Introduction
כאן, אנו מציגים פלטפורמה טכנולוגית ו טכניקה המשתמשת ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה אוטומטית וניתוח לנתח את התפלגות הצפיפות של התאים של חולה כאינדיקטור המחלה. גישה תכליתית זו לניתוח cytometric מבוסס צפיפות ניתן ליישם בסופו של דבר מגוון של אבחון מחלה. עם זאת, כדי להיות תואם עם בדיקות צבע של טיפול ולהשתמש במדינות מתפתחות, הטכניקה חייבת לספק את הדרישות עבור עלות נמוכה, ניידות, ואת השימושיות. המכשיר והחומרים המתכלים חייב להשיג בקלות ובעלות נמוכה. הכנת הדגימה חייבת להיות פשוט, ניתוח צריך להיות אוטומטי עם דרישות מינימאליות עבור קלט משתמש או פרשנות, ותוצאות יש להחזיר במהירות. יתר על כן, המכשיר חייב להיות קומפקטי ונייד להיות שימושי במסגרות קליניות וכן במדינות מתפתחות. לכן, פתחנו מכשיר ושיטה להשתמש ריחוף מגנטי טכנולוגית Point-of-care-תואמתogy ידי ניתוח הדמיה התמונה אוטומטית צימוד להחזיר תוצאות בדבר חלוקת צפיפות אוכלוסייה של תאים של החולה.
Point-of-care טכנולוגיות מציעות יתרון בולט מעל הליכי בדיקות מעבדה קליניים נוכחיים. הטכנולוגיה הזמינה כרגע הוא יקר מכדי להיות בבעלות מטפל או מורכבת מדי כדי להתבצע על ידי צוות רפואי. רבים מהליכים אלה דורשים פרוטוקולים עתירי עבודה שחייבת להתבצע על ידי טכנאי מיומן. מסיבות אלה, דגימות המטופל, כגון דם או שתן נאספים בדרך כלל במשרדו של הרופא, מועברים למעבדה לבדיקות מרחוק, מרכזי עבור ניסויים קליניים, אשר עשוי להימשך מספר ימים הרופא לקבל את תוצאות הבדיקה. זה יכול לגרום לעיכובים או סיבוכים במהלך טיפול ובמקרים מסוימים, עושה בדיקה זו מאוד יקרה ולא יעילה (שביקורים אלה יטילו עול כספי על משלמי ביטוח), ובהמשך גורם לנו לתחושהאבחון נגיש במסגרות דל במשאבים ומדינות מתפתחות.
כאן, אנו מציגים טכניקת ריחוף מגנטית יחד עם הדמיה אוטומטית וניתוח בשני מכשיר עם הדמיה מוטבעת ועיבוד (איור 1) למכשיר תואם לסמארטפון (איור 2). התקני ריחוף מבוסס המגנטיים אלה מייצגים פלטפורמת טכנולוגית חלים רחב אשר יש לו את הפוטנציאל להיות מיושמת על מגוון רחב של יישומים אבחוניים רפואיים שונים. תפקידי גישת הריחוף המגנטיים המבוססים על שיווי משקל בין שני כוחות: כוח מגנטי וכוח ציפת 1, 2, 3. כאשר חלקיק מושעה במדיום פאראמגנטיים ונוסף שדה מגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים בעלי קוטביות כמו זה מול זה, מעשי כוח מגנטיים על החלקיק בכיוון לעבר האמצע בין שני magn ETS. כוח הציפה נגרם על ידי הצפיפות היחסית של החלקיקים לעומת המדיום השעיית הוא כלפי מעלה במקרה של חלקיקים פחות צפופים מאשר המדיום וכלפי מטה במקרה של חלקיקים צפופים יותר סביב המדיום. בהתבסס על שני כוחות אלה, חלקיקים יגיעו למצב ריחוף שיווי משקל בתחום שמאזן שני כוחות אלה; עמדה זו קשורה באופן ישיר לצפיפות של החלקיק, עם חלקיקים צפופים מרחפים השדה נמוך מ חלקיקים צפופים פחות. מודול הדמיה, או מובנה המצלמה חכמה 4, 5, 6 או רכיבים אופטיים עצמאיים מצויד בעדשת מגדלת 7, 8, משמש כדי להמחיש את עמדותיהם של החלקיקים. עיבוד תמונה, בין אם באמצעות יישום חכם 4, 5,= "Xref"> 6 או יחידת עיבוד מוטבע 7, 8, לאחר מכן מעבדת את התמונות שנתפסו לכמת את הפריסה המרחבית, ולכן חלוקת צפיפות האוכלוסייה. על מנת לנתח דגימות גדולות (כגון אלה עם רק כמה חלקיקים של עניין למיליליטר, זרימה יכולה להיות משולבת ישירות לתוך מכשיר החלקיקים כאלה לרחף ונותחה כשהם עוברים דרך אזור ההדמיה (איור 2).
