Introduction
A continuación, presentamos una plataforma tecnológica y una técnica que utiliza la levitación magnética, junto con las imágenes y el análisis automatizado para analizar la distribución de la densidad de las células de un paciente como un indicador de la enfermedad. Este enfoque versátil para el análisis de citometría basada en la densidad en última instancia, se puede aplicar a una amplia gama de diagnóstico de enfermedades. Sin embargo, con el fin de ser compatible con las pruebas de punto de uso y cuidado en los países en desarrollo, la técnica debe satisfacer los requisitos de bajo coste, portabilidad y facilidad de uso. El dispositivo y los consumibles deben ser obtenidos fácilmente a un bajo costo. La preparación de la muestra debe ser simple, el análisis debe ser automatizado con los requisitos mínimos para la entrada del usuario o la interpretación, y los resultados deben ser devueltos rápidamente. Además, el dispositivo debe ser compacto y portátil para ser útil en la práctica clínica, así como los países en desarrollo. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo y un método para usar la levitación magnética en el punto de atención-compatibles Technolgía por análisis de imágenes y la imagen de acoplamiento automático para volver resultados con respecto a la distribución de la densidad de una población de células de un paciente.
tecnologías de punto de atención ofrecen una notable ventaja sobre los procedimientos de pruebas de laboratorio clínicos actuales. La tecnología disponible en la actualidad es demasiado caro para ser poseído por un médico o demasiado compleja para ser llevado a cabo por el personal médico. Muchos de estos procedimientos requieren mucha mano de obra protocolos que deben ser llevadas a cabo por un técnico capacitado. Por estas razones, las muestras de pacientes, tales como sangre u orina generalmente se recogen en la oficina del médico luego fue trasladado a un laboratorio remoto, centralizado prueba para los ensayos clínicos, que puede tardar varios días para que el médico para recibir los resultados de la prueba. Esto puede causar retrasos o complicaciones en el curso del tratamiento, en algunos casos, hace que esta prueba muy costoso e ineficiente (que causa una carga financiera para los pagadores de seguros), y además hace muchosdiagnóstico de difícil acceso en entornos de bajos recursos y los países en desarrollo.
A continuación, presentamos una técnica de levitación magnética, junto con las imágenes y el análisis automatizado tanto en un dispositivo con imágenes embebido y procesamiento (Figura 1) y un dispositivo compatible con teléfonos inteligentes (Figura 2). Estos dispositivos basados en levitación magnética representan una tecnología de plataforma de aplicación general que tiene el potencial de ser aplicado a una variedad de diferentes aplicaciones de diagnóstico médico. Los magnéticos funciones de aproximación de levitación en base a un equilibrio entre dos fuerzas: una fuerza magnética y una fuerza de flotación 1, 2, 3. Cuando una partícula se suspende en un medio paramagnético y se inserta en un campo magnético generado por dos imanes con polos iguales frente a la otra, un magnéticos fuerza actúa sobre la partícula en la dirección hacia la línea central entre los dos magn ets. La fuerza de flotación es causada por la densidad relativa de la partícula en comparación con el medio de suspensión y es hacia arriba en el caso de las partículas menos densas que el medio y la baja en el caso de partículas más densas que el medio circundante. Sobre la base de estas dos fuerzas, las partículas lleguen a una posición de equilibrio levitación en el campo que equilibre estas dos fuerzas; esta posición está directamente relacionada con la densidad de la partícula, con partículas más densas levitando menor en el campo que las partículas menos densas. Un módulo de imagen, ya sea una cámara incorporada teléfono inteligente 4, 5, 6 o componentes ópticos independientes equipadas con una lente de aumento 7, 8, se utiliza para visualizar las posiciones de las partículas. El procesamiento de imágenes, ya sea a través de una aplicación para teléfonos inteligentes 4, 5,= "xref"> 6 o una unidad de procesamiento incrustado 7, 8, a continuación, procesa las imágenes capturadas para cuantificar la distribución espacial y, por lo tanto, la distribución de la densidad de la población. Con el fin de analizar muestras más grandes (tales como aquellos con sólo unas pocas partículas de interés por mililitro, el flujo puede ser integrado directamente en el dispositivo, las partículas se levitan y se analizó a medida que pasan a través de la región de formación de imágenes (Figura 2).
