen alt sınırıdır.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Hücresel analizine Bu yaklaşım bünyesinde kullanıcı dostu analiz sağlayarak, basittir. Birçok tıbbi tanı yöntemleri klinik test laboratuarlarında yapılmalıdır ve test ekipmanları ve eğitimli laboratuar specialis tarafından gerçekleştirilen prosedürleri uzman gerektirirt. Ancak, bu protokol sağlık kliniklerine daha erişilebilir basit bir cihaz gerektirir. numune hazırlama basit ve analiz kullanıcı hatası riskini minimize otomatiktir.

Bu cihaz tıbbi durumların çeşitli hızlı, yerinde test sağlayacaktır. Cihaz nokta-bakım hastalığı teşhis için idealdir, kullanıcı dostu, etiket içermeyen ve taşınabilir. Uzak klinik laboratuvar testlerinin geçerli standardına göre, bu yaklaşım hızla hasta bakımı konusunda bilinçli kararlar için hekimlerin sağlamak ve potansiyel bakım gecikmeler nedeniyle komplikasyonları önleyecektir. Platform klinik ortamlarda bu yöntemin yaygın kullanımını sağlayarak ve gelişmekte olan ülkelerde ve sağlık dünya çapında ulaşılabilirliğin artırılması, kolay erişilebilir ve ucuz bileşenler ile dizayn edilmiştir.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Dikkat etmek önemlidirBurada anlatılan testler henüz geniş çaplı bir hasta popülasyonuna geçerliliği yoktur. Bugüne kadar, orak hücreli anemi tanısı, küçük bir hasta grubu ^{^2,} ⁵ teyit edilmiştir ve WBC sitometri kavramının bir kanıtı olarak ortaya konmuştur. Bu uygulamalar ve gelecekte geliştirilecek olanlar ile yapılan klinik çalışmalar, daha önce yapılan klinik kullanım için bu yöntemi doğrulamak amacıyla yapılmıştır, ama burada sunulan sonuçlar noktası tedavisi klinik teşhis için bu teknolojinin ve teknik nihai kullanım için umut vaat gerekir.

yoğunluk tabanlı sitometri analizi için bu yaklaşımı kullanarak sonuçta ek hastalık teşhis uygulamaları için uzatılabilir. Burada açıklandığı gibi hastalık teşhis için tek hücre manyetik havalanma Bu yaklaşım, hastanın hücrelerinin tek hücre süspansiyonları nedeniyle kullanımı çözünürlüğüne sınırlamalar mevcut sistemi kullanılarak görüntülü olabilir hücrelere kullanılmasını gerektirmektedirBir akıllı telefon kamera veya düşük maliyetli optik. Sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında hastalığı taşıyan zaman çıkar: (i) hücreler, değiştirilmiş bir yoğunluğa ulaşması gerektiği (ii) hücre yoğunluğu değişikliği ilavesiyle uyarılabilir olması gerekir: Bundan başka, bu yöntem, aşağıdaki koşullardan biri yerine hastalıklar için geçerlidir bir tepkime maddesi (veya herhangi bir uygun alternatif tedavi) ya da (III) ya da özel yoğunluklara doğal ya da tedavi yoluyla sahip tek bir numunedeki farklı hücre türleri tespit içermelidir teşhis. Aynı platformu aygıtı kullanarak diğer hastalıklara gelecek uygulamalar küresel sağlık üzerinde büyük bir etkisi olabilir. Bu yoğunluk ile ayırt edilir biyolojik bileşenlerin, saptanmasını içerebilir. Hücre ölümünü geçiren bazı hücre tipleri, hücreler ve hastalıklı hücreler tüm benzersiz yoğunluğu imzalar ve bu şekilde ayrı bir manyetik desenleri gösterilmiştir ve bu nedenle ölçülebilir ve bu platformu kullanılarak ayrılmıştır. Çok düşük sayılarda hücreler de olabilir bE akış destekli manyetik kaldırma cihazında sıvı akışını yararlanarak tespit edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na₂S₂O₅
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).