איור 1: פלטפורמת ריחוף מגנטי המכיל את כל נדרש. (א) מכשיר ריחוף מגנטי קומפקטי כולל מודול התמקדות מגנטי, רכיבי הדמיה (דיודה פולטת אור (LED), עדשה אופטית, וגלאי המצלמה), ויחידת עיבוד עם מסך תצוגה. (ב) עוצמת השדה המגנטי של הקרוSS-קטע השטח שבין המגנטים שבו המדגם מוכנס. עוצמת השדה היא הגדולה ביותר על פני השטח של מגנטים שואף לאפס על האמצע ביניהם. (ג) חלקיקים, כגון תאים, בתוך הכוחות כמה ניסיון שדה המגנטי: כוח מגנטי (מ F) לכיוון האמצע בין המגנטיות, עם גודל משתנים על פי המיקום של החלקיק; כוח כבידה (G F ') אשר תלוי צפיפות החלקיקים ביחס לזה של המדיום מתלים, וכן כוח הגרר (ד F) להתנגד תנועה החלקיקים. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. 8 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תאנהיור 2: Smartphone תואם פלטפורמת ריחוף מגנטית בסיוע זרימה. (א - ג) קדמי (א), בצד (ב), ובחזרה (ג) נופים של מכשיר ריחוף מגנטי (ד) רכיבים של המכשיר כוללות: 1) מודול ריחוף מגנטי, כולל מגנטים קבועים, עדשה מגדלת, מפזר LED ואור, 2) במקרה החכם, 3) אלקטרוניקה, כולל מיקרו-בקר, הנהג המשאבה, מקלט Bluetooth, 4) בעל מיקרו-משאבה, 5) פתח מתכווננת, 6) בעל צינור פסולת, 7) מחזיק הסוללה, 8 בעל מדגם), 9) עמד דו-שימושי ומכסים. (ה) זרימה סכמטי, מראה שאיבה של המדגם דרך השדה המגנטי. (ו) חתך של מודול הריחוף המגנטי, מראה כיצד חלקיקים של צפיפויות שונות יישרו כפי שהם נשאבים דרך השדה; פחות חלקיקים צפופים, כגון חלקיקי 1, יהיו לאזן בכל t גובה ריחוף גבוההחלקיקים צפופים האן, כגון חלקיקים 2. לשכפל, ברשות, מן אמין, et al. 1 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דרישות המינימום לשימוש של כל דגימת לצורך ביצוע אנליזת הפצת צפיפות במערכת זו כוללות את היכולת לקבל השעיה של תאים או חלקיקים גדולים מ כ 5 מיקרומטר ופחות מ כ 250 מיקרומטר בגודל (הדמיה ועיבוד תמונה) ובמידה שבה היא מתיישבת עם ערבוב בתמיסה של פתרון פאראמגנטיים כגון gadobutrol משמש כאן. לאבחון מחלה, יישומים תואמים כוללים את אלה שבהם (i) תאים של עניין יש מיסודו צפיפות שונה כאשר הם נושאי מחלה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה, (ii) שינוי צפיפות יכול להיגרם בתא על ידי תוספת של מגיב או כמה טיפול אלטרנטיבי עבור קצרזמן cubation, או (iii) תאים מסוגים שונים מזוהים יחיד מדגם ו מטבעם (או באמצעות איזה טיפול) יש צפיפות מאפיין ייחודית.
אנמיה חרמשית היא מחלה גנטית גורמת צורת מוטציה של המוגלובין, HBS, כדי להיות מיוצר תאי הדם האדום של אדם (RBCs), אשר יכול לגרום לאירועים לסירוגין vaso-occlusive ו -9 אנמיה המוליטית כרונית. זה מאובחן או באמצעות התמקדות isoelectric המוגלובין, כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) חלוקה, או אלקטרופורזה המוגלובין שהן מאוד מדויקים אבל חייבות להתבצע במעבדת ניסויים קלינית משום שהם אינם עולים בקנה אחד עם הגדרות צבע של טיפול. מסיסויות ובדיקות מבוססות נייר עבור מחלה חרמשית הוצעו, אך בדרך כלל דורשות פרשנות המשתמשים סובייקטיבית ובדיקה מאשר. כאן, אנו משתמשים גישה מבוססת-צפיפות לזהות RBCs מגל, אשר להשיג צפיפות גבוהה יותר מאשר RBCs מאנשים ללא אנמיה חרמשית. המנגנון כרוך פילמור של טופס מוטציה של המוגלובין, HBS, הגורמת להתייבשות RBC ב RBCs מחלה חרמשית בתנאים deoxygenated 10, 11, 12, 13.