Figura 1: Plataforma de levitación magnética autónomo. (A) Dispositivo de levitación magnética compacta que incluye un módulo magnético de enfoque, componentes de imagen (un diodo (LED emisores de luz), una lente óptica, y un detector de la cámara), y una unidad de procesamiento con una pantalla de visualización. (B) Intensidad de campo magnético en el cross-sección de la zona entre los imanes cuando se inserte la muestra. La intensidad del campo es mayor en la superficie de los imanes y se aproxima a cero en la línea central entre ellos. (C) Las partículas, tales como las células, dentro de la experiencia de campo magnético varias fuerzas: una fuerza magnética (F m) hacia la línea central entre el magnetismo, con magnitud basándose su variación en la posición de la partícula; una fuerza gravitacional (F g ') que depende de la densidad de las partículas con relación a la del medio de suspensión, y una fuerza de arrastre (F d) resistiendo el movimiento de las partículas. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. 8 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
HigoUre 2: con capacidad para un teléfono inteligente asistida por flujo Plataforma de levitación magnética. (A - c) Frontal (a), lateral (b), y la parte posterior (c) vistas del dispositivo de levitación magnética (d) Los componentes del dispositivo son: 1) módulo de levitación magnética, incluyendo los imanes permanentes, una lente de aumento, y un difusor LED y la luz, 2) de casos de teléfonos inteligentes, 3) la electrónica, incluyendo un microcontrolador, controlador de la bomba, y el receptor Bluetooth, 4) soporte de micro-bomba, 5) de orificio ajustable, 6) soporte del tubo de residuos, 7) soporte de la batería, 8 ) soporte de la muestra, 9) soporte de doble propósito y la cubierta. (E) de flujo esquemático, que muestra de bombeo de la muestra a través del campo magnético. (F) de la sección transversal del módulo de levitación magnética, que muestra cómo las partículas de diferentes densidades se alinearán a medida que se bombea a través del campo; menos densas partículas, tales como partículas 1, se equilibrarán a una mayor altura de levitación tHan partículas más densas, como las partículas 2. Reproducido, con autorización, de Amin, et al. 1 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los requisitos mínimos para el uso de cualquier muestra para el análisis de distribución de la densidad en este sistema incluyen la capacidad de obtener una suspensión de células o partículas mayores de aproximadamente 5 micras y menos de aproximadamente 250 micras de tamaño (para formación de imágenes y procesamiento de imágenes) y su compatibilidad con la mezcla en una solución de una solución paramagnético tal como el gadobutrol utilizado aquí. Para el diagnóstico de enfermedades, aplicaciones compatibles incluyen aquellos en los que (i) las células de interés inherentemente tiene una densidad alterada cuando llevan una enfermedad en comparación con los controles sanos, (ii) un cambio de densidad puede ser inducida en la célula mediante la adición de un reactivo o algún tratamiento alternativo para un cortocircuito entiempo de incubación, o (iii) diferentes tipos de células están siendo identificados en una sola muestra y inherentemente (o a través de algún tratamiento) tienen densidades características únicas.
Enfermedad de células falciformes es un trastorno genético que causa una forma mutada de la hemoglobina, HbS, a ser producido en las células rojas de la sangre de una persona (GR), que puede resultar en eventos vaso-oclusivos intermitentes y anemia hemolítica crónica 9. Se diagnostica utilizando la hemoglobina isoelectroenfoque, cromatografía líquida de alta resolución electroforesis (HPLC) fraccionamiento, o hemoglobina que son muy precisos, pero debe ser realizado en un laboratorio de análisis clínicos, ya que son incompatibles con los ajustes de punto de cuidado. Solubilidad y ensayos basados en papel para la enfermedad de células falciformes se han propuesto, pero por lo general requieren de una interpretación subjetiva del usuario y pruebas de confirmación. Aquí, nosotros usamos un enfoque basado en la densidad de identificar los hematíes falciformes, que alcanzan una densidad mayor que RBCs de personas que no tienen la enfermedad de células falciformes. El mecanismo implica la polimerización de la forma mutada de la hemoglobina, HbS, que causa RBC deshidratación en los glóbulos rojos de drepanocitosis en condiciones desoxigenadas 10, 11, 12, 13.
