Introduction
여기서는 기술 플랫폼 및 질병에 대한 지표로서 환자의 세포의 밀도 분포를 분석하는 자동화 된 이미지 분석과 함께 자기 부상을 사용하는 기술을 제시한다. 밀도 계 세포 측정 분석이 다용도 방법은 궁극적으로 질환 진단의 범위에 적용될 수있다. 그러나, 순서대로 포인트의 케어 테스트와 호환되도록 개발 도상국에서 사용하는 기술은 저렴한 비용으로 휴대 성 및 편의성에 대한 요구 사항을 충족해야합니다. 장치 및 소모품 용이하게 저비용으로 획득해야한다. 샘플 제조가 간단하며, 분석은 사용자 입력 또는 해석 최소 요건 자동화되어야하고, 그 결과를 신속하게 복귀한다. 또한,이 장치는 임상뿐만 아니라 개발 도상국에 유용 할 수 작고 휴대해야합니다. 따라서, 우리는 케어 포인트에 대응 기술이 자기 부상을 사용하는 장치 및 방법을 개발했다커플 링 자동화 이미징 및 이미지 분석에 의해이 ogy는 환자의 세포 집단의 밀도 분포에 대한 결과를 반환합니다.
포인트의 케어 기술은 현재 임상 실험실 테스트 절차를 통해 주목할만한 장점을 제공합니다. 현재이 기술은 임상 소유하기에 너무 비싸거나 의료진에 의해 수행하기에 너무 복잡하다. 이러한 절차의 대부분은 숙련 된 기술자가 수행해야합니다 노동 집약적 인 프로토콜을 필요로한다. 이러한 이유로, 혈액이나 소변 등의 환자 샘플은 일반적으로 다음 테스트의 결과를받을 의사 며칠이 걸릴 수 있습니다 임상 시험에 대한 원격 중앙 집중화 된 시험 기관에 전송 된 의사의 사무실에서 수집됩니다. 이것은 (보험 납부자에 대한 경제적 부담을 유발)이 시험은 매우 비용이 많이 들고 비효율적하게, 일부 경우에 처리하는 과정에서 지연이나 합병증을 야기하고, 또한 많은 수있게낮은 리소스 설정과 개발 도상국에 액세스 진단.
여기서 우리는 임베디드 이미징 및 처리 (그림 1)과 스마트 폰 호환 장치 (그림 2)와 장치 모두에서 자동화 이미징 및 분석과 결합 된 자기 부상 기술을 제시한다. 이 자기 부상 기반 장치는 전위를 갖는 광범위하게 적용 가능한 플랫폼 기술은 서로 다른 의료 진단 어플리케이션의 범위에 적용 할 나타낸다. 자력 및 부력 1, 2, 3 : 두 힘 사이의 평형에 기초하여 상기 자기 부상 방식의 기능을한다. 입자는 상자성 배지에 현탁시키고 두 MAGN 사이의 중심선의 방향으로 입자에 자력이 작용 대향 같은 극이 자석에 의해 발생 된 자기장에 삽입하면 ETS. 부력은 현탁 매질에 비해 파티클의 상대 밀도에 의한 주변 매질보다 조밀 한 입자의 경우보다 더 적은 매체 조밀 하향 입자의 경우 상향이다. 이들 두 힘에 기초하여, 입자는 이들 두 힘의 균형 필드 평형 부상 위치에 도달한다; 이 위치를 직접 저밀도 입자보다 낮은 필드에서 부양 밀집 입자, 입자의 밀도에 관한 것이다. 촬상 모듈은 하나 내장 스마트 폰 카메라 4, 5, 6 또는 확대 렌즈 (7, 8)를 구비 독립적 광학 부품, 입자의 위치를 시각화하는데 사용된다. 이미지 처리, 중 스마트 폰 응용 프로그램을 통해 4, 5,= "외부 참조"> 6 포함 처리부 (7), (8), 그리고, 따라서, 인구의 밀도 분포를 공간적 분포를 정량화하기 위하여 캡쳐 된 이미지를 처리한다. 이러한 밀리리터 관심 몇 입자 것과 큰 샘플을 (분석하기 위해, 흐름은 이러한 입자가 부상하는 장치에 직접 통합 그들이 촬상 영역을 (도 2)를 통과 할 때 분석 될 수있다.