צפיפות זו מבוססת גישה יכולה להיות מיושמת גם על מנת להפריד בין תאים מסוגים שונים על בסיס צפיפות: תאי דם לבנים (WBCs) ו RBCs 7. WBCs הוא בדרך כלל אחראי למלחמה בזיהומים בגוף. ניתן להשתמש cytometry WBC לכמת את מספר התאים הללו בדם ומשמש ככלי אבחון שימושיים. WBC ספירת גבוה מהרגיל (נחשב בדרך כלל יותר מ -11,000 תאים לכל μL) עשוי להצביע על זיהום, הפרעות במערכת החיסונית, או לוקמיה. WBC ספירה מתחת לטווח הנורמלי (כ -3,500 תאים לכל μL) עלולים להיגרם על ידי הפרעות או קונדיט אוטואימוניותמיונים מח עצם נזק. בניגוד טכנולוגיות חלופיות, התהליך המוצג כאן אינו מסתמך על תמוגה של RBCs או כתמים על מנת לזהות WBCs. מבחן מבוסס תא זו מנצל את צפיפות הטמון הייחודית של שני סוגי התאים לבצע הפרדה, כמו צפיפות אוכלוסיית WBC דווחה להיות נמוך מזה של אוכלוסיית RBC כפי שהיא מחושבת על שיפוע צפיפות בעבר צנטריפוגה 2, 3.
לעומת בדיקות alterative במקומות מרוחקים, המבחן הזה הוא מהיר, עם הכנת מדגם פשוט (איור 3), הפרדת תאים בהתקן תוך 10 - 15 דקות, ו הדמיה אוטומטית ניתוח אשר דורשת פחות מ 1 דקות. בדרך זו, המכשיר יכול להחזיר תוצאות מהר להודיע החלטות רפואיות טוב יותר, לאפשר טיפול להינתן מייד כדי להקל על כאב פיזי ונפשי, וכן להפחית את הסיכון של סיבוכי associated עם עיכוב טיפול רפואי. טכניקה זו יכולה להתבצע באתר או במסגרות קליניות עקב הכנת מדגם פשוט הדמיה אוטומטית וניתוח אשר מחזירה תוצאה עם קלט או פרשנות משתמש מינימאלי. בגלל השימוש בגישה פשוטה באמצעות מגנטים קבועים לניתוח מדגם והשימוש או סמארטפון או רכיבים חשמליים פשוטים הדמיה ועיבוד תמונה, המכשיר כמו גם את העלויות לכל מבחן הם מינימאליים לעומת כמה נהלי בדיקות מתוחכמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתית: כל הנהלים הקשורים דגימות דם אדם בוצעו על פי ההתקנות המוסדיות. כל הפרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי. הסכמה מודעת ניתנה על ידי כל המשתתפים.
1. הכנת דוגמאות עבור 5 אבחון מחלה חרמשית, 8
- כן פתרון 50 מ"מימ של gadobutrol תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS).
- ממיסים 10 metabisulfite נתרן מ"מ הפתרון גדוליניום.
הערה: metabisulfite נתרן הוא רעיל על ידי שאיפה מאוד מעצבן עור ורקמות. זוהי חומצת מאכל כאשר מעורבב עם מים. זה עלול להתפרק כדי לפלוט אדים רעילים תחמוצת הגופרית ונתרן כשמחממים אותו לטמפרטורה גבוהה. - השג דגימת דם דרך או fingerstick או venipuncture.
- להקיז דם באמצעות מכשיר דקירה עם אזמל נקי, חד פעמי. Apלחץ רובדי סמוך לאתר פירסינג ולנגב את אגל דם שנוצרה שלוש עד ארבע פעמים לפני איסוף הדם בעזרת פיפטה; לדאוג שלא "חלב" האצבע על ידי כיווץ הרקמה, כמו זה יגרום לזיהום של המדגם עם נוזל רקמות.
- לחלופין, להקיז דם באמצעות נהלי venipuncture תקן 14.
הערה: אם דגימות תישמרנה במשך יותר מכמה שעות, לאסוף את הדם לתוך Vacutainer עם נוגד קרישה כגון EDTA.
- להוסיף פחות מ -1 μL של דם עד 100 μl של פתרון metabisulfite גדוליניום-נתרן.
2. הכנת המדגם עבור Cytometry WBC 7
- השג דגימת דם באמצעות fingerstick או venipuncture גם, כאמור בסעיף 1.
- אופציונלי: Lyse RBCs עם מאגר תמוגה RBC. פיפטה 5 μL של דם לתוך 500 μL של חיץ תמוגה RBC דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 - 5 דקות.