Este enfoque basado en la densidad también se puede aplicar para separar las células de diferentes tipos sobre la base de la densidad: Las células blancas de la sangre (WBC) y glóbulos rojos 7. Los glóbulos blancos son generalmente responsables de la lucha contra las infecciones en el cuerpo. WBC citometría se puede usar para cuantificar el número de estas células en la sangre y sirve como una herramienta de diagnóstico útil. Los recuentos de leucocitos superior a la normal (generalmente se considera superior a 11.000 células por microlitro) puede indicar infección, trastornos del sistema inmunológico, o leucemia. Los recuentos de leucocitos por debajo del rango normal (alrededor de 3.500 células por microlitro) pueden ser causados por trastornos autoinmunes o Conditiones que hueso daños ósea. A diferencia de las tecnologías alternativas, el proceso que aquí se presenta no se basa en la lisis de los glóbulos rojos o las manchas con el fin de identificar los glóbulos blancos. Esta prueba basado en células se aprovecha de las densidades inherentes únicas de los dos tipos de células para llevar a cabo la separación, como la densidad de población WBC ha informado a ser menor que la de la población RBC calculado previamente utilizando centrifugación en gradiente de densidad 2, 3.
En comparación con las pruebas de alterante en lugares remotos, esta prueba es rápida, con la preparación de muestras sencillo (Figura 3), la separación de células en el dispositivo dentro de 10 a 15 min, y de formación de imágenes y el análisis automatizado que requiere menos de 1 min. De esta manera, el dispositivo puede devolver resultados con rapidez para informar mejor las decisiones médicas, permiten que el tratamiento se administre inmediatamente para aliviar el dolor físico y psicológico, y reducir el riesgo de complicaciones associated con un retraso en la atención médica. Esta técnica se puede realizar en el sitio, ya sea en el ámbito clínico debido a la preparación sencilla de la muestra y de formación de imágenes automatizado y análisis que devuelve un resultado con intervención mínima del usuario o interpretación. Debido a la utilización de un enfoque sencillo el uso de imanes permanentes para el análisis de muestras y el uso de ya sea un teléfono inteligente o componentes eléctricos simples para formación de imágenes y procesamiento de imágenes, el dispositivo, así como los costes por la prueba son mínimos en comparación con algunos procedimientos de prueba sofisticados.
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Protocol
Declaración de ética: Todos los procedimientos que implican muestras de sangre humana se llevaron a cabo de acuerdo con los reglamentos institucionales. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional. El consentimiento informado se da por todos los participantes.
1. Preparación de muestras para la enfermedad de células falciformes Diagnóstico 5, 8
- Preparar una solución de 50 mM de gadobutrol en solución salina equilibrada de Hank (HBSS).
- Disolver metabisulfito de sodio 10 mM en la solución de gadolinio.
NOTA: El metabisulfito de sodio es tóxico por inhalación y fuertemente irrita la piel y el tejido. Es un ácido corrosivo cuando se mezcla con agua. Puede descomponerse para emitir humos tóxicos de óxido de azufre y de sodio cuando se calienta a alta temperatura. - Obtener una muestra de sangre a través de punción en el dedo, ya sea o venopunción.
- Extraer la sangre utilizando un dispositivo de punción con una lanceta desechable limpia. Appresión del suministro cerca del sitio perforado y limpie la gota de sangre formada de tres a cuatro veces antes de la recogida de sangre con una pipeta; tener cuidado de no "leche" el dedo apretando el tejido, ya que esto dará lugar a la contaminación de la muestra con el fluido tisular.
- Alternativamente, extraer la sangre utilizando procedimientos estándar de punción venosa 14.
NOTA: Si se almacenarán muestras durante más de unas pocas horas, recoger la sangre en un Vacutainer con un anticoagulante tal como EDTA.
- Añadir menos de 1 l de sangre a 100 l de la solución de metabisulfito de sodio con gadolinio.
2. Preparación de muestras para CMB Citometría 7
- Obtener una muestra de sangre mediante punción en el dedo, ya sea o venopunción, como en la sección 1.
- Opcional: Lyse glóbulos rojos con un tampón de lisis RBC. Pipetear 5 l de sangre en 500 l de tampón de lisis RBC e incubar a temperatura ambiente durante 3 - 5 min.
