Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Introduction

Hier stellen wir eine Technologie-Plattform und eine Technik, die Magnetschwebebahnen verwendet gekoppelt mit automatisierten Bildgebung und Analyse der Dichteverteilung von den Zellen eines Patienten als Indikator für die Krankheit zu analysieren. Dieser vielseitige Ansatz für dichtebasierte zytometrische Analyse kann letztlich zu einer Reihe von Krankheitsdiagnostik angewendet werden. Um jedoch mit Point-of-care-Tests und die Verwendung in Entwicklungsländern kompatibel zu sein, muss der Technik Anforderungen erfüllen zu niedrigen Kosten, Portabilität und Benutzerfreundlichkeit. Das Gerät und Verbrauchsmaterialien müssen leicht zu geringen Kosten erhalten werden. Die Probenvorbereitung muss einfach sein, Analyse sollte mit minimalen Anforderungen für die Benutzereingabe oder Interpretation automatisiert werden, und die Ergebnisse sollten schnell zurückgegeben werden. als nützlich in klinischen als auch den Entwicklungsländern weiteren muss das Gerät kompakt und tragbar sein. So haben wir eine Vorrichtung und ein Verfahren zu verwenden Magnetschwebebahn in Point-of-Care-kompatiblen technol entwickeltnologie durch Kopplung automatisierten Bildgebung und Bildanalyseergebnisse in Bezug auf die Dichteverteilung einer Population von den Zellen eines Patienten zurückzukehren.

Point-of-Care-Technologien bieten einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber aktuellen klinischen Labortestverfahren. Die derzeit verfügbaren Technologie ist zu teuer durch einen Kliniker besessen zu werden oder zu komplex durch medizinisches Personal durchgeführt werden. Viele dieser Verfahren erfordern arbeitsintensive Protokolle, die von einem ausgebildeten Techniker durchgeführt werden müssen. Aus diesen Gründen werden Patientenproben wie Blut oder Urin im Allgemeinen in der Arztpraxis gesammelt dann transferiert zu einer entfernten, zentralen Prüflabor für klinische Tests, die mehrere Tage dauern für den Arzt können die Ergebnisse des Tests zu erhalten. Dies kann zu Verzögerungen führen oder Komplikationen im Verlauf der Behandlung in einigen Fällen macht diese Tests sehr teuer und ineffizient (eine finanzielle Belastung für die Versicherungszahler verursacht), und macht weiter vieleDiagnose unzugänglich in ressourcenarmen Einstellungen und Entwicklungsländern.

Hier stellen wir eine Magnetschwebetechnik gekoppelt mit automatisierten Bildgebung und Analyse sowohl in einer Vorrichtung mit eingebettetem Bildgebung und Verarbeitung (Abbildung 1) und einem Smartphone-kompatiblen Gerät (Abbildung 2). Diese Magnetschwebebahn-basierte Geräte repräsentieren eine breit anwendbare Plattformtechnologie, die das Potential hat, zu einer Reihe von verschiedenen medizinischen diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Magnetschwebebahn Ansatz Funktionen basierend auf einem Gleichgewicht zwischen zwei Kräfte: eine magnetische Kraft und eine Auftriebskraft ^{1, 2, 3.} Wenn ein Teilchen in einem paramagnetischen Medium suspendiert und in einem Magnetfeld von zwei Magneten, deren gleichnamige Pole einander gegenüber, um eine magnetische Kraft wirkt auf die Teilchen in Richtung auf die Mittellinie zwischen den beiden magn erzeugt eingefügt ets. Die Auftriebskraft wird durch die relative Dichte des zu dem Suspensionsmedium verglichen Teilchen verursacht und ist nach oben in dem Fall von Teilchen weniger dicht als die mittlere und nach unten in dem Fall von Teilchen eine höhere Dichte als das umgebende Medium. Auf der Grundlage dieser beiden Kräfte, Partikel eine Gleichgewichtsschwebeposition in dem Feld zu erreichen, die diese beiden Kräfte ausgleicht; Diese Position ist direkt mit der Dichte des Teilchens, mit dichteren Teilchen niedriger im Bereich levitating als weniger dichte Teilchen. Ein Abbildungsmodul, entweder ein eingebautes in Smartphone - Kamera ^{4, 5, 6} oder unabhängige optische Komponenten mit einer Vergrößerungslinse ausgestattet ^{7, 8} werden verwendet , um die Positionen der Partikel sichtbar zu machen. Bildverarbeitung, entweder über eine Smartphone - Anwendung ^{4, 5,}= "Xref"> 6 oder ein eingebettetes Verarbeitungseinheit ^{7, 8,} verarbeitet dann die aufgenommenen Bilder der räumlichen Verteilung , und daher zu quantifizieren, die Dichteverteilung der Bevölkerung. Um nur einige interessierende Teilchen pro Milliliter größere Proben (wie diejenigen , zu analysieren, kann Strom direkt in die Vorrichtung integriert werden, die Partikel Levitation sind und wie sie sich durch den Abbildungsbereich (2) passieren analysiert.

