Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging and Analysis for sykdomsdiagnostikk

Introduction

Her presenterer vi en teknologiplattform og en teknikk som bruker magnetisk levitasjon kombinert med automatisert bildebehandling og analyse for å analysere tettheten utdeling av pasientens celler som en indikator for sykdom. Denne allsidige metode for tetthetsbaserte cytometrisk analyse kan til slutt bli anvendt på en rekke sykdomsdiagnostikk. Men for å være kompatibel med point-of-care testing og bruk i utviklingsland, må teknikken tilfredsstille krav til lav pris, bærbarhet og brukervennlighet. Anordningen og elektroder må være lett oppnådd ved en lav kostnad. Prøven forberedelse må være enkel, bør analysen automatiseres med minimale krav til brukerundersøkelser eller tolkning, og resultatene skal returneres raskt. Videre må enheten være kompakt og bærbar å være nyttig i kliniske settinger samt utviklingsland. Derfor har vi utviklet et apparat og metode å bruke magnetisk levitasjon i point-of-care-kompatibel teknologi ved kobling automatisert bildebehandling og bildeanalyse for å returnere resultater vedrørende tetthet distribusjon av en befolkning på pasientens celler.

Point-of-care-teknologi tilbyr en bemerkelsesverdig fordel over aktuelle kliniske laboratorium testprosedyrer. Dagens teknologi er for dyrt til å være eid av en kliniker eller for kompliserte til å utføres av medisinsk personale. Mange av disse prosedyrene krever arbeidsintensive protokoller som må utføres av en tekniker. Av disse grunner, er pasientprøver slik som blod eller urin vanligvis oppsamlet i legekontoret deretter overført til en fjerntliggende, sentralisert testlaboratorium for klinisk testing, som kan ta flere dager for legen å motta resultatene av testen. Dette kan føre til forsinkelser eller komplikasjoner i løpet av behandlingen i noen tilfeller gjør denne testingen svært kostbare og ineffektive (forårsaker en økonomisk byrde på forsikrings betalere), og videre gjør mangediagnostikk utilgjengelige i lav ressursinnstillingene og utviklingsland.

Her presenterer vi en magnetisk levitasjon teknikk kombinert med automatisert bildebehandling og analyse både i en enhet med innebygd bildebehandling og behandling (figur 1) og en smarttelefon-kompatibel enhet (figur 2). Disse magnetiske levitasjon-baserte enheter representerer et bredt anvendelig plattform-teknologi som har potensiale til å bli brukt på en rekke forskjellige medisinske diagnostiske anvendelser. De magnetiske levitasjon tilnærming funksjoner basert på en likevekt mellom to krefter: en magnetisk kraft og en oppdriftskraft ^{en, to, tre.} Når en partikkel er opphengt i en paramagnetisk medium og satt inn i et magnetisk felt som genereres av to magneter med like poler vendende mot hverandre, en magnetisk kraft virker på partikkelen i retning mot midtlinjen mellom de to magnet ets. Oppdriftskraften er forårsaket av den relative tetthet av partikkelen i forhold til det suspenderende medium og er oppover i tilfelle av partikler mindre tette enn mediet og nedover når det gjelder partikler som er tyngre enn det omgivende medium. Basert på disse to kreftene, vil partiklene nå en likevekt levitasjon posisjon i feltet som balanserer disse to styrker; denne stilling er direkte relatert til tettheten av partikkelen, med tettere partikler Levitating lavere i felten enn mindre tette partikler. En bildemodul, enten en innebygd kamera smarttelefon ^{4, 5, 6} eller uavhengige optiske komponenter som er utstyrt med en forstørrelseslinse ^{7, 8,} blir brukt til å visualisere posisjonen til partiklene. Bildebehandling, enten gjennom en smarttelefon program ^{4, 5,}= "xref"> 6 eller en innkapslet behandlingsenhet ^{7, 8,} behandler deretter de fangede bilder for å kvantifisere den romlige distribusjon, og derfor tetthetsfordelingen av befolkningen. For å analysere større prøver (slik som de med bare noen få partikler av interesse per milliliter, kan strømning være integrert direkte i anordningen slik at partiklene er levitert og analysert som de passerer gjennom bilde region (fig 2).