그림 1 :자가 포함 된 자기 부상 플랫폼. (a) 디스플레이 스크린의 자기 포커싱 모듈, 촬상 부품 (발광 다이오드 (LED), 광학 렌즈 및 카메라 검출기), 및 프로세싱 유닛을 포함하여 소형 자기 부상 장치. (b) 상기 (CRO)에서 자기장 강도샘플이 삽입되는 자석들 사이의 영역의 SS 섹션. 전계 강도는 자석의 표면에서 최대이고, 그들 사이의 중심선에서 0에 접근한다. (c) 입자와 같은 세포로서, 자기장 환경에서 여러 부대 : 마그네틱 간의 중심선 방향으로 자기력 (F의 m) 크기를 갖는 입자의 위치에 기초하여 변경시키는; 현탁 매질의 상대 입자 밀도에 의존하는 중력 (F의 g ') 및 입자 운동 저항 드래그 힘 (F의 d). Yenilmez에서, 허가, 재현, 등. 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무화과URE 2 : 스마트 폰 호환 흐름 이용한 자기 부상 플랫폼. (a - c) 전면 (a) 위로 측면 (b) 및 (c) 자기 부상 장치 (d) 상기 장치의 구성 요소가 포함 조망 1) 자기 부상 모듈, 영구 자석, 확대경을 포함하며 는 LED 및 광 확산, 마이크로 컨트롤러, 펌프 드라이버 및 블루투스 수신기를 포함 2) 스마트 폰의 경우, 3) 전자, 4) 마이크로 펌프 홀더, 5) 조정 오리피스, 6) 폐기물 튜브 홀더, 7) 배터리 홀더, 8 ) 샘플 홀더, 9) 겸용 스탠드 커버. (e) 상기 자기장을 통해 시료의 펌핑을 보여주는 개략적 인 흐름. (F)가 필드를 통해 펌핑 서로 다른 밀도의 입자를 정렬하는 방법을 보여주는 자기 부상 모듈의 단면; 이하와 같은 입자 (1)과 같은 고밀도 입자는 높은 부상 높이를 t로 평형화 것같은 입자 (2)와 같은 한 밀도 입자는 등 아민,에서, 허가, 재현. (1) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 시스템의 밀도 분포 분석에 대한 샘플을 이용하기위한 최소 요구 사항은 세포 또는 약 5 μm의보다 크고 약 250 μm의 (영상 및 이미지 처리 용)의 크기보다 작은 입자와의 적합성의 현탁액을 얻을 수있는 능력을 포함 예컨대 여기에 사용 된 바와 같이 상자성 가도 부 트롤 용액의 용액에 혼합. 질병 진단, 대응 애플리케이션은 정상 대조군에 비해 질병을 수행 할 때 본질적으로 변화된 농도를 갖는 (I)의 관심 셀 이들 (II)의 밀도 변화는 시약 또는 일부를 첨가하여 세포를 유도 할 수있다 포함 에 짧은 대체 치료cubation 시간, 또는 (ⅲ) 다른 종류의 세포가 하나의 샘플에서 확인하고 본질적으로 (또는 치료를 통해)되는 고유 한 특성 밀도를 가지고있다.
겸상 적혈구 질환은 일시적인 혈관 확장-폐색 이벤트 및 만성 용혈성 빈혈 (9)을 초래할 수있는 사람의 적혈구 (적혈구)에서 생산되는 헤모글로빈, HBS의 돌연변이 형태를 일으키는 유전 질환이다. 이 헤모글로빈 등전점 매우 정확하지만,이 치료 시점 설정과 호환되기 때문에 임상 실험실에서 수행되어야하며, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분획 또는 헤모글로빈 전기 포커싱을 사용하여 진단된다. 겸상 적혈구 질환에 대한 용해도 및 종이 기반의 테스트를 제안하지만, 일반적으로 주관적인 사용자의 해석과 확증 시험을 필요로하고있다. 여기서는 RB보다 더 높은 밀도를 달성하는, 겸상 적혈구를 식별 밀도 기반 방식을 사용겸상 적혈구 질환이없는 사람들 고사. 메커니즘은 탈산 소화 조건 10, 11, 12, 13 세 미만 겸상 적혈구 질환에서 RBC 탈수 발생 헤모글로빈 HBS의 돌연변이 된 형태의 중합을 포함한다.