הערה:ניתן לבצע זאת על מנת לאשר את מגוון ריחוף של אוכלוסייה מבודדת של WBCs. עם זאת, אין זה הכרחי כדי לבצע שלב זה, כמו התוצאות המוצגות כאן מראות כי RBCs לרחף לעבר עמדה מובהקת נמוכה יותר WBCs. - לדלל דם מלא 1: 1,000 ב 25 מ"מ אלוקים HBSS
הערה: אם תמוגה התא בוצעה, לדלל את המדגם lysed 9: 1 מדגם lysed: 250 מ"מ הקב"ה על מנת להשיג מדגם המכיל 25 מ"מ הקב"ה.
.3 ניתוח של דגימות באמצעות פלטפורמת ריחוף מגנטי 4, 5, 6, 7, 8
- הפעל את מכשיר הריחוף המגנטי:
- עבור מכשיר עצמאי, לחבר את המכשיר, יש לאפשר לה להידלק, ומניחים על משטח שטוח ומאוזן.
- כדי לקבל את הגירסה תואמת החכם, להפעיל את היישום הסמארטפונים להחליק ימינה להיכנס תמונהמצב לכיד, ומניח על משטח שטוח ומאוזן.
- עבור ריחוף מגנטי סטטי:
- טען מדגם המוכן לתוך צינור microcapillary זכוכית מרובעת על ידי טבילה סוף לתוך הפתרון ומאפשר מדגם כדי למלא את נימי דרך פעולת נימים.
- חותם את הקצה עם איטום צינור על ידי דחיפה איטית קצה אחד הנימים לתוך החומר.
- הכנס את הנימים בין המגנטים של מכשיר הריחוף המגנטי כך שרק 1 סנטימטר של הצינור נשאר גלוי (ראה איור 3 לצורך המחשת הכנת המדגם).
הערה: שלב זה נשאר זהה עבור שניהם החכם-תואם עצמאי המכשיר. - חכה 10 דקות מבלי להפריע את המכשיר או הנימים.
- עבור ריחוף מגנטי בסיוע זרימה:
- טענת מדגם לתוך הצינור המדגם.
- חבר את צינורות היניקה בין מיכל מדגם ותערובותcrocapillary ולחבר את צינורות מוצא בין microcapillary מיכל פסולת.
- הגדר את הפרמטרים עוצמת זרימת LED.
- ודא כי תאים גלויים שדה הראייה, ולאחר מכן לחץ על הכפתור הלכיד ללכוד תמונה (כפתור 3 בהתקן העצמאי על לחצן מצלמה על החלק התחתון של המסך ביישום הטלפון החכם).
הערה: אם ה- USB המשמש לאחסון תמונות, ליצור תיקייה בשם "תמונות" והכנס את USB לפני הפעלת המכשיר. אם אין כונן קיים, המכשיר יאחסן את התמונות בזיכרון הפנימי והועבר מאוחר יותר.
הערה: תמונות מספר ניתן שנאספו ונותחו כדי להפחית את הסיכון של אנומליות ידי הזזת הנימים פנימה או החוצה על סנטימטר ½ בין לכידת תמונה.
הערה: אם מספר תאים בתוך שדה הראייה הוא גבוה מדי או נמוך מדי (כפי שזוהה ודיווח על ממשק המשתמש), להעביר את הנימים פנימה או החוצה של המכשיר או להכין עוד sample. - הסר את המדגם וזורק במדגם לפי ההתקנות המוסדיות או מקומיות. נימים צריכים להיות מסולקים כמו חדה.
איור 3: הכנת מדגם וממשק משתמש. (א) הליך הכנת המדגם כרוך מפלח את האצבע של הנושא, ויצרתי טיפה של דם, העברת טיפת דם פתרון הבדיקה המדגמית, התססה המדגמת ומעמיסה לתוך צינור נימי דרך הפעולה נימי, והחדרת המדגם לתוך הריחוף המגנטי התקן. (ב) אלה צעדי הכנת מדגם גם מוצגים על המסך של המכשיר כדי להנחות הכנת מדגם. (ג) המכשיר כולל ארבעה לחצנים: לחצן זום לתוך התמונה מדגם על מנת לכוון את המיקוד כראוי באמצעות כפתור התאמה; כפתור כדי לקבל מ יחידeasurement (עיכוב של 5 מיושמת כדי לאפשר זמן עבור המשתמש להכניס את המדגם); מדידת הזמן לשגות (6 תמונות נלקחות s במרווחי 5); ולחצן כדי לכבות את המכשיר לאחר השימוש. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. 8 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. ניתוח תמונה 4, 5, 6, 7, 8
- הפעל את תוכנת ניתוח התמונה כללה במכשיר למדגם המתאים (חלוקת התא או הפרדה סוג התא).
הערה: עבור מכשיר עצמאי, הניתוח מתבצע באופן אוטומטי ומוצג על ממשק המשתמש הגרפי. עבור מכשיר הטלפון החכם תואם, כדי לבצע את הניתוח, עבור אל הגלריהnd לבחור את קובץ הווידאו הרצוי כדי להיות מנותח. - הקפד להקליט את הפלט של הניתוח המוצג על המסך.