Figur 1: Selvforsynt Magnetic Levitation Platform. (A) Compact magnetisk levitasjon enheter, inkludert en magnetisk fokus modul, bilde komponenter (en light-emitting diode (LED), en optisk linse, og et kamera detektor), og en behandlingsenhet med en skjerm. (B) Magnetisk feltstyrke i cross-delen av området mellom magnetene hvor prøven settes inn. Feltstyrken er størst ved overflaten av magnetene og nærmer seg null ved midtlinjen mellom dem. (C) Partikler, slik som celler, i løpet av de magnetiske felterfaring flere krefter: en magnetisk kraft (F _m) mot senterlinjen mellom magnetismen, med størrelse varierende på grunnlag av posisjonen av partikkelen; en gravitasjonskraft (F _g ') som er avhengig av partikkeltettheten i forhold til den av suspensjonsmediet, og en dragkraft (F _d) motstand mot den partikkelbevegelse. Gjengitt med tillatelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

figure 2: Smartphone-kompatibel Flow-assistert Magnetic Levitation Platform. (A - c) Front (a), side (b), og tilbake (c) visninger av magnetisk levitasjon enhet (d) Komponentene i enheten inkluderer: 1) Magnetic levitasjon modul, inkludert permanente magneter, et forstørrelsesglass, og en LED og lys diffuser, 2) smartphone case, 3) elektronikk, inkludert en mikrokontroller, pumpe driver, og Bluetooth-mottaker, 4) micro-pumpeholder, 5) justerbar åpning, 6) avfall rørholder, 7) batteriholder, 8 ) prøve holder, 9) dual-purpose stativ og lokk. (E) Strømnings skjematisk, som viser pumping av prøven gjennom det magnetiske felt. (F) Tverrsnitt av den magnetiske levitasjon modulen, og viser hvordan partikler av ulik tetthet justeres etter hvert som de blir pumpet gjennom feltet; mindre tette partikler, for eksempel Particle 1, vil stabilisere seg på et høyere levitasjon høyde tHan tettere partikler, for eksempel Particle 2. Gjengitt med tillatelse fra Amin, et al. ¹ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Minimumskravene for bruk av prøven for tetthetsfordeling analyse i dette systemet er muligheten til å oppnå en suspensjon av celler eller partikler større enn ca fem mikrometer og mindre enn ca 250 mikrometer i størrelse (for bildebehandling og bildebehandling) og dens kompatibilitet med blanding i en oppløsning av et paramagnetisk løsning slik som den gadobutrol anvendt her. For sykdomsdiagnostikk, kompatible programmer innbefatter de hvori (i) celler av interesse i seg selv ha en endret densitet når de bærer en sykdom sammenlignet med friske kontroller, (ii) en tetthetsendring kan induseres i cellen ved tilsetning av et reagens eller noen alternativ behandling av et kort icubation tid, eller (iii) forskjellige celletyper er identifisert i en enkelt prøve og i seg selv (eller via noen behandling) har unike karakteristiske tettheter.

Sigdcelleanemi er en genetisk forstyrrelse som forårsaker en mutert form av hemoglobin, HbS, som skal fremstilles i en persons røde blodceller (RBC), noe som kan resultere i intermitterende vaso-okklusive hendelser og kronisk hemolytisk anemi ^9. Det er diagnostisert ved hjelp av enten hemoglobin isoelektrisk fokusering, væskekromatografi (HPLC) fraksjonering, eller hemoglobin elektroforese som er svært nøyaktige, men må utføres i et laboratorium klinisk testing fordi de ikke er kompatible med point-of-care innstillinger. Løselighet og papirbaserte tester for sigdcelleanemi har vært foreslått, men generelt krever subjektive bruker tolkning og bekreftende testing. Her bruker vi en tetthet basert tilnærming for å identifisere sigd RBC, som oppnår en høyere tetthet enn RBCs fra folk uten sigdcelleanemi. Mekanismen involverer polymerisasjon av den muterte formen av hemoglobin, HbS, noe som fører til RBC dehydrering i sigdcelleanemi RBC-er i henhold til deoxygenated betingelser ^{10, 11, 12, 13.}