백혈구 (백혈구) 및 적혈구 (7)이 농도 - 기반 접근법은 밀도에 기초하여 다른 유형의 세포를 분리하기 위해 적용될 수있다. 백혈구는 일반적으로 체내에 감염 싸움에 대한 책임이 있습니다. WBC 계측법은 혈액에서 이들 세포 수를 정량화하는데 사용하는 유용한 진단 도구의 역할을 할 수있다. WBC는 감염, 면역 체계 이상, 또는 백혈병을 표시 할 수있다 (일반적으로 μL 당 이상 11,000 세포로 간주) 정상보다 높은 계산합니다. WBC가 정상 범위 이하로 카운트 (μL 당 3,500 주변 세포)자가 면역 질환 또는 CONDIT에 의해 발생할 수 있습니다이온하는 피해 골수. 다른 기술과는 달리, 여기에 제시된 프로세스는 백혈구를 식별하기 위해 적혈구 나 얼룩의 용해에 의존하지 않는다. WBC의 인구 밀도는 밀도 구배 원심 분리 2, 3을 사용하여 이전에 계산 된 RBC 인구보다 낮은 것으로보고 되었기 때문에,이 셀 기반 시험 분리를 수행하기 위해 두 종류의 세포 고유의 고유 밀도를 이용한다.
1 분 미만을 요구에서 15 분, 및 자동화 된 이미지 분석 - 원격지에서 바꾸는 시험에 비해이 시험은 간단한 시료 준비 (도 3), (10) 내의 장치의 셀 분리으로 빠르다. 이러한 방식으로, 장치는 더 의료 결정 통지 처리 신체적, 정신적 고통을 경감시키기 바로 투여 할 수 있도록하고, associ 합병증의 위험을 최소화하기 위해 신속하게 결과를 반환 할 수있다의료의 지연 ated. 이 기술로 인해 최소한의 사용자 입력 또는 해석 결과를 반환 간단한 샘플 준비 및 자동화 이미징 및 분석 현장 임상 설정에서 어느 수행 할 수 있습니다. 이 때문에 영구 시료 분석을위한 자석 및 스마트 폰 또는 영상과 영상 처리를위한 간단한 전기 소자 중 하나를 사용하여 간단한 방법의 사용으로, 장치뿐만 아니라 당 테스트 비용이 약간 복잡한 테스트 절차에 비해 최소화된다.
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Protocol
윤리 진술 : 인간의 혈액 샘플을 포함하는 모든 절차는 기관의 규정에 따라 수행되었다. 모든 프로토콜을 검토하고 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 정보통 동의가 모든 참가자에 의해 주어졌다.
겸상 적혈구 질환 진단 5 1. 샘플 준비, 8
- 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 가도 부 트롤의 50 mM의 솔루션을 준비합니다.
- 가돌리늄 용액에 10 mM의 나트륨 메타 비설 파이트를 녹인다.
참고 : 메타 중아 황산나트륨은 흡입 독성이 강하게 피부 조직을 자극. 물과 혼합 부식성 산이다. 그것은 높은 온도로 가열 할 때, 황 및 나트륨의 독성 산화 가스를 방출하도록 분해 될 수있다. - 손가락 끝 또는 정맥 천자 중 하나를 통해 혈액 샘플을 얻습니다.
- 깨끗한 일회용 란셋 갖는 천자 장치를 이용하여 혈액을 채취. AP = 연합 뉴스플라이 상기 관통 사이트에 가까운 압력과 서너 번 피펫을 사용하여 혈액을 수집하기 전에 형성된 혈액 방울을 닦아; 치료를하지이 조직 유체와 샘플의 오염을 초래하므로, 조직을 압박하여 "우유"손가락을합니다.
- 또한, 표준 정맥 천자 절차 (14)를 사용하여 혈액을 그립니다.
참고 : 샘플이 몇 시간 이상을 저장되는 경우, 이러한 EDTA와 같은 항응고제와 vacutainer에 피를 수집합니다.
- 가돌리늄 - 메타 중아 황산나트륨 용액 100 ㎕를 혈액의 1 μL를 추가한다.
WBC 세포 계측법 7 2. 샘플 준비
- 섹션 1에서와 같이, 손가락 끝 또는 정맥 천자 중 하나를 통해 혈액 샘플을 얻습니다.
- 선택 사항 : RBC 용해 버퍼를 Lyse 적혈구. 피펫 5 RBC 용해 버퍼 500 μL에 혈액의 μL 및 3 상온에서 부화 - 5 분.