Abbildung 1: Autarke Magnetic Levitation Plattform. (A) Compact Magnetschwebebahnen Vorrichtung mit einer magnetischen Fokussierungsmodul Abbildungskomponenten (eine Leuchtdiode (LED), eine optische Linse und einer Kamera - Detektor), und eine Verarbeitungseinheit mit einem Anzeigebildschirm. (B) Die magnetische Feldstärke in der cross-Abschnitt des Bereichs zwischen den Magneten, wenn die Probe eingeführt ist. Die Feldstärke ist am größten an der Oberfläche der Magneten und nähert sich Null an der Mittellinie zwischen ihnen. (C) Teilchen, wie Zellen, innerhalb der magnetischen Felderfahrung mehrere Kräfte: eine Magnetkraft (F _m) in Richtung der Mittellinie zwischen den Magnetics, mit Größe von der Position des Partikels Variierens basiert; eine Gravitationskraft (F _g ') , die auf der Partikeldichte relativ zu derjenigen des Suspensionsmediums und eine Widerstandskraft (F _d) Widerstand gegen die Teilchenbewegung abhängt. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁸ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Feigeure 2: Smartphone-kompatibel Magnetic Levitation Platform Flow unterstützt. (A - c) Front (a), Seite (b) und zurück (c) Ansichten der Magnetschwebebahn Vorrichtung (d) Die Komponenten des Gerätes gehören: 1) der Magnetschwebetechnik - Modul, einschließlich Permanentmagneten, eine Vergrößerungslinse, und eine LED und Lichtdiffusor, 2) Smartphone Fall, 3) Elektronik, einschließlich eines Mikrocontrollers, Pumpentreiber und Bluetooth-Empfänger, 4) Mikropumpenhalter, 5) verstellbare Öffnung, 6) Abfallrohrhalter, 7) Batteriehalter, 8 ) Probenhalter, 9) Doppelzweck-Stand und Deckel. (E) schematisches Fluss, der Probe durch das Magnetfeld zeigt Pumpen. (F) Querschnitt des Magnetschwebemodul, das zeigt , wie Teilchen unterschiedlicher Dichten auszurichten , wie sie durch das Feld gepumpt werden; weniger dichte Teilchen, wie Partikel 1, wird bei einer höheren Schwebehöhe t äquilibrierenhan dichteren Teilchen, wie Teilchen 2. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Amin, et al. ¹ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Mindestanforderungen für die Verwendung von jeder Probe für die Dichteverteilungsanalyse in diesem System umfassen die Fähigkeit, eine Suspension von Zellen oder Teilchen, die größer als etwa 5 & mgr; m und weniger zu erhalten als etwa 250 um in der Größe (für die Bildgebung und Bildverarbeitung), und seine Kompatibilität mit in einer Lösung eines paramagnetischen Lösungsmischen wie das Gadobutrol hier verwendet. Für die Krankheitsdiagnose umfassen kompatible Anwendungen solche, in denen (i) Zellen von Interesse von Natur aus eine veränderte Dichte aufweisen, wenn sie eine Erkrankung im Vergleich zu gesunden Kontrollen tragen, (ii) kann eine Dichteänderung in der Zelle durch Zugabe eines Reagens oder einige induziert werden Alternative Behandlung für eine kurze incubation Zeit, oder (iii) verschiedene Zelltypen werden in einer einzigen Probe identifiziert und von Natur (oder über irgendeine Behandlung) haben einzigartige charakteristische Dichten.

Sichelzellenanämie ist eine genetische Erkrankung eine mutierte Form von Hämoglobin verursacht, HbS, in eine Person , die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) hergestellt werden, die in intermittierenden gefäßverschließenden Ereignisse und chronische hämolytische Anämie ⁹ führen kann. Es wird unter Verwendung von entweder Hämoglobin diagnostiziert isoelektrische Fokussierung, Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Fraktionierung oder Hämoglobin Elektrophorese, die sehr genau sind, müssen jedoch in einem klinischen Testlabor durchgeführt werden, da sie mit Point-of-care-Einstellungen nicht kompatibel sind. Löslichkeit und papierbasierte Tests für die Sichelzellkrankheit wurden vorgeschlagen, aber erfordern in der Regel subjektive Benutzer Interpretation und Bestätigungstest. Hier verwenden wir eine dichtebasierte Ansatz Sichel RBCs zu identifizieren, die eine höhere Dichte als RB erreichenCs von Menschen ohne Sichelzellenkrankheit. Der Mechanismus beinhaltet Polymerisation der mutierten Form von Hämoglobin, HbS, die unter Bedingungen von Sauerstoff befreitem RBC Dehydratisierung in Sichelzellanämie verursacht RBCs ^{10, 11, 12, 13.}