Denne tetthet-baserte fremgangsmåten kan også anvendes for å separere celler av forskjellige typer på grunnlag av densitet: hvite blodceller (WBC) og ^RBC-7. WBCs er generelt ansvarlig for å bekjempe infeksjoner i kroppen. WBC-cytometri kan brukes til å kvantifisere antallet av disse celler i blodet og tjener som et nyttig diagnoseverktøy. WBC teller høyere enn normalt (generelt ansett mer enn 11.000 celler per mL) kan tyde på infeksjon, immunsystem lidelser, eller leukemi. WBC teller under normalområdet (rundt 3500 celler per mL) kan være forårsaket av autoimmune lidelser eller Conditioner som skader benmargen. Til forskjell fra alternative teknologier, blir prosessen presentert her ikke stole på lyse av de røde blodceller eller flekker for å identifisere WBC. Dette celle-basert test dro fordel av de unike iboende tettheter av de to celletyper for å utføre separasjon, som den WBC populasjonstettheten er blitt rapportert å være lavere enn den for RBC befolkningen som tidligere er beregnet ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering ^{2, 3.}

Sammenlignet med alternative testing på avsidesliggende steder, er denne testen hurtig, med enkel prøvepreparering (figur 3), separering av celler i innretningen i løpet av 10 - 15 min, og automatisert bildeanalyse, og som krever mindre enn 1 min. På denne måte kan anordningen returnerer resultater raskt for å bedre informere medisinske avgjørelser, tillate behandling som skal administreres umiddelbart for å lindre fysisk og psykisk smerte, og redusere risikoen for komplikasjoner associrerte med en forsinkelse i medisinsk behandling. Denne teknikken kan utføres på stedet enten i kliniske settinger på grunn av enkel prøveopparbeidelse og automatisert bildebehandling og analyse som returnerer et resultat med minimal brukerundersøkelser eller tolkning. På grunn av bruken av en enkel tilnærming ved hjelp av permanente magneter for prøveanalyser og bruk av enten en smarttelefon eller enkle elektriske komponenter for bildebehandling og bildebehandling, enheten samt pr-test kostnadene er minimal i forhold til noen sofistikerte testprosedyrer.

Protocol

Etisk Uttalelse: Alle prosedyrer som involverer humane blodprøver ble utført i henhold til de institusjonelle bestemmelser. Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board. En informert samtykke ble gitt av alle deltakerne.

1. Prøvepreparering for sigdcelleanemi Diagnose ^{5, 8}

1. Forbered en 50 mM løsning av gadobutrol i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Løs opp 10 mM natriummetabisulfitt i gadolinium løsning.
   MERK: natriummetabisulfitt giftig ved innånding og sterkt irriterer hud og vev. Det er en etsende syre når de blandes med vann. Den kan brytes ned for å avgi giftige oksid røyk av svovel og natrium ved oppvarming til høy temperatur.
3. Skaff blodprøve enten via finger eller venepunksjon.
   1. Trekke blod ved hjelp av en blodprøvetaker med en ren, engangs lansett. Apply trykk nær boret området og tørke blod dråpe dannet tre-fire ganger før samle blod ved hjelp av en pipette; tar seg ikke til "melk" finger ved å klemme på vev, da dette vil føre til forurensning av prøven med vevsvæske.
   2. Alternativt trekke blod ved hjelp av standard venepunksjon ^14.
      MERK: Hvis prøvene lagres i mer enn noen få timer, samle opp blod inn i et vacutainer med et antikoaguleringsmiddel, slik som EDTA.
4. Legg mindre enn 1 mL av blod til 100 ul av gadolinium-natriummetabisulfittløsning.