노트:이것은 백혈구의 고립 된 인구의 부양 범위를 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 백혈구 적혈구보다 뚜렷하게 낮은 위치에 뜨게 입증으로서 그러나,이 단계를 수행 할 필요가 없다. - HBSS 25 mM의 하나님 1000 : 전혈 1을 희석
주 : 1 샘플 용해 : 250 mM의 하나님 25 mM의 하나님을 함유하는 샘플을 얻기 위해 세포 용해를 수행 한 경우, 분해 된 샘플 9 희석.
마그네틱 공중 부양 플랫폼 4, 5, 6, 7, 8을 이용하여 시료의 분석 3.
- 자기 부상 장치를 시작합니다
- 자체 포함 된 장치의 경우, 장치에 연결이 파워 업 할 수 있도록하고 평평한 표면에 놓습니다.
- 스마트 폰 호환 버전, 스마트 폰 응용 프로그램을 실행 및 이미지를 입력 왼쪽으로 스 와이프평평한 표면에 촬영 모드 및 장소.
- 정적 자기 부상의 경우 :
- 용액에 침지 단부와 모세관 작용을 통해 모세관을 채우기 위해 샘플을 허용하여 사각형 유리 마이크로 모세관 튜브에 샘플을 제조로드.
- 천천히 한쪽 끝을 재료로 모세관을 눌러 튜브 실란트와 끝을 밀봉합니다.
- 튜브의 1cm가 계속 표시되도록 자기 부상 장치의 자석 사이의 모세관을 삽입합니다 (그림 샘플 준비를위한 그림 3 참조).
참고 :이 단계는 스마트 폰 호환 및 독립적 인 장치 모두 동일하게 유지됩니다. - 장치 또는 모세관을 방해하지 않고 10 분을 기다립니다.
- 흐름을 이용한 자기 부상의 경우 :
- 샘플 튜브에 샘플을로드합니다.
- 샘플 용기와 MI 사이에서 입구 튜브를 연결crocapillary과 마이크로 캐 필러 및 폐기물 용기 사이의 출구 튜브를 연결합니다.
- LED가 강도와 흐름 매개 변수를 설정합니다.
- 다음 (자기 포함 된 장치와 스마트 폰 응용 프로그램에서 화면 하단의 카메라 버튼 버튼 3) 이미지를 캡처하는 캡처 버튼을 누르면, 세포가 시야에서 볼 수 있습니다 있는지 확인합니다.
참고 : USB는 이미지를 저장하는 데 사용되는 경우, "이미지"라는 폴더를 만들고 전에 장치를 켜기에 USB를 삽입합니다. 더 드라이브가 존재하지 않는 경우, 장치는 그 내부 메모리에 화상을 저장하고 나중에 전송된다.
주 : 여러 이미지 캡처 및 촬상 사이의 ½ cm 대해 또는 축소 모세관 이동 기형의 위험을 최소화하기 위해 분석 될 수있다.
주 : (검출 및 사용자 인터페이스에보고) 시야 내의 셀의 수가 너무 높거나 너무 낮은 경우, 장치 또는 축소 모세관 이동 또는 다른 SA 준비mple. - 샘플을 제거하고 기관 또는 지역 규정에 따라 샘플을 폐기합니다. 모세 혈관은 날카로운로 배치되어야한다.
그림 3 : 준비 및 사용자 인터페이스 샘플. (a) 샘플 준비 절차는 환자의 손가락을 절개 혈액 방울을 형성 샘플 시험 용액에 혈액 방울을 이송, 샘플을 교반과 모세관 작용을 통해 모세관에로드하고, 자기 부상에 샘플을 삽입하는 것을 포함 장치. (b)이 샘플 준비 단계는 샘플 준비를 안내 장치의 화면에 표시된다. (c) 상기 장치는 네 개의 버튼 포함 적절히 조정 손잡이를 사용하여 포커스를 조정하기 위해 샘플 이미지를 확대 할 수있는 버튼; 버튼은 하나의 m을 얻었다전 측정은 (a 5의 지연 샘플을 삽입하는 것은 사용자를위한 시간을 허용하도록 구현된다); 시간 경과 측정 (6 이미지는 5 초 간격으로 촬영) 및 버튼을 사용 후 장치의 전원을 끕니다. Yenilmez에서, 허가, 재현, 등. 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 이미지 분석 4, 5, 6, 7, 8
- 해당 시료 (세포 분포 또는 세포 유형 분리)을위한 기기에 포함 된 이미지 분석 소프트웨어를 실행.