NOTA:esto se puede hacer para confirmar el rango de levitación de una población aislada de glóbulos blancos. Sin embargo, no es necesario realizar este paso, ya que los resultados presentados aquí demuestran que los glóbulos rojos levitar en una posición claramente inferior a los glóbulos blancos. - Se diluye la sangre completa 1: 1.000 en Di-s 25 mM en HBSS
NOTA: si se llevó a cabo la lisis celular, se diluye la muestra lisada 9: 1 muestra lisada: Gd 250 mM para obtener una muestra que contiene Gd 25 mM.
3. Análisis de las muestras utilizando la plataforma de la levitación magnética 4, 5, 6, 7, 8
- Iniciar el dispositivo de levitación magnética:
- Para el dispositivo autónomo, conecte el dispositivo, deje que se enciende, y coloque sobre una superficie plana y nivelada.
- Para la versión con capacidad para un smartphone, inicie la aplicación de teléfono inteligente y deslízate a la izquierda para entrar en la imagenmodo de captura, y el lugar en una superficie plana y nivelada.
- Para la levitación magnética estática:
- Cargar la muestra preparada en un tubo microcapilar de vidrio cuadrado por inmersión final en la solución y permitir que la muestra para llenar el capilar a través de la acción capilar.
- Sellar el extremo con un sellador de tubo empujando lentamente un extremo del capilar en el material.
- Introduce el capilar entre los imanes del dispositivo de levitación magnética de manera que sólo 1 cm del tubo permanece visible (consulte la Figura 3 para una ilustración de la preparación de la muestra).
NOTA: Este paso es el mismo tanto para el dispositivo compatible con smartphone y autónomo. - Esperar 10 min sin perturbar el dispositivo o el capilar.
- Para levitación magnética asistida por flujo:
- Cargar la muestra en el tubo de muestra.
- Conectar el tubo de entrada entre el recipiente de la muestra y microcapillary y conectar el tubo de salida entre el microcapilar y contenedor de residuos.
- Establecer los parámetros de intensidad y de flujo de LED.
- Asegúrese de que las células son visibles en el campo de visión, a continuación, pulse el botón de captura para capturar una imagen (botón 3 en el dispositivo autónomo y el botón de la cámara en la parte inferior de la pantalla en la aplicación de teléfono inteligente).
NOTA: Si se utiliza un USB para almacenar las imágenes, crear una carpeta llamada "imágenes" e inserte el USB antes de encender el dispositivo. Si no está presente la unidad, el dispositivo almacena las imágenes en su memoria interna y trasladado más tarde.
NOTA: Varias imágenes pueden ser capturados y analizados para reducir el riesgo de anomalías moviendo el capilar en o fuera alrededor de ½ cm entre la captura de imágenes.
NOTA: Si el número de células dentro del campo de visión es demasiado alta o demasiado baja (tal como se detecta e informó sobre la interfaz de usuario), desplazar el capilar en o fuera del dispositivo o preparar otro sample. - Retire la muestra y desechar la muestra de acuerdo con las regulaciones institucionales o locales. Los capilares deben desecharse como agudo.
Figura 3: Preparación de la muestra y la interfaz de usuario. (A) El procedimiento de preparación de la muestra implica la punción del dedo del sujeto, formando una gota de sangre, la transferencia de la gota de sangre a la solución de ensayo de muestras, la agitación de la muestra y de cargar en un tubo capilar a través de la acción capilar, y la inserción de la muestra en la levitación magnética dispositivo. (B) Estos pasos de preparación de muestras también se muestran en la pantalla del dispositivo para guiar la preparación de la muestra. (C) El dispositivo incluye cuatro botones: un botón para hacer zoom en la imagen de muestra con el fin de ajustar correctamente el enfoque utilizando el botón de ajuste; un botón para obtener una sola mmedición cada (a 5 s de retardo se implementa para dar tiempo a que el usuario inserte la muestra); una medición de lapso de tiempo (6 imágenes son tomadas a intervalos de 5 s); y un botón para apagar el dispositivo después de su uso. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. 8 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Análisis de Imagen 4, 5, 6, 7, 8
- Ejecutar el software de análisis de imagen incluido en el dispositivo para la muestra correspondiente (la distribución de células o la separación tipo de célula).
NOTA: Para el dispositivo autónomo, el análisis se realiza automáticamente y se visualiza en la interfaz gráfica de usuario. Para el dispositivo con capacidad para un teléfono inteligente, para realizar el análisis, ir a la galería unand seleccionar el archivo de vídeo deseado para ser analizada. - Observar y registrar la salida del análisis de visualizar en la pantalla.