2. Prøvepreparering for WBC Cytometry ⁷

1. Skaff blodprøve enten via finger eller venepunksjon, som i punkt 1.
2. Valgfritt: Lyse RBC med en RBC lysis buffer. Pipetter 5 mL av blod inn i 500 mL av RBC lyseringsbuffer og inkuber ved værelsestemperatur i 3 - 5 min.
   MERK:dette kan gjøres for å bekrefte levitation utvalg av en isolert bestand av WBCs. Det er imidlertid ikke nødvendig for å utføre dette trinnet, som resultatene presentert her viser at RBCs sveve på en klart lavere stilling enn WBC.
3. Fortynn fullblod 1: 1000 i 25 mM Gd i HBSS
   MERK: Hvis cellelyse ble utført, fortynne den lyserte prøve 9: 1 lyserte prøve: 250 mM Gd for å oppnå en prøve som inneholdt 25 mM Gd.

3. Analyse av prøver ved hjelp av den magnetiske Levitation plattformen ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Start magnetisk levitasjon enhet:
   1. For selvstendig enhet, plugge i enheten, la den starte opp, og legg på et flatt og jevnt underlag.
   2. For smartphone-kompatibel versjon, starte smarttelefon program og sveipe til venstre for å gå inn bildefangstmodus, og legg dem på et flatt og jevnt underlag.
2. For statisk magnetisk levitasjon:
   1. Laste fremstilt prøven inn i et firkantet glass microcapillary rør ved å dyppe enden inn i løsningen og tillater prøven å fylle kapillær via kapillarvirkningen.
   2. Enden med et rør tetningsmiddel ved langsomt å skyve en ende kapillæret inn i materialet.
   3. Sett kapillær mellom magneter av magnetisk levitasjon enheten slik at bare en cm av røret er synlig (se figur 3 for en illustrasjon av prøveopparbeidelse).
      MERK: Dette trinnet er den samme for både smartphone-kompatibel og selvstendig enhet.
   4. Vent 10 min uten å forstyrre enheten eller kapillær.
3. For flow-assistert magnetisk levitasjon:
   1. Laste prøven inn i prøverøret.
   2. Koble innløpsslangen mellom prøvebeholderen og microcapillary og koble uttaket slangen mellom microcapillary og avfallsbeholder.
   3. Sett LED intensitet og strømningsparametre.
4. Sørg for at cellene er synlige i synsfeltet, og trykk deretter på utløserknappen for å ta et bilde (knapp 3 på selvstendig enhet og kameraknappen nederst på skjermen i smarttelefonen programmet).
   MERK: Hvis en USB brukes til å lagre bilder, lage en mappe som heter "bilder" og sett inn USB før du slår på enheten. Hvis ingen stasjon er til stede, vil enheten lagre bildene i det interne minnet og overføres senere.
   MERK: Flere bilder kan bli tatt og analysert for å redusere risikoen for uregelmessigheter ved å bevege kapillaren i eller ut omtrent ½ cm mellom bilde fange.
   MERK: Hvis antallet celler i synsfeltet er for høy eller for lav (som oppdaget og rapportert i brukergrensesnittet), skifte kapillær inn eller ut av enheten eller forberede en annen sample.
5. Ta prøven og kast prøven i henhold til de institusjonelle eller lokale bestemmelser. Kapillærer skal kastes som en skarp.