주 : 독립형 장치에 대해 분석이 자동적으로 수행되는 그래픽 사용자 인터페이스에 표시. 스마트 폰과 호환 장치에 대해 분석을 수행하기 위해, 갤러리 (A)에 가서원하는 비디오 파일을 선택 ND하는 분석한다. - 관찰하고 분석의 출력은 화면에 표시된 기록한다.
주 : (겸상 적혈구 질환의 진단 등) 셀 분포 해석의 경우, 출력은 세포 집단의 한정의 폭이 될 것이다.
주 : (예 WBC 식별 등) 셀형 분리 출력은 식별 WBC 인구 이미지 일 것이다. 마이크로 리터 당 세포의 수를 계산하기 위해, 2,000 배로 화상 백혈구 당 평균 수를 곱한다. 5 백혈구가 관찰되었다 예를 들어,이 / μL를 10,000 백혈구를 나타냅니다. / μL 11,000 백혈구 - 정상 범위는 일반적으로 3500 것으로 간주됩니다. - 또는 약 ½ cm의 장치에서 샘플 관으로 이동하고 전술 한 바와 같이 분석 될 다른 이미지를 캡처하여 분석을 반복한다.
주 : 분석 5 반복하는 것이 좋습니다 - 오류를 방지하기 위해 샘플 당 6 번.
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Representative Results
겸상 적혈구 질환의 진단을 위해 사용되는 기술이다 셀 밀도 분포 분석에 대해, 그 목적은 세포 집단의 분포의 폭을 식별하는 것이다. 겸상 적혈구 질환이없는 환자에서 혈액 세포 예측 폭에 한정 될 것이다. 겸상 적혈구 질환 환자의 세포는 세포 분포가 하향 경사와, 넓은 영역에 걸쳐 분산 될 임의의 특정 애플리케이션에 대해 (도 4 참조), 임계 값은 건강의 비교 대조 시료의 분포 폭 사이에 설정 될 수있다 5, 8 "질병에 대한 긍정적" "건강"사이의 차단으로 샘플.
그림 4 : Densit를 분석하는 자기 부상의 예혈액 샘플에서 겸상 적혈구 질환 지표로 y를 배포. 왼쪽에서 적혈구 잘 좁은 영역 내에서 제한된다. 오른쪽에서 적혈구의 일부가 하향 분포를 기울 감금의 폭을 증가 큰 밀도 때문에 더 낮은 부상 높이를 얻기. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시료의 밀도 분포를 분석하기 위해, 연산 알고리즘은 장치 내에 구현된다. 먼저, 수평 및 수직 축을 따라 픽셀 강도 그래디언트가 계산된다. 자석 에지 모세관 에지 세로 화소 구배 프로파일의 피크로서 검출된다. 모세관 내부 에지 사이의 거리 (픽셀), 0.7 mm로 알려져 있으며, 따라서 scali로서 사용요인 ng를하는 것은 밀리미터 픽셀에서 거리를 변환합니다. 가로축 화소 강도 구배 셀의 위치 가장 크다. 이 그라데이션 프로필을 분석하고 가우스 곡선에 맞게됩니다. 이 곡선의 값은 4 배 표준 편차는 제한 너비로보고됩니다.
그림 5의 결과는 제어 및 겸상 적혈구 질환 샘플 모두에 대한 제한 폭을 보여줍니다. 여기서, (50 μm의 이상) 더 제한 폭 샘플은 겸상 적혈구 질환이 긍정적으로 간주되며, 그 임계 값 아래 사람들은 질병에 대한 부정적인 것으로 간주 될 것이다. 또한 겸상 세포 분포 분석의 다른 방법 등, 조사 Yenilmez 의해보고 된 것을 유의하여야한다. 8
그림5 : 겸상 적혈구 질환 진단에 대한 감금 폭의 정량화. 제어 (N = 4 과목 이상 48 이미지)와 겸상 적혈구 질환 (N = 93 이미지 10 과목) 적혈구의 제한 폭에 대한 실험 결과. 결과는 맨 - 휘트니 - 윌 콕슨이 양면 시험 (일반 근사, 1 = 3, n은 2 = 10, Z = -2.6764, p = 0.0074)에 따라 통계적으로 유의하다. 수염은 샘플에서 최소 및 최대 제한 폭이 테스트를 나타내고 별표 이상 값을 나타냅니다. Yenilmez에서, 허가, 재현, 등. 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혈액 샘플에서 백혈구를 식별하는 데 사용될 수있다 입자 분리를 위해, 목표는 별개의 두과 짧은 식별하는관리 포인트. 인구 밀도가 다른있는 경우, 시야에서 특정 영역에서 관찰된다. 따라서, 별개의 밀도를 갖는 두 개 이상의 입자의 균질 한 집단이 분리시에, 상기 복수의 집단은 화상에서 관찰하고, 영상 분석 알고리즘 (4)를 이용하여 검출 될 수 있고, 부양 될 수있다 (도 6 참조).