הערה: לקבלת ניתוח חלוקת התא (כגון אבחון אנמיה חרמשית), הפלט יהיה רוחב של הכליאה של האוכלוסייה התא.
הערה: לקבלת הפרדת סוג תא (כגון זיהוי WBC), הפלט יהיה דימוי עם אוכלוסיית WBC המזוהית. על מנת לחשב את מספר התאים לכל מיקרוליטר, להכפיל את המספר הממוצע של WBCs לכל תמונה בפקטור של 2,000. לדוגמה, אם 5 WBCs נצפו, זה יצביע 10,000 WBCs / μL. הטווח הנורמלי נחשב בדרך כלל להיות 3,500 - 11,000 WBCs / μL. - חזור על הניתוח על ידי הזזת הצינור מדגם פנימה או החוצה של המכשיר על ס"מ ½ לכידת תמונה אחרת כדי להיות מנותח כפי שתואר לעיל.
הערה: מומלץ לחזור על הניתוח 5 - 6 פעמים לדגימה כדי למנוע שגיאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לקבלת ניתוח התפלגות צפיפות התאים, המהווה את טכניקה המשמשת לאבחון מחלת אנמיה חרמשית, המטרה היא לזהות את רוחב של חלוקת האוכלוסייה התא. תאי דם מחולים ללא אנמיה חרמשית יהיו כלוא בתוך רוחב לחיזוי. תאי מחולים עם מחלה חרמשית יופצו ברחבי אזור רחב יותר, עם הטיה כלפי מטה של חלוקת התא (ראה איור 4) עבור כל יישום מסוים, סף ניתן להגדיר בין רוחב חלוקת דגימות בקרה לעומת זה של בריאה דגימות כמו ניתוק בין "בריא" ו "חיובי למחלה" 5, 8.
איור 4: דוגמה של ריחוף מגנטי כדי לנתח Densitהפצת y כאינדיקטור אנמיה חרמשית בדגימות דם. משמאל, תאי דם אדומים מתוחמים היטב בתוך אזור צר. מימין, קבוצת משנה של תאי הדם האדומים להשיג צפיפות גדולה יותר ולכן לגובה ריחוף נמוך, שתשבש את ההפצה כלפי מטה והגדלת רוחב של כליאה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי לנתח את התפלגות צפיפות של מדגם, אלגוריתם חישובית מיושם בתוך המכשיר. ראשית, הדרגתיים עוצמת פיקסל לאורך צירים אנכיים ואופקיים מחושבים. הקצוות מגנטו ואת קצות נימים מזוהים כמו הפסגות בפרופילי צבע פיקסל האנכיים. המרחק בין קצות נימים הפנימיים, בפיקסלים, ידוע להיות 0.7 מ"מ ולכן משמש סוקלng גורם להמיר מרחקים מן פיקסלים מילימטרים. השיפוע העוצם פיקסל לאורך הציר האופקי הוא גדול ביותר שבו תאים נמצאים. פרופיל שיפוע זה מנותח לנכון עקום גאוס. בפעמים ערך 4 סטיית התקן של עקומת זה הוא כפי שדווח רוחב הכליאה.
תוצאות באיור 5 להראות את רוחב הכליאה הן מלאה דגימות אנמיה חרמשית. כאן, דגימות עם רוחב כליאה גדול (למעלה מ -50 מיקרומטר) ייחשב מחלה חרמשית חיוביות אלה מתחת לסף זה ייחשב להיות שלילי עבור המחלה. יצוין כי שיטות אחרות של ניתוח ההתפלגות החרמשית נחקרו ודיווחו על ידי Yenilmez, et al. 8
דמות5: כימות של רוחב מאסר עבור חרמשית אבחון מחלות. תוצאות ניסיוניות עבור רוחב כליאה של ביקורת (n = 48 תמונות מעל 4 נושאים) ומחלה חרמשית (n = 93 תמונות על 10 נבדקים) כדורי דם אדומות. תוצאות מובהקות סטטיסטיות על פי מבחן דו-צדדי מאן-וויטני-ווילקוקסון (קירוב נורמלי, n 1 = 3, n 2 = 10, Z = -2.6764, p = 0.0074). הזיפים מייצגים את המינימום ורוחב כליאת מקסימלית ממדגמים נבדקו כוכביות מייצגות חריגות. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. 8 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להפרדת חלקיקים, אשר עשוי לשמש כדי לזהות WBCs בדגימות דם, המטרה היא לזהות שני popul הברורations. אם יש אוכלוסיות צפיפויות שונות, הם יקויימו באזורים ברורים שדה הראייה. לכן, אוכלוסיות הומוגניות של שניים או יותר חלקיקים בעלי צפיפות ברורה ניתן לרחף, ואם נעבור אותה פרדה, האוכלוסיות המרובות ניתן לצפות בתמונה זוהו באמצעות ניתוח תמונת האלגוריתם 4 (ראה איור 6).