Figur 3: Prøvepreparering og brukergrensesnitt. (A) Prøvefremstillingsprosedyren involverer lancing fagets finger, som danner en dråpe blod, overføring av bloddråpen til prøvetesting løsning, omrøring av prøven og lastes inn i et kapillarrør gjennom kapillarvirkning, og innføring av prøven i den magnetiske levitasjon enhet. (B) Disse prøveopparbeidelse trinn vises også på skjermen på enheten for å lede prøveopparbeidelse. (C) Enheten inneholder fire knapper: en knapp for å zoome inn på eksempelbilde for å riktig justere fokus med justeringsknappen; en knapp for å få en enkel measurement (5 s forsinkelse er implementert for å gi tid for brukeren å sette prøven); en time-lapse måling (6 bilder er tatt på 5 s intervaller); og en knapp for å slå av enheten etter bruk. Gjengitt med tillatelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. Bildeanalyse ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Kjør bildeanalyse programvaren på enheten for den aktuelle prøven (celle distribusjon eller celletype separasjon).
   MERK: For selvstendig enhet, er analysen utføres automatisk og vises på det grafiske brukergrensesnittet. For smartphone-kompatibel enhet, for å utføre analysen, gå til galleriet ennd velge ønsket videofil som skal analyseres.
2. Observere og registrere resultatet av analysen som vises på skjermen.
   NB: For cellefordelingsanalyse (som for eksempel sigdcelleanemi diagnose), vil resultatet være bredden av innesperring av cellepopulasjonen.
   MERK: For celletype separasjon (slik som WBC identifikasjon), vil resultatet være et bilde med WBC befolkningen identifisert. For å beregne antall celler per mikroliter, multiplisere gjennomsnittlig antall WBCs per bilde med en faktor på 2000. For eksempel, hvis 5 WBCs ble observert, ville dette indikere 10.000 WBCs / mL. Normalområdet er generelt ansett for å være 3.500 - 11.000 WBCs / mL.
3. Gjenta analyse ved å føre prøverøret inn eller ut av enheten om ½ cm og fange et annet bilde som skal bli analysert slik som beskrevet ovenfor.
   MERK: Det anbefales å gjenta analysen 5 - 6 ganger per prøve å unngå feil.

Representative Results

For celletetthet fordelingsanalyse, som er den teknikk som brukes for sigdcelleanemi diagnose, er målet å identifisere bredden av fordelingen av cellepopulasjonen. Blodceller fra pasienter uten sigdcelleanemi vil bli begrenset innenfor en forutsigbar bredde. Celler fra pasienter med sigdcelleanemi vil bli distribuert gjennom et bredere regionen, med en nedadgående skjevheter i cellefordeling (se Figur 4.) For et bestemt program, kan en terskel settes mellom fordelingen bredden av kontrollprøver versus det av sunn prøvene som en cutoff mellom "sunn" og "positivt for sykdommen" ^{5, 8.}

Figur 4: Eksempel på Magnetic levitasjon å analysere Density Distribution som en indikator for sigdcelleanemi i blodprøver. På venstre, blir røde blodceller vel avgrenset innenfor et smalt område. På høyre side, en undergruppe av røde blodlegemer oppnå en større tetthet og derfor en lavere høyde levitasjon, forvrenger fordelingen nedover og øke bredden av innesperring. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Å analysere tettheten fordeling av en prøve, er en beregningsalgoritme implementert i enheten. Først blir pikselintensitetsforskjeller langs de vertikale og horisontale akser beregnet. Magnet kantene og de kapillære kanter blir detektert som toppene i de vertikale piksel gradient profiler. Avstanden mellom de indre kapillære kantene, i bildepunkter, er kjent for å være 0,7 mm, og blir derfor brukt som en Scaling faktor å konvertere avstander fra piksler til millimeter. Pikselintensiteten gradient langs den horisontale akse er størst hvor cellene befinner seg. Dette gradient profilen er analysert og tilpasning til en Gauss-kurve. Verdien 4 ganger standardavviket for denne kurven er rapportert som innesperring bredde.

Resultatene i figur 5 viser begrensnings bredder for både kontroll og sigdcelleanemi prøver. Her vil prøver med en større bredde begrensnings (over 50 um) betraktes som sigdcelleanemi positive og de som ligger under denne terskelen ville bli betraktet å være negativ for sykdommen. Det bør bemerkes at andre metoder for analyse av sigdcellefordeling har vært undersøkt og rapportert av Yenilmez, et al. ⁸