두 가지 종류의 세포 분리를 분석하기 위해, 알고리즘은 평형 상태에있는 두 개의 분리 된 집단과 구별되는 구현된다. 겸형 적혈구 빈혈증 분석에 대해 기재 한 것과 유사한 방식으로, 두 개의 가우시안 분포 샘플보다는 하나의 곡선에 적합하다. 화소 세기 기울기의 각 피크는 다른 세포 집단을 나타낸다. 이 데이터에 맞는 가우시안 곡선 모두에게 가우시안 곡선의 수단으로 (아래쪽 자석의 위치를 기준)의 평균 부상 높이를주고감금 곡선 (7)의 표준 편차 폭.
그림 6 : 고유 밀도와 미세 입자의 혼합 인구의 자기 부상의 예. (a) 12.5 내지 200 mm의 범위의 다섯 가지 하나님 농도 부상 높이 미세 밀도 상관 보정 곡선. 기울기는 따라서 더 큰 해상도 (작은 밀도 차이 즉, 감도)를 제공하고, 하나님의 가장 낮은 농도에서 가장 큰 것입니다. 기울기는 검출의 증가 범위를 보여주는 하나님의 높은 농도에 대한하지만 낮은 해상도로 가장 낮다. (b) 두 분에 걸쳐 두 개의 별개의 밀도를 갖는 균일 한 시료의 미소 시간에 따른 분리. 평형 (오른쪽)에서, 두 개의 별개의 밴드 화상 항문 의해 검출이 Analysis 알고리즘. Yenilmez에서, 허가, 재현, 등. 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
특정 애플리케이션에 대한 별개의 밀도를 갖는 각각의 세포 유형을 확인하기 위하여, 먼저 예상 부상 높이를 수치화 한 번에 하나의 세포 유형을 뜨게하는 것이 바람직하다. 도 7a는 적혈구가 용해되어있는 혈액 샘플에서 백혈구의 부상 높이를 나타낸다. 이는 추가 분석을 위해 백혈구의 구속의 영역을 정의합니다. 결과 적혈구 따라서 백혈구이 부상 위치에 기초하여 혈액 시료를 구별 할 수 백혈구와,보다 낮은 뜨게 것을 나타낸다. 보기의 특정 분야 내에서 볼륨이 0.5 μL이다. 희석 한 샘플 : 1000, 백혈구의 수 / μL를 계수함으로써 계산 될 수있다2000 (7)의 배 전망과 곱셈의 분야에서 백혈구의 수.
그림 7 : 전혈에서 WBC 세포 계측법. (a)는 RBC 용해 다음 혈액에서 백혈구의 공중 부양. 이것은 백혈구 25 mM의 하나님 자계에 뜨게하는 범위를 정의한다. (b)는 WBC 계산의 예 (백혈구는 파란색 화살표로 표시). 상단 프레임 인레이는 백혈구를 표시하고 하단 프레임과 하단 프레임 인레이는 RBC 인구를 보여줍니다. Yenilmez에서, 허가, 재현, 등. 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
이 과정에서 중요한 요소는 자석의 적절한 정렬을 포함한다. 자석 빠질되어 있거나 장치 내에 정상보다 더 분리 된 경우,이 결과에 영향을 미칠 수있다. 이 과정에서 오류 또는 다른 사람을 제어하기 위해, 밀도가 제어 된 입자, 폴리스티렌 미립자와 같이 시간에 따른 변화를 제어하기 위해 주기적 사용될 수있다. 또한, 부상 시간은 세포가 평형에 도달 할 수 있도록하는 것이 중요하다. 적혈구를 들어, 10 분의 모든 세포가 평형에 도달하는 것을 허용하기에 충분하다. 그러나, 작은 입자 또는 세포가 평형에 도달하기 위해 더 긴 시간을 요구할 수 있다는 점이다. 이 작업은 5 초 간격으로 시간 경과 화상 촬영 시간 동안 감금 폭 플롯에 의해 평가 될 수있다; 평형 한정 폭의 변화는 무시할 수있는 시점으로 결정할 수있다.