Diese Dichte-basierten Ansatz kann auch angewendet werden , um Zellen verschiedener Typen auf der Basis der Dichte zu trennen: weiße Blutkörperchen (WBCs) und RBCs ^7. WBL sind in der Regel verantwortlich für Infektionen im Körper bekämpfen. WBC-Zytometrie kann verwendet werden, um die Zahl dieser Zellen im Blut zu quantifizieren, und dient als ein nützliches Diagnosewerkzeug. WBC zählt höher als normal (allgemein als mehr als 11.000 Zellen pro Mikroliter) können Infektionen, Erkrankungen des Immunsystems oder Leukämie hinweisen. WBC zählt unter dem normalen Bereich (etwa 3500 Zellen pro Mikroliter) können durch Autoimmunerkrankungen oder condit verursacht werdenIonen, die Schädigung des Knochenmarks. Im Gegensatz zu alternativen Technologien, präsentiert hier der Prozess verlässt sich nicht auf die Lyse der roten Blutkörperchen oder Flecken um WBCs zu identifizieren. Diese zellbasierten Test nutzt die einzigartigen inhärenten Dichten der beiden Zelltypen Trennung durchzuführen, da die WBC Populationsdichte der RBC Population , die niedriger sein berichtet wurde , als wie zuvor ^{3 2,} Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von berechnet.

Im Vergleich zu alternativen Tests an entfernten Standorten, ist dieser Test schnell, mit einfachen Probenvorbereitung (3), die Trennung der Zellen in der Vorrichtung innerhalb von 10 bis 15 min, und die automatisierte Bildverarbeitung und Analyse , die weniger als 1 min erfordert. Auf diese Weise kann das Gerät Ergebnisse schnell wieder besser zu medizinischen Entscheidungen informieren, damit die Behandlung sofort verabreicht werden, physischen und psychischen Schmerzen zu lindern und das Risiko von Komplikationen associ reduzierenmit einer Verzögerung in der medizinischen Versorgung ATED. Diese Technik kann vor Ort entweder in klinischen Umgebungen durch einfache Probenaufbereitung und automatisierte-Bildgebung und Analyse durchgeführt werden, die ein Ergebnis mit einer minimalen Benutzereingabe oder Interpretation liefert. Aufgrund der Verwendung eines einfachen Ansatz Permanentmagneten für die Probenanalyse und die Verwendung von entweder einem Smartphone oder einfache elektrische Komponenten für die Bildverarbeitung und Bildverarbeitung, wobei die Vorrichtung sowie die per-Testkosten sind minimal im Vergleich zu einigen anspruchsvolle Testverfahren.

Protocol

Ethische Erklärung: Alle Verfahren menschlichen Blutproben beteiligt sind, wurden durchgeführt nach den institutionellen Regelungen. Alle Protokolle wurden vom Institutional Review Board überprüft und genehmigt. Eine informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern gegeben.

1. Probenvorbereitung für die Sichelzellenanämie - Diagnose ^{5, 8}

1. Bereiten Sie eine 50 mM Lösung von Gadobutrol in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Man löst 10 mM Natriummetabisulfit in der Gadolinium-Lösung.
   HINWEIS: Natriummetabisulfit ist giftig beim Einatmen und reizt stark Haut und Gewebe. Es ist eine ätzende Säure, wenn sie mit Wasser vermischt. Es zersetzen können giftige Dämpfe Oxid von Schwefel und Natrium zu emittieren, wenn sie auf eine hohe Temperatur erhitzt.
3. Erhalten Blutprobe entweder über der Fingerkuppe oder venipuncture.
   1. Zeichnen Sie Blut ein Stechgerät mit einem sauberen, Einweglanzette verwenden. ApLagendruck in der Nähe der durchbohrten Seite und wischen Sie den Blutstropfen gebildet drei- bis viermal so vor Blut mit einer Pipette zu sammeln; darauf achten, nicht mit dem Finger auf "Milch" durch das Gewebe quetschen, da dies zu einer Verunreinigung der Probe mit Gewebeflüssigkeit führen.
   2. Alternativ ziehen Blut unter Verwendung von Standardverfahren venipuncture ^14.
      HINWEIS: Wenn Proben für mehr als ein paar Stunden gelagert werden, sammeln und das Blut in einen Vacutainer mit einem Antikoagulans wie EDTA.
4. In weniger als 1 ul Blut zu 100 ul des Gadolinium-Natriummetabisulfit-Lösung.