Figur5: Kvantifisering av Confinement Bredde for sigdcelleanemi Diagnose. Eksperimentelle resultater for innesperring bredden av kontroll (n = 48 bilder over 4 fag) og sigdcelleanemi (n = 93 bilder over 10 fag) røde blodceller. Resultatene er statistisk signifikant i henhold til en Mann-Whitney-Wilcoxon to-sidig test (normal tilnærming, n ₁ = 3, n ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). Linjene representerer de laveste og høyeste begrensningsbredder fra prøvene testet og stjerne representerer utliggere. Gjengitt med tillatelse fra Yenilmez, et al. ⁸ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For partikkelseparasjon, som kan brukes til å identifisere WBC i blodprøver, er målet å identifisere to distinkte populsjoner. Dersom populasjoner har forskjellige tettheter, vil de bli observert i forskjellige regioner i synsfeltet. Således kan homogene populasjoner av to eller flere partikler med forskjellige tettheter være levitert, og ved separasjon, kan de flere populasjoner observeres på bildet og detektert ved hjelp av bildeanalyse algoritmen ⁴ (se figur 6).

For å analysere separasjon av to ulike celletyper, blir en algoritme implementeres som skiller de to atskilte populasjoner ved likevekt. På en lignende måte som den som er beskrevet for sigdcelleanemi analyse, to Gaussiske distribusjoner er skikket til prøven, snarere enn en enkelt kurve. Hver topp i pikselintensiteten gradientene representerer en forskjellig cellepopulasjon. Den Gaussiske kurver passer til disse dataene gi både den gjennomsnittlige levitasjon høyde (i forhold til posisjonen for den nedre magnet) som gjennomsnittet av de gaussisk kurve ognedkomst bredde som standardavviket av kurven ^7.

Figur 6: Eksempel på Magnetic Levitation av en blandet befolkning av mikropartikler med forskjellige tettheter. (A) Kalibreringskurver som korrelerer mikrosfære tetthet med levitasjon høyde i fem forskjellige Gd konsentrasjoner varierende fra 12,5 til 200 mM. Skråningen er størst på de laveste konsentrasjonene av Gd, og dermed tilby en større oppløsning (dvs. følsomhet overfor forskjellene små tetthet). Skråningen er lavest for høyere konsentrasjoner av Gd, som viser den økte rekke deteksjon, men med lavere oppløsning. (B) Tidsavhengig separasjon av en homogen prøve-mikrokuler med to forskjellige densiteter i løpet av to minutter. Ved likevekt (til høyre), er to adskilte bånd detektert av bildet analysis algoritme. Gjengitt med tillatelse fra Yenilmez, et al. ⁷ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å identifisere de enkelte celletyper med forskjellige tettheter for et gitt program, er det lurt å først sveve en celletype om gangen for å kvantifisere den forventede levitasjon høyde. Figur 7a viser levitasjon høyden av WBC fra en blodprøve, hvor RBC er lysert. Dette definerer området for innesperring av WBC for videre analyse. Resultatene indikerer at RBC sveve lavere enn WBC og, dermed, kan WBC skilles fra blodprøver basert på den levitasjon stilling. Volumet innenfor en gitt synsfelt er 0,5 mL. I prøver som ble fortynnet 1: 1000, antall WBC / ul kan beregnes ved tellingantall WBCs i synsfeltet og multiplisere med en faktor på 2000 ^7.

Figur 7: WBC Cytometry i fullblod. (A) Levitation av WBCs fra blod følgende RBC lysis. Dette definerer området hvor WBCs sveve i magnetfeltet i 25 mM Gd. (B) Eksempel på WBC telling (WBC markert med blå piler). Den øverste rammen innlegg viser WBCs og bunnrammen og bunnrammen innlegg viser RBC befolkningen. Gjengitt med tillatelse fra Yenilmez, et al. ⁷ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen
Kritiske faktorer i denne prosess er riktig justering av magnetene. Hvis magnetene komme ut av stilling eller separert mer enn normalt i enheten, kan det påvirke resultatet. For å kontrollere for denne feil eller andre i prosessen, en tetthet styrt partikkel, for eksempel polystyren-mikrokuler, kan brukes til periodisk å kontrollere for endringer over tid. Videre er levitasjon tid viktig for å tillate cellene å nå likevekt. For røde blodceller, er tilstrekkelig til å tillate alle celler for å nå likevekt 10 min. Det er imidlertid viktig å merke seg at mindre partikler eller celler kan kreve en lengre tid for å nå likevekt. Dette kan vurderes ved å ta tid lapse bilder på en 5 s intervall og plotte sperring bredde over tid; likevekt kan bli bestemt som det punkt hvor den endring i begrensnings bredde er ubetydelig.