NOTA: Para el análisis de la distribución de células (por ejemplo, diagnóstico de la enfermedad de células falciformes), la salida será la anchura de confinamiento de la población celular.
NOTA: Para la separación tipo de célula (tal como la identificación WBC), la salida será una imagen con la población WBC identificado. Con el fin de calcular el número de células por microlitro, multiplicar el número medio de glóbulos blancos por imagen en un factor de 2.000. Por ejemplo, si se observaron 5 glóbulos blancos, esto indicaría 10,000 WBC / l. El rango normal se considera generalmente que es de 3.500 - 11.000 glóbulos blancos / l. - Repetir el análisis moviendo el tubo de la muestra en o fuera del dispositivo alrededor de ½ cm y la captura de otra imagen para ser analizada como se describe anteriormente.
NOTA: Se recomienda repetir el análisis 5 - 6 veces por muestra para evitar errores.
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Representative Results
Para el análisis de distribución de la densidad celular, que es la técnica utilizada para el diagnóstico de la enfermedad de células falciformes, el objetivo es identificar la anchura de la distribución de la población celular. Las células sanguíneas de los pacientes sin la enfermedad de células falciformes estarán confinadas dentro de una anchura predecible. Las células de pacientes con enfermedad de células falciformes se distribuirán a lo largo de una región más amplia, con un sesgo a la baja en la distribución de células (véase la Figura 4.) Para cualquier aplicación particular, un umbral puede establecerse entre la amplitud de la distribución de muestras de control frente a la de sana muestras como punto de corte entre "sano" y "positivo a la enfermedad" 5, 8.
Figura 4: Ejemplo de levitación magnética para analizar DensitDistribución y como indicador para la enfermedad de células falciformes en muestras de sangre. A la izquierda, las células rojas de la sangre están bien confinadas dentro de una región estrecha. A la derecha, un subconjunto de células rojas de la sangre alcanza una mayor densidad y por lo tanto una altura de levitación inferior, distorsionar la distribución hacia abajo y aumentar la anchura de confinamiento. Barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para analizar la distribución de la densidad de una muestra, un algoritmo computacional se lleva a cabo dentro del dispositivo. En primer lugar, se calculan los gradientes de intensidad de píxel a lo largo de los ejes vertical y horizontal. Los bordes de imán y los bordes capilares se detectan como los picos en los perfiles de gradiente de píxeles verticales. La distancia entre los bordes interiores capilares, en píxeles, se sabe que es 0,7 mm y por lo tanto se utiliza como scaling de factor de convertir distancias de píxeles a milímetros. El gradiente de intensidad de los píxeles a lo largo del eje horizontal es mayor donde se encuentran las células. Este perfil de gradiente se analiza y se ajuste a una curva de Gauss. El valor 4 veces la desviación estándar de esta curva se informa como el ancho de confinamiento.
Resultados en la Figura 5 muestran las anchuras de confinamiento para el control y muestras de drepanocitosis. Aquí, las muestras con una mayor anchura de confinamiento (más de 50 micras) se considerarían enfermedad de células falciformes positivo y aquellos por debajo de ese umbral se consideran negativos para la enfermedad. Debe tenerse en cuenta que otros métodos de análisis de la distribución de células falciformes se han investigado y reportado por Yenilmez, et al. 8
Figura5: La cuantificación de la anchura de Confinamiento de anemia de células falciformes diagnóstico. Los resultados experimentales para el ancho de confinamiento de control (n = 48 imágenes más de 4 sujetos) y la enfermedad de células falciformes (n = 93 imágenes más de 10 sujetos) los glóbulos rojos. Los resultados son estadísticamente significativas según un test de Mann-Whitney-Wilcoxon de dos caras (aproximación normal, 1 = 3, n = 2 10, Z = -2.6764, p = 0,0074). Los bigotes representan el mínimo y anchuras máximas de confinamiento de las muestras de prueba y los asteriscos representan valores atípicos. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. 8 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para la separación de partículas, que puede ser utilizada para identificar los glóbulos blancos en muestras de sangre, el objetivo es identificar dos Población distintaciones. Si las poblaciones tienen diferentes densidades, que se observó en regiones distintas en el campo de visión. Por lo tanto, las poblaciones homogéneas de dos o más partículas con densidades distintas se pueden levitar y, en caso de separación, las múltiples poblaciones se pueden observar en la imagen y se detectaron usando el algoritmo de análisis de imagen 4 (ver Figura 6).