כדי לנתח את הפרדת שני סוגי תאים שונים, אלגוריתם מיושם מבחינה בין שתי אוכלוסיות מופרדות בשיווי המשקל. באופן דומה לזה שתואר לניתוח אנמיה חרמשית, שתי התפלגויות גאוס הם לנכון המדגם, ולא עקומת יחיד. כל שיא ההדרגתי עוצם פיקסל מייצג אוכלוסיית תאים שונה. עקומות גאוס לנכון נתונים אלה נותנים הן את גובה ריחוף הממוצע (ביחס למיקום של המגנט התחתון) כממוצע של עקומת גאוסהכליאה רוחב כמו סטיית התקן של עקומת 7.
איור 6: דוגמא של ריחוף המגנטי של אוכלוסייה מעורבת של microparticles עם צפיפות ברורה. (א) עקומות כיול התאמת צפיפות microsphere עם גובה ריחוף בחמישה ריכוזים שונים הקב"ה החל 12.5 200 מ"מ. שיפוע הדרך גדול בריכוזים הנמוכים של קב"ה, ובכך מציע רזולוציה גדולה (רגישה כלומר הבדלי צפיפות קטנים). שיפוע הדרך הנמוך ביותר עבור ריכוזים גבוהים יותר של הקב"ה, מה שמדגים את הטווח המוגדל של זיהוי אבל עם רזולוציה נמוכה יותר. (ב) הפרדה תלוית זמן של microspheres מדגם הומוגני עם שתי צפיפויות ברורות במשך שתי דקות. בשיווי המשקל (מימין), שתי להקות שונות מזוהות על ידי אנאלי התמונהאלגוריתם יסיס. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. 7 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי לזהות סוגי תאים בודדים עם צפיפויות שונות עבור כל יישום נתון, רצוי לרחף ראשון סוג תא אחד בכל פעם, כדי לכמת את גובה הריחוף הצפוי. איור 7 א מציג את גובה הריחוף של WBCs מדגימת דם שבו RBCs כבר lysed. זה מגדיר את אזור כליאה של WBCs לניתוח נוסף. תוצאות המחקר מראים כי RBCs לרחף נמוך יותר WBCs, ולכן WBCs ניתן להבחין בין דגימות דם המבוססות על מיקום הריחוף. ההיקף בתוך בכל תחום נתון מבט הוא 0.5 μL. בדגימות אשר דוללו 1: 1,000, מספר WBCs / μL יכול להיות מחושב על ידי ספירתמספר WBCs בתחום להציג הכפלה בפקטור של 2,000 7.
איור 7: Cytometry WBC ב דם מלא. (א) ריחוף של WBCs מהדם הבא תמוגה RBC. זה מגדיר את הטווח בו WBCs לרחף בשדה המגנטי ב 25 מ"מ הקב"ה. (ב) דוגמה של ספירת WBC (WBCs בסימן חיצים כחולים). שיבוץ המסגרת העליון מציג WBCs והמסגרת התחתונה ואת שיבוץ המסגרת התחתון מציג את אוכלוסיית RBC. לשכפל, ברשות, מן Yenilmez, et al. 7 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
גורמים קריטיים בתהליך הזה כוללים את היישור הנכון של המגנטים. אם המגנטים להיות שלא במקומם או מופרדים יותר מרגיל בתוך המכשיר, זה יכול להשפיע על התוצאות. כדי לשלוט על פגם זה או אחר בתהליך, חלקיק שבשליטת צפיפות, כגון microspheres קלקר, שניתן להשתמש בם מדי פעם כדי לשלוט על שינויים לאורך זמן. יתר על כן, זמן ריחוף חשוב לאפשר לתאים להגיע לשיווי משקל. עבור תאי דם אדומים, 10 דקות מספיקות כדי לאפשר לכל התאים כדי להגיע לשיווי משקל. עם זאת, חשוב לציין כי חלקיקים קטנים או תאים עשויים לדרוש זמן רב יותר כדי להגיע לשיווי משקל. זה יכול להיות מוערך על ידי לקיחת תמונות זמן לשגות במרווח של 5 והתוויית רוחב הכליאה לאורך זמן; שיווי משקל ניתן לקבוע את הנקודה שבה שינוי רוחב תיחום הוא זניח.