Andre kritiske trinnene i protokollen omfatter pregjøring av gadolinium-løsning på den nøyaktige konsentrasjon som dette påvirker i stor grad prøven levitasjon høyde. Dette kan gjøres på forhånd og brukes fra en stamløsning, men må forsegles riktig for å unngå fordampning av løsningen, og en utilsiktet økning i konsentrasjon. Videre må man sørge for å opprettholde helsen status for de anvendte celler. For humant blod trekkes via fingerstikk, bør den brukes i løpet av en time av blodprøvetaking og ikke tillates å tørke ved lagring i en lukket beholder. For humant blod tatt ved venepunksjon, må prøvene lagret ved 4 ° C i ikke mer enn en uke med antikoagulant (etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), et felles antikoagulant, ble anvendt her). For adherente cellelinjer, bør døde celler vaskes grundig fra kulturen før trypsinering og cellene skal inkuberes inntil bruk. Helsen til cellene på tidspunktet for levitasjon er kritisk fordi celle helse er kjent for å påvirke tetthet og derfor levitasjon haut.

Modifikasjoner og feilsøking
Vi har vist separasjon og innesperring av celler av to forskjellige densiteter ved forutsigbare steder i det magnetiske felt. For å utvide denne teknikk til andre anvendelser kan andre formuleringer av det paramagnetiske medium anvendes for å oppnå et ønsket område av deteksjon for alternative anvendelser ^3. Konsentrasjonen av gadolinium styrer oppløsning av påvisning og området (se figur 6a). Fordi høyere konsentrasjoner av gadolinium øke styrken av den magnetiske kraft som utøves mot cellene, jo større konsentrasjonen av gadolinium i den suspenderende oppløsning, jo mindre forskjellen i levitasjon høyde vil være for en hvilken som helst forskjell i celletetthet. Selv om dette begrenser oppløsning, definert som evnen til å skille mellom små forskjeller i celletettheten, øker omfanget av densiteter som kan analysered. Likeledes vil nedsette konsentrasjonen av gadolinium øke oppløsningen, men redusere rekkevidden for deteksjon. Videre kan tettheten av mediet endres for å forskyve grensene for påvisning oppover eller nedover. Den andre kraft som kontrollerer levitasjon høyde er oppdriftskraften, som avhenger av den relative tetthet av cellen sammenlignet med det suspenderende medium. Her er et vannbasert suspenderende oppløsning som brukes, det vil si at celler med en tetthet som er den samme som for mediet sveve ved senterlinjen mellom de to magneter med mindre tette eller tettere celler levitating over eller under senterlinjen, henholdsvis (med et område styrt av magnetkraft som tidligere beskrevet). Fordi oppdriftskraft er avhengig av relativ densitet, øke tettheten av mediet vil skifte området fra deteksjons til et høyere område av celletettheter. Tilsvarende vil anvendelse av en lavere tetthet medium forskyve området fra deteksjons mot en nedre del av celletettheter. < / P>

Vi har også undersøkt utførelsen av flow-assistert magnetiske fokuseringsanordningen ved å kvantifisere den normaliserte partikkeltelling på tvers av kapillær bredde (dvs. sannsynligheten for at en partikkel til å flyte i en avstand på tvers av kapillær bredde). Lavere strømningshastigheter har mer innesperring av partikler, men resulterer i et lavere volum gjennomstrømning, som kan være en ulempe for sjelden objektdeteksjon i høy-volum prøver. Imidlertid kan denne tas opp av flere passeringer i det magnetiske felt eller via lengre magneter. Separasjon mellom flere celletyper kan også utnyttes i fremtidige studier for å isolere partiklene av forskjellige tettheter ved å utnytte en mikrofluid separator ved enden av det magnetiske felt.