2. Probenvorbereitung für die WBC - Cytometry ⁷

1. Erhalten Blutprobe entweder über der Fingerkuppe oder venipuncture, wie in Abschnitt 1.
2. Optional: Lyse RBCs mit einem RBC-Lyse-Puffer. Pipette 5 ul Blut in 500 ul Puffer RBC-Lyse und 3 bei Raumtemperatur inkubieren - 5 min.
   HINWEIS:dies kann die Schwebebereich einer isolierten Population von weißen Blutkörperchen zu bestätigen erfolgen. Allerdings ist es nicht notwendig, diesen Schritt durchzuführen, wie die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass RBCs bei einer deutlich niedrigeren Position als WBL levitieren.
3. Verdünnen Sie Vollblut 1: 1000 in 25 mM Gd in HBSS
   HINWEIS: wenn Zell-Lyse durchgeführt wurde, verdünnte die lysierte Probe 9: 1 lysierte Probe: 250 mM Gd eine Probe enthält 25 mM Gd zu erhalten.

3. Analyse der Proben der Magnetschwebebahn - Plattform ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Starten Sie die Magnetschwebebahn - Gerät:
   1. Für die unabhängige Vorrichtung, schließen Sie das Gerät, lassen Sie es an die Macht, und setzen Sie auf eine flache, ebene Oberfläche.
   2. Für die Smartphone-kompatible Version, starten Sie die Anwendung Smartphone und Swipe Bild eingeben linksAufnahmemodus, und auf einer flachen, ebenen Oberfläche.
2. Für statische Magnetschwebebahn:
   1. Legen Sie die vorbereitete Probe in eine quadratische Glas Mikrokapillarröhre durch das Ende in die Lösung getaucht wird und damit die Probe die Kapillare durch Kapillarwirkung zu füllen.
   2. Dichten Sie das Ende mit einem Rohrdichtstoff langsam ein Ende der Kapillare in das Material gedrückt wird.
   3. Legen Sie die Kapillare zwischen den Magneten des Magnetschwebegerät , so dass nur 1 cm der Röhre sichtbar bleibt (bitte Abbildung 3 eine Abbildung der Probenvorbereitung zu sehen).
      HINWEIS: Dieser Schritt bleibt die gleiche sowohl für die Smartphone-kompatibel und in sich geschlossenes Gerät.
   4. Warten Sie 10 min, ohne das Gerät zu stören oder die Kapillare.
3. Für Magnetschwebebahn Fluss unterstützt:
   1. Legen Sie die Probe in das Probenröhrchen.
   2. Schließen Sie den Zulaufschlauch zwischen dem Probenbehälter und microcapillary und den Ablaufschlauch zwischen der Mikrokapillare und Abfallbehälter verbinden.
   3. Stellen Sie die LED-Intensität und Strömungsparameter.
4. Stellen Sie sicher, dass die Zellen im Blickfeld sichtbar sind, dann die Aufnahmetaste drücken, um ein Bild (Taste 3 auf dem eigenständiges Gerät und die Kamera-Taste auf der Unterseite des Bildschirms in der Smartphone-Anwendung) zu erfassen.
   HINWEIS: Wenn ein USB verwendet wird, um die Bilder zu speichern, erstellen Sie einen Ordner "Bilder" genannt, und stecken Sie den USB vor auf dem Gerät zu drehen. Wenn kein Laufwerk vorhanden ist, speichert das Gerät die Bilder im internen Speicher und später übertragen.
   HINWEIS: Mehrere Bilder aufgenommen werden können, und analysiert, um die Gefahr von Anomalien zu verringern, indem die Kapillare in bzw. aus etwa ½ cm zwischen Bilderfassung bewegt.
   HINWEIS: Wenn die Anzahl der Zellen innerhalb des Sichtfeldes zu hoch oder zu niedrig ist (wie auf der Benutzeroberfläche erkannt und gemeldet), verschieben sich die Kapillare in das oder aus dem Gerät oder bereiten eine andere sample.
5. Entfernen Sie die Probe und entsorgen Sie die Probe nach den institutionellen oder lokalen Vorschriften. Die Kapillaren sind als scharfe entsorgt werden.