프로토콜 내의 다른 중요한 단계는 사전을 포함이것과 정확한 농도 가돌리늄 용액 paration 크게 샘플 부상 높이에 영향을 미친다. 이 미리 수행하여 스톡 용액으로부터 사용하지만, 용액 농도의 증가 의도의 증발을 방지하기 위해 적절하게 밀봉되어야한다. 또한, 치료는 사용 된 세포의 상태를 유지하기 위해주의해야한다. 손가락 끝을 통해 그려진 사람의 혈액 들면, 채혈 한 시간 이내에 사용하여 밀폐 용기에 보관하여 건조 금지한다. 정맥 천자에 의해 그려진 인간의 피를 들어, 샘플을 항응고제 (에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 여기에 사용 된 일반적인 항응고제)으로 더 이상보다 주 동안 4 ° C에서 보관해야합니다. 자기편 세포주를 들어, 죽은 세포를 트립신과 세포가 사용할 때까지 배양해야한다 이전에 문화에서 철저하게 세척해야합니다. 셀이 상태 밀도, 따라서 부상 어이 영향을주는 것으로 알려져 있기 때문에 부상시 셀의 상태가 중요티.
수정 및 문제 해결
우리는 자기장의 예측 가능한 위치에서 서로 다른 밀도의 세포를 분리 및 한정을 보여 주었다. 다른 애플리케이션이 기술을 확장하기 위해, 상자성 매체의 다른 제형은 다른 적용 예 3 검출의 원하는 범위를 획득하기 위해 사용될 수있다. 가돌리늄의 농도는 (6a가 그림 참조) 검출의 해상도뿐만 아니라 범위를 제어합니다. 가돌리늄의 큰 농도가 셀에인가 된 자력의 강도, 현탁 용액 가돌리늄의 큰 농도가 증가하기 때문에 작은 부상 높이의 차이는 셀 밀도의 차이에 대한 것이다. 이러한 셀 밀도의 작은 차이를 구별하는 능력으로서 정의 해상도를 제한하고 있지만, 그것은 분석 될 수 밀도 범위를 증가디. 마찬가지로, 가돌리늄의 농도를 낮추면 해상도를 증가하지만, 검출의 범위를 감소시킬 것이다. 또한, 매체의 밀도는 상하 검출 한계를 이동하도록 변경 될 수있다. 부상 높이를 제어하는 제 2 힘은 현탁 매질에 비해 세포의 상대 밀도에 따라 부력이다. 여기서, 수성 현탁 용액에 (저밀도 또는 조밀 한 세포가 각각 중심선 위 또는 아래 부양과 두 자석 사이의 중심선 매체 공중에 뜨게 동일하다 밀도와 그 세포를 의미 사용 전술 한 바와 같이 범위)를 자력에 의해 제어. 때문에 부력 셀 밀도보다 높은 범위에 검출 범위를 전환한다 매체의 밀도가 증가하고, 상대 밀도에 의존한다. 유사하게, 낮은 밀도의 매체를 이용하여 세포 밀도의 하부 영역을 향해 검출 범위를 전환한다. < / P>
또한 캐 필러 폭에 걸쳐 정규화 된 입자 수 (입자의 확률, 즉 모세관의 폭을 가로 지르는 거리 흐름)을 정량함으로써 플로우를 이용한 자기 포커싱 장치의 성능을 조사 하였다. 낮은 유량 입자의 더 제한을 가지고 있지만 대량 시료 드문 물체 검출하는 단점이 될 수있는 저용량 처리량 초래한다. 그러나, 이것은 자기장에 이상이 자석을 통해 다수의 패스에 의해 해결 될 수있다. 다수의 세포 유형을 분리 또한 자계의 말단에 미세 분리기를 활용하여 서로 다른 밀도의 입자를 분리하기 위해 향후 연구에서 활용 될 수있다.