צעדים קריטיים נוספים בתוך הפרוטוקול לכלול מראשparation של הפתרון גדוליניום בריכוז מדויק כמו זה משפיע גובה ריחוף מדגם מאוד. ניתן לעשות זאת מבעוד המועד והשתמש מפתרון מניות, אבל חייב להיות אטום כמו שצריך כדי למנוע אידוי של הפתרון וגידול מכוון בריכוז. יתר על כן, יש להקפיד לשמור על מצב הבריאות של התאים המשמשים. עבור דם אדם נמשך באמצעות fingerstick, ולכן יש להשתמש בו תוך שעה אחת של לקיחת דם ולא להתייבש על ידי אחסון במכל אטום. עבור דם אדם שצייר venipuncture, יש לאחסן דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מאחוז אחד בשבוע עם קרישה (חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), נוגד קרישה משותף, שימש כאן). עבור שורות תאים חסידות, תאים מתים יש לשטוף ביסודיות מתרבה לפני trypsinization ותאי צריך להיות מודגרות עד שימוש. בריאותו של התאים בעת הריחוף היא קריטית מאחר בריאות תא ידועה להשפיע צפיפות ולכן הי ריחוףt.
שינויים ופתרון בעיות
אנחנו הוכחנו את ההפרדה וכליאה של תאים משתי צפיפויות שונות במקומות predicable בשדה המגנטי. על מנת להאריך את הטכניקה הזו ליישומים אחרים, ניסוחים שונים של מדיום פאראמגנטיים ניתן להשתמש כדי להשיג מגוון רצוי של איתור עבור יישומי חלופה 3. ריכוז גדוליניום מסדיר את הרזולוציה של זיהוי, כמו גם את המגוון (עיין איור 6 א). בגלל בריכוז של גדוליניום להגדיל את כוחו של הכוח המגנטי מוחל על התאים, גדוליניום ריכוז גדול יותר הפתרון המתלים, קטן הבדל גובה ריחוף יהיה כל הבדל צפיפות התאים. אמנם זה מגביל את הרזולוציה, מוגדרת כיכולת להבחין בין הבדלים קטנים צפיפות התאים, זה מגדיל את טווח של צפיפויות אשר ניתן לנתחד. באופן דומה, להקטין את הריכוז של גדוליניום יגדיל את ההחלטה, אבל יפחית את הטווח של זיהוי. יתר על כן, הצפיפות של המדיום ניתן לשנות כדי להסיט את המגבלות של גילוי כלפי מעלה או כלפי מטה. הכוח השני השולטת גובה ריחוף הוא כוח עילוי, אשר תלוי הצפיפות היחסית של התא בהשוואה לזו של המדיום מתלים. הנה, פתרון המתלים על בסיס מים משמש, כלומר תאים עם צפיפות שהוא זהה לזה של לרחף הבינוני ב האמצע בין שני מגנטים עם תאים צפופים פחות או צפופים מרחפים מעל או מתחת קו האמצע, בהתאמה (עם מגוון בשליטת כוח מגנטי כפי שתואר לעיל). בגלל הכח קליל תלוי בצפיפות יחסית, הגדלת הצפיפות של המדיום יעבור בטווח של זיהוי למגוון גבוה של צפיפות תא. באופן דומה, באמצעות מדיום צפיפות נמוכה יעבור בטווח של זיהוי לעבר רכס נמוך של צפיפות התא. < / P>
אנחנו גם בחנו את הביצועים של מכשיר התמקדות מגנטי בסיוע זרימה ידי לכימות ספירת החלקיקים המנורמל לרוחב הנימים (כלומר ההסתברות של חלקיק לזרום ממרחק לרוחב הנימים). ספיקות נמוכות יותר יש יותר כליאה של חלקיקים אלא לגרום תפוקה עוצמת קול נמוכה יותר, אשר יכולה להיות חסרון לגילוי חפץ נדיר בדגימות בנפח גבוה. עם זאת, ניתן לטפל על ידי עובר מרובות בשדה המגנטי או באמצעות מגנטים יותר. הפרדה בין סוגי תאים מרובים עשויה גם להיות ממונפת במחקרים עתידיים כדי לבודד את חלקיקי צפיפויות שונות על ידי מינוף מפריד microfluidic בסוף השדה המגנטי.
כאשר הפרדת סוגי תאים מרובים, זה עשוי להיות מועיל כדי לרחף כל אוכלוסייה בנפרד כדי לקבוע את הגובה הממוצע בטווח של כל סוג תא לפני מרחף האוכלוסייה הומוגנית.