Abbildung 3: Probenvorbereitung und Benutzeroberfläche. (A) Das Probenvorbereitungsverfahren beinhaltet des Subjekts Fingerstech, ein Blutstropfen bildet, Übertragen des Bluttropfens auf die Probentestlösung, Rühren der Probe und dem Laden in ein Kapillarröhrchen durch Kapillarwirkung, und das Einsetzen der Probe in die Magnetschwebebahn Gerät. (B) Diese Probenvorbereitungsschritte werden auch auf dem Bildschirm des Geräts angezeigt Probenvorbereitung zu führen. (C) Das Gerät verfügt über vier Tasten: eine Taste in das Musterbild zu vergrößern, um den Fokus mit der Einstellknopf richtig einzustellen; eine Taste ein einzelnes m zu erhaltenessung (a 5 s Verzögerung umgesetzt wird Zeit für den Benutzer zu ermöglichen, die Probe einzusetzen); eine Zeitraffer-Messung (6 Bilder werden in 5 s Intervallen genommen); und eine Taste, um einzuschalten, das Gerät nach Gebrauch aus. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁸ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Bildanalyse ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Führen Sie die Bildanalyse-Software auf dem Gerät für die entsprechende Probe (Zellverteilung oder Zelltyp-Trennung) enthalten.
   ANMERKUNG: Die in sich geschlossene Vorrichtung wird die Analyse automatisch durchgeführt und auf der graphischen Benutzeroberfläche angezeigt. Für die Smartphone-kompatible Geräte, die Analyse durchzuführen, gehen Sie in die Galerie einnd die gewünschte Videodatei auswählen analysiert werden.
2. Bitte beachten und die Ausgabe der Analyse aufzeichnen, die auf dem Bildschirm angezeigt.
   HINWEIS: Für die Zellverteilungsanalyse (wie Sichelzellenkrankheit Diagnose), wird die Ausgabe der Breite der Beschränkung der Zellpopulation sein.
   HINWEIS: Für Zelltyp Trennung (wie WBC identification), wird der Ausgang identifiziert ein Bild mit der WBC Population ist. Um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter zu berechnen, um die durchschnittliche Anzahl von WBCs pro Bild um den Faktor 2,000 zu multiplizieren. wenn 5 WBL beobachtet wurden, würde dies anzeigen, zum Beispiel 10.000 WBL / ul. Der Normalbereich wird allgemein als 3500 sein - 11.000 WBL / ul.
3. Die Analyse zu wiederholen, indem die Probenröhrchen Bewegen in die oder aus der Vorrichtung etwa ½ cm und Einfangen ein anderes Bild analysiert werden, wie oben beschrieben.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Analyse 5 zu wiederholen - 6 mal pro Probe Fehler zu vermeiden.

Representative Results

Für Verteilungsanalyse der Zelldichte, die die Technik zur Sichelzellenkrankheit Diagnose verwendet wird, ist das Ziel, die Breite der Verteilung der Zellpopulation zu identifizieren. Die Blutzellen von Patienten ohne Sichelzellkrankheit innerhalb einer vorhersagbaren Breite beschränkt werden. Zellen von Patienten mit Sichelzellkrankheit wird über einen weiteren Bereich mit einer nach unten gerichteten Schrägstellung in der Zellverteilung (siehe Abbildung 4) für eine bestimmte Anwendung, eine Schwelle verteilt werden kann zwischen der Verteilungsbreite von Kontrollproben im Vergleich zu der von gesunden eingestellt werden Proben als Cutoff zwischen "gesund" und "positiv für die Krankheit" ^{5, 8.}

Abbildung 4: Beispiel für Magnetic Levitation zu analysieren Density Verteilung als Indikator für die Sichelzellenanämie in Blutproben. Auf der linken Seite sind die roten Blutzellen und in einem engen Bereich beschränkt. Auf der rechten Seite erreichen eine Teilmenge von roten Blutkörperchen eine höhere Dichte und daher eine niedrigere Schwebehöhe, nach unten um die Verteilung Schrägstellung und die Breite der Beschränkung zu erhöhen. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Um die Dichteverteilung einer Probe zu analysieren, ein Berechnungsalgorithmus in der Vorrichtung implementiert. Zunächst werden die Pixelintensitätsverläufe entlang der vertikalen und horizontalen Achsen berechnet. Die Magnetkanten und die Kapillar-Kanten werden als die Spitzen in den vertikalen Pixel Gradientenprofile detektiert. Der Abstand zwischen den inneren Rändern kapillaren in Pixeln ist bekannt, 0,7 mm zu sein, und wird daher als scali verwendetng Faktor zu konvertieren Entfernungen von Pixeln auf Millimeter. Die Pixelintensitätsverlauf entlang der horizontalen Achse am größten ist, wo Zellen befinden. Dieser Gradient Profil wird analysiert und mit einer Gauß-Kurve. Der Wert der 4-fachen Standardabweichung dieser Kurve wird als Confinement Breite berichtet.

Die Ergebnisse in Abbildung 5 zeigen die Confinement Breiten sowohl für die Kontrolle und Sichelzellenkrankheit Proben. Hier werden Proben mit einer größeren Breite Confinement (über 50 um) würde Sichelzellerkrankung positive und die unterhalb dieser Schwelle für die Krankheit als negativ angesehen werden würde betrachtet werden. Es sollte beachtet werden , dass andere Verfahren zur Analyse der Sichelzellverteilung untersucht und berichtet von Yenilmez, et al. ⁸

Zahl5: Quantifizierung der Confinement Breite für Sichelzellenanämie - Diagnose. Experimentelle Ergebnisse für Confinement Breite der Kontrolle (n = 48 Bilder über 4 Probanden) und Sichelzellerkrankung (n = 93 Bilder über 10 Probanden) roten Blutkörperchen. Ergebnisse sind statistisch signifikant nach einem Mann-Whitney-Wilcoxon zweiseitigen Test (normal Näherung n ₁ = 3, n ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). Die Whisker stellen die minimalen und maximalen Einschlussbreiten aus den Proben getestet und Sternchen Ausreißer darstellen. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁸ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zur Partikelabscheidung, die WBCs kann verwendet werden in Blutproben zu identifizieren, ist das Ziel, zwei verschiedene popul zu identifizierentionen. Wenn die Populationen unterschiedliche Dichten haben, werden sie in unterschiedlichen Bereichen in dem Sichtfeld zu beobachten. Somit homogene Populationen von zwei oder mehr Teilchen mit unterschiedlichen Dichten levitiert werden kann und bei der Trennung können die mehreren Populationen in dem Bild beobachtet werden , und ⁴ unter Verwendung der Bildanalysealgorithmus erkannt (siehe Abbildung 6).