Når separering av flere celletyper, kan det være nyttig å sveve hver populasjon individuelt for å etablere den gjennomsnittlige høyden og utvalget av hver celletype forut for levitating den homogene populasjon.

e_content "> Begrensninger av teknikken
Fremgangsmåten presentert her er begrenset til separering av partikler med forskjellige tettheter. For å oppnå pålitelig identifikasjon av flere celletyper, er det viktig at de har diskrete tetthet områder som ikke overlapper. Videre er partiklene som kan oppdages av begrenset størrelse. De må være i stand til å bevege seg fritt innenfor den microcapillary tube - 200 um er den anbefalte øvre grense for partikkeldiameteren. Videre må partiklene være store nok til å bli avbildet klart - 5 um er den anbefalte nedre grense for diameteren.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Denne tilnærmingen til mobilnettet analyse er enkel, slik brukervennlig analyse på stedet. Mange medisinske diagnostiske prosedyrer må utføres i kliniske testlaboratorier og krever spesialisert testing av utstyr og prosedyrer som utføres av en utdannet laboratorium specialist. Dette krever imidlertid protokollen en enkel enhet som er mer tilgjengelig for helsetjenester klinikker. Prøven forberedelse er enkel og analysen er automatisert, noe som minsker risikoen for brukerfeil.

Denne enheten vil muliggjøre rask, on-site testing for en rekke medisinske tilstander. Enheten er brukervennlig, etikett-fri, og bærbar, noe som gjør den ideell for point-of-care sykdomsdiagnostikk. I forhold til dagens standard på fjern klinisk laboratorietesting, vil denne tilnærmingen gjør at leger til raskt å ta informerte beslutninger om pasientbehandling og potensielt hindre komplikasjoner på grunn av forsinkelser i omsorg. Plattformen har blitt designet med lett tilgjengelige og billige komponenter, slik at utbredt bruk av denne metoden i kliniske settinger og utviklingsland og forbedre hele verden tilgjengelighet til helsetjenester.

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Det er viktig å merke seg attester som er beskrevet her er ennå ikke godkjent for en storstilt pasientgruppen. Til dags dato har sigdcelleanemi diagnosen er bekreftet i en liten pasient kohort ^{2, 5} og WBC cytometri er påvist som et bevis på konseptet. Kliniske studier med disse programmene og de utviklet i fremtiden må utføres for å validere denne metoden før klinisk bruk, men resultatene som presenteres her viser lovende for eventuell bruk av denne teknologien og teknikken for point-of-care klinisk diagnostikk.

Ved hjelp av denne tilnærmingen for tetthet-baserte cytometri analyse kan til slutt bli utvidet til flere sykdomsdiagnostikk. Denne tilnærmingen av magnetisk levitasjon av enkeltceller for sykdomsdiagnostikk som er beskrevet her krever bruk av encellede suspensjoner i pasientens celler og celler som kan avbildes ved hjelp av dagens system med sine begrensninger på oppløsning på grunn av brukav en smarttelefon kamera eller rimelige optikk. Videre er denne teknikken anvendes på sykdommer som tilfredsstiller en av de følgende betingelser: (i) celler av interesse, må oppnå en endret densitet når de er bærere av sykdommen sammenlignet med friske kontroller, (ii) en celletetthet forandring må være induserbare ved tilsetting av et reagens (eller hvilken som helst tilgjengelig alternativ behandling), eller (iii) en diagnostisk må omfatte identifisering av forskjellige celletyper i en enkelt prøve som enten i seg selv eller via noen behandling har unike tettheter. Fremtidige søknader til andre sykdommer som bruker samme plattform enhet kan ha en enorm innvirkning på global helse. Disse kan omfatte påvisning av biologiske komponenter, som utmerker seg ved tetthet. Visse celletyper, celler som gjennomgår celledød, og syke celler har alle vist seg å ha unike tetthetssignaturer og dermed forskjellige magnetiske mønstre, og kan således kvantifiseres og separeres ved hjelp av denne plattformen. Celler i svært lave tall kan også be detekteres ved å utnytte fluidstrømmen i strømnings-assistert magnetisk levitasjon anordning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201