e_content "> מגבלות הטכניקההתהליך מוצג כאן מוגבל הפרדת החלקיקים של צפיפויות ברורות. על מנת להשיג זיהוי אמין של סוגי תאים מרובים, חשוב כי יש להם טווחי צפיפות דיסקרטיים שאינו חופף. יתר על כן, חלקיקים אשר ניתן לאתרם מוגבלים בגודלם. הם חייבים להיות מסוגלים לנוע בחופשיות בתוך הצינור microcapillary - 200 מיקרומטר הוא הגבול העליון המומלץ על קוטר החלקיקים. יתר על כן, חלקיקים חייבים להיות גדולים מספיק כדי להיות צלם בבירור - 5 מיקרומטר הוא המליץ על הגבול תחתון על הקוטר.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
גישה זו כדי ניתוח הסלולר היא פשוטה, המאפשרת ניתוח ידידותי למשתמש באתר. פעולות אבחון רפואיות רבות חייבות להתבצע במעבדות ניסויים קליניות ודורשות ציוד בדיקה מתמחה ונהלים מבוצעים על ידי specialis מעבדה מאומנתt. עם זאת, פרוטוקול זה דורש מכשיר פשוט אשר נגיש יותר למרפאות בריאות. הכנת המדגם היא פשוט הניתוח הוא אוטומטי, המקטין את הסיכון לטעויות משתמשים.
מכשיר זה יאפשר בדיקה מהירה, באתר עבור מגוון רחב של מצבים רפואיים. המכשיר הוא ידידותי למשתמש, ללא תווית, ונייד, מה שהופך אותו אידיאלי עבור אבחון מחלה בנקודת הטיפול. לעומת הסטנדרט הנוכחי של בדיקות מעבדה קליניות מרחוק, גישה זו תאפשר לרופאים לבצע במהירות החלטות מושכלות לגבי טיפול בחולה ואפשרות למנוע סיבוכים כתוצאה מעיכובים בטיפול. הפלטפורמה תוכננה עם מרכיבים זמינים וזולים בקלות, ומאפשר שימוש נרחב בשיטה זו במסגרות קליניות ובמדינות מתפתחות ושיפור נגישות ברחבי עולם לטיפול רפואי.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
חשוב לציין כיבדיקות שתוארו כאן אינן תקפות עדיין על אוכלוסיית חולים גדולה בקנה מידה. נכון להיום, אבחון מחלה חרמשי אושר במדגם מטופל קטן 2, 5 ו WBC cytometry הודגם בתור הוכחה של קונספט. ניסויים קליניים עם יישומים אלה ואלה פתחו בעתיד חייבות להתבצע על מנת לאמת שיטה זו לפני שימוש קליני, אבל התוצאות שהוצגו כאן מראות הבטחה לשימוש עתידי של טכנולוגית טכניקה זו לדיאגנוסטיקה רפואית נקודה של טיפול.
בגישה זו לניתוח cytometric מבוסס צפיפות עשוי בסופו של דבר יוארך ליישומי אבחון מחלה נוספים. גישה זו של ריחוף המגנטי של תאים בודדים לאבחון מחלה כפי שמתואר כאן מחייבת שימוש תא בודד השעיות של התאים של מטופל לתאים אשר ניתן הדמיה באמצעות המערכת הנוכחית עם מגבלותיו על החלטה בשל שימוששל מצלמת טלפון חכמה או אופטיקה בעלות נמוכה. יתר על כן, טכניקה זו ישימה מחלות אשר לספק אחד מהתנאים הבאים: (i) תאי העניין חייבים להשיג צפיפות שונה כאשר הם נושאים את המחלה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה, (ii) שינוי צפיפות תאים חייב להיות מושרה על ידי תוספת של ריאגנט (או כל טיפול אלטרנטיבי זמין), או (iii) האבחון חייב לערב זיהוי סוגי תאים שונים יחיד מדגם אשר גם מטבעם או באמצעות טיפול כלשהו יש צפיפויות ייחודיות. יישומים עתידיים למחלות אחרות תוך שימוש באותו מכשיר הפלטפורמה יכולים להיות השפעה עצומה על בריאות העולמית. אלה עשויים לכלול זיהוי של מרכיבים ביולוגיים, הנבדלים ביניהם צפיפות. סוגי תאים מסוימים, תאים אשר עוברים מוות של תאים, ואת תאים חולים כל הוכחו יש חתימות צפיפות ייחודיות ובכך דפוסי מגנטי מובהקים, ועל כן ניתן לכמת מופרדים באמצעות פלטפורמה זו. תאים במספרים נמוכים מאוד יכולים גם bדואר זוהה על ידי מינוף מעבר נוזלי מכשיר הריחוף המגנטי בסיוע הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gadavist (Bayer) | Jefferson Medical and Imaging | 2068062 | Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca. |
| Square glass microcapillary tubes | Vitrocom | 8270 | 50 mm length is sufficient |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | S9000 | Chemical formula: Na2S2O5 |
| Leica Microsystems Critoseal tube sealant | Fisher Scientific | 02-676-20 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Or other reagent as recommended for the cell type used |
| MICROLET 2 Adjustable Lancing Device | Walgreens | 246567 | Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols |
| Microlet Lancets | Walgreens | 667474 | Must be dispoable and not reused |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Or any preferred method for cell counting |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A1049201 |
References
- Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
- Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
- Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
- Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
- Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
- Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
- Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
- Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
- Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).