Um die Trennung von zwei unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren, wird ein Algorithmus implementiert, der die zwei getrennten Populationen im Gleichgewicht unterscheidet. In ähnlicher Weise wie bei Sichelzellanämie Analyse beschrieben, sind zwei Gauß'schen Verteilungen der Probe fit, eher als eine einzige Kurve. Jeder Peak in den Pixelintensitätsverläufe stellt eine andere Zellpopulation. Die Gaußsche Kurvenanpassung auf diese Daten geben sowohl die durchschnittliche Schwebungshöhe (relativ zu der Position des unteren Magneten) als Mittelwert der Gauss'schen Kurve unddie Einschluss Breite wie die Standardabweichung der Kurve ^7.

Abbildung 6: Beispiel für Magnetic Levitation einer gemischten Population von Mikroteilchen mit Distinct Wichten. (A) Eichkurven Korrelieren Mikrokügelchens Dichte mit der Höhe Levitation in fünf verschiedenen Konzentrationen Gd im Bereich von 12,5 bis 200 mM. Die Steigung ist am größten bei den niedrigsten Konzentrationen von Gd, wodurch eine höhere Auflösung (dh Empfindlichkeit für kleine Dichteunterschiede) anbietet. Die Steigung ist am niedrigsten bei höheren Konzentrationen von Gd, die erhöhte Erfassungsbereich demonstrieren, aber mit geringerer Auflösung. (B) zeitabhängige Trennung einer homogenen Probe - Mikrokügelchen mit zwei unterschiedlichen Dichten über den Verlauf von zwei Minuten. Im Gleichgewicht (rechts), zwei distinkte Banden werden durch das Bild erkannt anallyse-Algorithmus. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁷ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Um für jede gegebene Anwendung einzelner Zelltypen mit unterschiedlichen Dichten zu identifizieren, ist es ratsam, zuerst einen Zelltyp zu einem Zeitpunkt schweben die erwartete Schwebehöhe zu quantifizieren. Figur 7a zeigt die Schwebehöhe von WBCs aus einer Blutprobe , bei dem die RBCs wurden lysiert worden. Dies definiert die Region der Entbindung von WBL für die weitere Analyse. Die Ergebnisse zeigen, dass RBCs levitate niedriger als WBCs und somit können WBCs aus Blutproben basierend auf der Schwebeposition unterscheiden. Das Volumen innerhalb eines bestimmten Sichtfeld beträgt 0,5 & mgr; l. In Proben, die 1 verdünnt wurden: 1000, um die Anzahl der WBCs / & mgr; l kann durch Zählen berechnet werdendie Zahl der weißen Blutkörperchen im Bereich um einen Faktor von 2,000 ⁷ Ansicht und vervielfachen.

Abbildung 7: WBC Cytometry in Vollblut. (A) Levitation von WBCs aus Blut nach RBC - Lyse. Dies definiert den Bereich, in dem WBCs in dem Magnetfeld in 25 mM Gd levitieren. (B) Beispiel für WBC - Zählung (WBL durch blaue Pfeile gekennzeichnet). Der obere Rahmen Inlay zeigt WBL und der untere Rahmen und der untere Rahmen Inlay zeigt die RBC Population. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus Yenilmez, et al. ⁷ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Kritische Faktoren in diesem Verfahren umfassen die richtige Ausrichtung der Magnete. Wenn die Magnete sich lösen oder getrennt mehr als normal in dem Gerät, kann dies Auswirkungen auf die Ergebnisse. Zu steuern, um diesen Fehler oder andere in dem Prozess, eine Dichte gesteuerten Teilchen, wie Polystyrol-Mikrokügelchen, kann periodisch für Veränderungen über die Zeit zu steuern, verwendet werden. Ferner ist Schwebezeit wichtig, damit die Zellen ein Gleichgewicht zu erreichen. Für den roten Blutkörperchen, ist 10 Minuten ausreichend, um alle Zellen zu ermöglichen Gleichgewicht zu erreichen. Es ist jedoch wichtig, dass kleinere Teilchen oder Zellen zu beachten, kann eine längere Zeit erfordern das Gleichgewicht zu erreichen. Dies kann durch Zeitrafferbilder mit einer 5 s Intervall und Auftragen der Confinement Breite im Laufe der Zeit beurteilt werden; Gleichgewicht kann als der Punkt bestimmt werden, bei der die Änderung in der Gefangenschaft Breite vernachlässigbar ist.