다수의 세포 유형을 분리 할 때의 평균 높이와 동종 집단을 부양하기 전에 각 세포 유형의 범위를 확립하기 위해 개별적으로 각각의 집단을 뜨게하는 것이 도움이 될 수있다.
e_content ">는 기술의 한계여기에 제시된 프로세스는 고유 밀도 입자의 분리가 제한된다. 여러 세포 유형의 신뢰성있는 식별을 달성하기 위해, 그들이 중첩되지 않는 별개의 농도 범위를 갖는 것이 중요하다. 또한, 감지 될 수있는 입자의 크기는 제한된다. 이들은 마이크로 모세관 튜브 내에서 자유롭게 이동할 수 있어야 - ~ 200㎛의 입자 직경에 권장 상한치이다. 또한, 입자는 분명 묘화 될 수 있도록 충분히 커야한다 -이 5㎛의 직경에 권장 하한이다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
세포 분석이 접근법은 현장에서 사용하기 쉬운 분석을 가능하게 간단하다. 많은 의료 진단 절차는 임상 시험 기관에서 수행해야합니다 및 테스트 장비 및 훈련 실험실 specialis에 의해 수행 절차를 전문이 필요합니다티. 그러나,이 프로토콜은 건강 클리닉에 더 접근 할 수있는 간단한 장치가 필요합니다. 샘플 제조는 간단하고 분석 사용자 오류의 위험을 최소화 자동화된다.
이 장치는 질환의 다양한 신속 현장 시험을 가능하게 할 것이다. 이 장치는 현장 진료 질병 진단에 이상적, 사용하기 쉬운, 라벨없는 및 휴대용입니다. 원격 임상 실험 테스트의 현재 표준에 비해,이 방법은 신속하게 환자 치료에 관한 결정을 내릴 수 있도록 의사 잠재적 치료 지연으로 인한 부작용을 방지한다. 이 플랫폼은 임상에서이 방법의 광범위한 사용을 허용하고 개발 도상국과 건강에 전세계 접근성을 개선, 쉽게 접근하고 저렴한 구성 요소와 함께 설계되었습니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
이 점에 유의하는 것이 중요하다여기에 설명 된 테스트는 아직 대규모 환자 집단에 검증되지 않습니다. 지금까지 겸상 적혈구 질환의 진단은 작은 환자 코호트 (2), (5)에서 확인되었으며, WBC는 세포 계측법 개념의 증거로 입증되었다. 이러한 응용 프로그램과 미래에 개발 된 임상 시험은 이전 임상에이 방법을 검증하기 위해 수행하지만, 여기에 제시된 결과는 현장 진료 임상 진단을위한이 기술과 기술의 궁극적 인 사용을위한 약속을 표시해야합니다.
밀도 계 세포 계측 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하는 것이 궁극적으로 추가로 질병 진단 애플리케이션으로 확장 될 수있다. 여기에 기술 된 바와 같이 병의 진단을위한 단 전지의 자기 부상이 방법은 환자의 세포를 단일 세포 현탁액으로 인한 사용 해상도 한계와 현재의 시스템을 이용하여 묘화 될 수있는 세포를 사용해야스마트 폰 카메라 또는 저가의 광학. 들은 정상인에 비해 병을 휴대 할 때 관심 (I) 세포, 변경된 밀도를 달성한다 (ⅱ) 세포 밀도 변화의 첨가에 의해 유도이어야 또한,이 기술은 다음의 조건 중 하나를 만족하는 질환에 적용 할 수있다 시약 (또는 사용 가능한 대체 처리), 또는 (ⅲ) 중 하나의 고유 밀도를 본질적으로 또는 어떤 치료를 통해이 하나의 샘플에서 다른 세포 유형을 식별 포함해야합니다 진단. 동일한 플랫폼 디바이스를 사용하는 다른 질병의 미래 애플리케이션은 세계 보건에 엄청난 영향을 미칠 수있다. 이들은 밀도에 의해 구분되는 생물학적 성분의 탐지를 포함 할 수있다. 세포사가 진행되는 특정 세포 유형, 세포 및 세포 질환은 모든 고유 밀도 서명 따라서 별개의 자기 패턴을 갖는 것으로 알려져 있고, 따라서 정량화 될 수 있으며,이 플랫폼을 사용하여 분리 하였다. 매우 낮은 수의 세포는 수 b전자는 흐름을 이용한 자기 부상 장치의 유체 흐름을 활용하여 감지했습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gadavist (Bayer) | Jefferson Medical and Imaging | 2068062 | Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca. |
| Square glass microcapillary tubes | Vitrocom | 8270 | 50 mm length is sufficient |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | S9000 | Chemical formula: Na2S2O5 |
| Leica Microsystems Critoseal tube sealant | Fisher Scientific | 02-676-20 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Or other reagent as recommended for the cell type used |
| MICROLET 2 Adjustable Lancing Device | Walgreens | 246567 | Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols |
| Microlet Lancets | Walgreens | 667474 | Must be dispoable and not reused |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Or any preferred method for cell counting |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A1049201 |
References
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