Weitere wichtige Schritte innerhalb des Protokolls sind die Prereitung der Gadolinium-Lösung bei der genauen Konzentration, da dies einen großen Einfluss auf Probe Schwebehöhe. Dies kann vor der Zeit und aus einer Stammlösung verwendet, durchgeführt werden, sondern muß ordnungsgemäß Verdampfung der Lösung zu vermeiden, abgedichtet werden und eine ungewollte Erhöhung der Konzentration. Ferner muss darauf verwendet, den Gesundheitszustand der Zellen aufrechtzuerhalten genommen werden. Für menschliches Blut über Fingerkuppe gezogen, sollte es innerhalb einer Stunde nach Blutabnahme verwendet werden, und nicht durch Lagerung in einem verschlossenen Behälter trocknen gelassen. Für die menschliche durch Venenpunktur entnommenem Blut, Proben sollten nicht länger als eine Woche mit Antikoagulans (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), eine gemeinsame Antikoagulans, wurde hier verwendet) bei 4 ° C gelagert werden. Für adhärenten Zelllinien sollten tote Zellen gründlich aus dem Kultur Trypsinierung vor gewaschen werden und Zellen sollten bis zur Verwendung inkubiert werden. Die Gesundheit der Zellen zum Zeitpunkt der Levitation ist kritisch, weil Zellgesundheit Dichte zu beeinflussen, ist bekannt und daher Schwebehöhet.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Wir haben die Trennung und Einschluss von Zellen von zwei unterschiedlichen Dichten bei predicable Orten in dem Magnetfeld nachgewiesen. Um diese Technik für andere Anwendungen zu erweitern, verschiedene Formulierungen des paramagnetischen Medium kann einen gewünschten Erfassungsbereich für alternative Anwendungen , ³ zu erhalten , verwendet werden. Die Konzentration von Gadolinium regelt die Auflösung der Erfassung sowie den Bereich (siehe auf 6a). Weil höhere Konzentrationen an Gadolinium an die Zellen angelegt, um die Stärke der Magnetkraft zu erhöhen, je höher die Konzentration von Gadolinium in der Suspensionslösung ist, desto kleiner wird der Unterschied in Schwebehöhe für irgendeinen Unterschied in der Zelldichte sein. Während dies die Auflösungsgrenzen, definiert als die Fähigkeit von kleinen Unterschieden in der Zelldichte zu unterscheiden, erhöht es den Bereich der Dichten, die analysiert werden können,d. In ähnlicher Weise wird die Konzentration von Gadolinium Verringerung der Auflösung zu erhöhen, aber den Bereich der Erkennung verringern. Ferner kann die Dichte des Mediums verändert werden, um die Nachweisgrenze nach oben oder unten zu verschieben. Die zweite Kraft, die Schwebehöhe steuert, ist die Auftriebskraft, die auf die relative Dichte der Zelle hängt im Vergleich zu derjenigen des Suspensionsmediums. Hier wird eine auf Wasser basierende Suspensionslösung verwendet wird, was bedeutet, dass die Zellen mit einer Dichte, die die gleiche wie die des Mediums levitate ist an der Mittellinie zwischen den beiden Magneten mit weniger dichten oder dichteren Zellen oberhalb oder unterhalb der Mittellinie schweben, bzw. (mit ein Bereich, der durch Magnetkraft gesteuert, wie zuvor beschrieben). Da Auftriebskraft ist abhängig von der relativen Dichte, die Dichte des Mediums zu erhöhen wird die Erfassungsbereich in einen höheren Bereich von Zelldichten verschieben. In ähnlicher Weise wird eine geringere Dichte Medium verschieben den Erfassungsbereich zu einem unteren Bereich von Zelldichten. < / P>

Wir haben auch die Leistung der Strömungs unterstützte magnetische Fokussiereinrichtung durch die normierte Teilchenzahl über die Kapillare Breite Quantifizieren (dh Wahrscheinlichkeit eines Teilchens in einem Abstand über der Kapillare Breite zu fließen). Niedrigere Durchflussraten haben mehr Einschluss von Teilchen, sondern führen zu einem geringeren Volumendurchsatz, was ein Nachteil für seltene Objekterkennung in hochvolumigen Proben sein kann. Dies kann jedoch durch mehrere Durchgänge in dem Magnetfeld oder über längere Magneten angesprochen werden. Trennung zwischen mehreren Zelltypen können auch in zukünftigen Studien genutzt werden, um die Teilchen mit unterschiedlichen Dichten zu isolieren, indem eine mikrofluidische Separators am Ende des Magnetfeldes nutzt.

Wenn mehrere Zelltypen zu trennen, kann es hilfreich sein, jede Population einzeln, um zu schweben die mittlere Höhe und der Bereich jeder Zelltyp vor levitating die homogene Population herzustellen.

e_content "> Einschränkungen der Technik
Die hier vorgestellten Verfahrens ist die Trennung von Teilchen unterschiedlicher Dichten begrenzt. Um eine zuverlässige Identifizierung von mehreren Zelltypen zu erreichen, ist es wichtig, dass sie diskrete Dichtebereiche, die sich nicht überlappen. die Partikel, die detektiert werden können weitere, in ihrer Größe begrenzt. Sie müssen in der Lage sein, sich frei innerhalb der Mikrokapillarröhre zu bewegen - 200 & mgr; m ist die empfohlene Obergrenze für den Partikeldurchmesser. Ferner muß Partikel groß genug sein, eindeutig abgebildet werden - 5 & mgr; m ist die empfohlene Untergrenze für den Durchmesser.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Dieser Ansatz zur Zellanalyse ist einfach und ermöglicht benutzerfreundliche Analyse vor Ort. Viele medizinische Diagnoseverfahren müssen in der klinischen Testlabors durchgeführt werden und erfordern von einem geschulten Labor specialis ausgeführt Prüfgeräte und Verfahren spezialisiertt. Allerdings erfordert dieses Protokoll eine einfache Vorrichtung, die besser zugänglich zu Gesundheitskliniken ist. Die Probenvorbereitung ist einfach und die Analyse automatisiert wird, um das Risiko für Anwenderfehler zu minimieren.

Dieses Gerät ermöglicht eine schnelle Vor-Ort-Tests für eine Vielzahl von medizinischen Bedingungen. Das Gerät ist benutzerfreundlich, markierungsfrei und tragbar, wodurch es ideal für Point-of-Care-Diagnostik Krankheit zu machen. Im Vergleich zum aktuellen Standard der Fern klinische Labortests, wird dieser Ansatz Ärzte ermöglichen, schnell fundierte Entscheidungen in Bezug auf die Patientenversorgung zu machen und möglicherweise Komplikationen aufgrund von Verzögerungen bei der Versorgung zu verhindern. Die Plattform wurde mit leicht zugänglichen und preiswerten Komponenten entwickelt, so dass weit verbreitete Anwendung dieser Methode in der klinischen Einstellungen und Entwicklungsländern und weltweit Zugang zu Gesundheitsversorgung zu verbessern.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Es ist wichtig zu beachten, dass dieTests hier beschrieben sind noch nicht auf einem großen Patientenpopulation validiert. Bis heute hat Sichelzellenkrankheit Diagnose in einer kleinen Patientengruppe bestätigt ^{2, 5} und WBC - Zytometrie wurde als Proof of Concept unter Beweis gestellt. Klinische Studien mit diesen Anwendungen und die in der Zukunft entwickelt werden, müssen ausgeführt werden, um dieses Verfahren vor der klinischen Verwendung zu überprüfen, aber die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, Versprechen für eine eventuelle Verwendung dieser Technologie und Technik für die Point-of-care klinischen Diagnostik.

Mit diesem Ansatz für die Dichte-basierten Zytometrie Analyse kann letztlich auf zusätzliche Krankheit diagnostische Anwendungen erweitert werden. Dieser Ansatz der magnetischen Levitation von Einzelzellen für die Krankheitsdiagnose wie hier beschrieben, erfordert die Verwendung von Einzelzellsuspensionen eines Patientenzellen und auf Zellen, die aufgrund der Verwendung unter Verwendung des aktuellen Systems mit seinen Beschränkungen Auflösung abgebildet werden kann,einer Smartphone-Kamera oder Low-Cost-Optik. Ferner ist diese Technik auf Krankheiten anwendbar, die eine der folgenden Bedingungen erfüllen: (i) Zellen von Interesse eine veränderte Dichte erreichen müssen, wenn sie die Krankheit im Vergleich zu gesunden Kontrollen, (ii) eine Zelldichteänderung durch Zugabe von induzierbar sein tragen müssen ein Reagens (oder jede verfügbare alternative Behandlung) oder (iii) die Diagnose verschiedenen Zelltypen in einer einzigen Probe zu identifizieren beinhalten müssen, die entweder von Natur aus oder über irgendeine Behandlung eindeutige Dichten aufweisen. Zukünftige Anwendungen auf andere Krankheiten, die die gleiche Plattform-Gerät kann einen enormen Einfluss auf die globale Gesundheit haben. Diese können Detektion von biologischen Komponenten umfassen, die durch Dichte auszeichnen. Bestimmte Zelltypen, Zellen, die Zelltod durchlaufen und kranken Zellen alle wurden einzigartige Dichte Signaturen aufweisen und somit unterschiedliche magnetische Muster abgebildet, und somit quantifiziert werden können und getrennt mit Hilfe dieser Plattform. Die Zellen in sehr geringen Stückzahlen können auch be detektiert durch Fluidströmung in dem Strömungs unterstützte magnetische Schwebegerät nutzen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201