Para analizar la separación de dos tipos de células diferentes, un algoritmo se implementa que distingue las dos poblaciones separadas en el equilibrio. De una manera similar a la descrita para el análisis de la enfermedad de células falciformes, dos distribuciones gaussianas son aptos para la muestra, en lugar de una sola curva. Cada pico en los gradientes de intensidad de pixel representa una población de células diferentes. Las curvas gaussianas ajuste a estos datos dan tanto la altura de levitación media (en relación con la posición del imán inferior) como la media de la curva de Gauss yel confinamiento de la anchura como la desviación estándar de la curva 7.
Figura 6: Ejemplo de levitación magnética de una población mixta de micropartículas con distintas densidades. (A) Las curvas de calibración que correlacionan densidad de microesferas con la altura de levitación en cinco concentraciones diferentes de Gd que van desde 12,5 a 200 mM. La pendiente es mayor en las concentraciones más bajas de Di-s, lo que ofrece una resolución superior (es decir, la sensibilidad a las diferencias de densidad pequeñas). La pendiente es más bajo para las concentraciones más altas de Di-s, lo que demuestra el aumento de la gama de detección, pero con menor resolución. (B) la separación dependiente del tiempo de un homogéneos microesferas de muestra con dos densidades distintas a lo largo de dos minutos. En el equilibrio (derecha), dos bandas distintas son detectados por el anal imagenalgoritmo de analysis. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Con el fin de identificar los tipos de células individuales con densidades diferentes para cualquier aplicación dada, es aconsejable hacer levitar primero un tipo de célula en un momento de cuantificar la altura de levitación esperado. La figura 7a muestra la altura de levitación de glóbulos blancos de una muestra de sangre en el que han sido lisadas los glóbulos rojos. Esto define la región de confinamiento de glóbulos blancos para su posterior análisis. Los resultados indican que los glóbulos rojos levitar más bajo que los glóbulos blancos y, por lo tanto, los glóbulos blancos pueden distinguirse de las muestras de sangre en base a la posición de levitación. El volumen dentro de cualquier campo de visión es de 0,5 l. En las muestras que se diluyeron 1: 1000, el número de glóbulos blancos / l puede calcularse contandoel número de glóbulos blancos en el campo de visión y multiplicando por un factor de 2000 7.
Figura 7: CMB Citometría de sangre entera. (A) La levitación de glóbulos blancos de la sangre después de la lisis de glóbulos rojos. Esto define el intervalo en el que los glóbulos blancos levitar en el campo magnético en Di-s 25 mM. (B) Ejemplo de conteo de leucocitos (glóbulos blancos marcados por flechas azules). La incrustación marco superior muestra los glóbulos blancos y el bastidor inferior y la incrustación de marco inferior muestra la población de GR. Reproducido, con autorización, de Yenilmez, et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Los factores críticos en este proceso incluyen la alineación correcta de los imanes. Si los imanes se desplacen o se separan más de lo normal dentro del dispositivo, esto puede afectar a los resultados. Para el control de esta falla o otros en el proceso, una partícula densidad controlada, tales como microesferas de poliestireno, puede ser utilizado periódicamente para controlar los cambios en el tiempo. Además, el tiempo de levitación es importante para permitir que las células alcanzan el equilibrio. Para las células rojas de la sangre, 10 min es suficiente para permitir que todas las células para alcanzar el equilibrio. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las partículas o células más pequeñas pueden requerir un tiempo más largo para alcanzar el equilibrio. Esto puede evaluarse tomando imágenes de lapso de tiempo en un intervalo de 5 s, y el trazado de la anchura de confinamiento con el tiempo; equilibrio se puede determinar como el punto en el que el cambio en el ancho de confinamiento es insignificante.
Otros pasos críticos dentro del protocolo incluyen la preparación de la solución de gadolinio en la concentración precisa ya que esto influye en gran medida la altura de levitación muestra. Esto se puede hacer antes de tiempo y se utiliza de una solución madre, sino que debe ser sellado adecuadamente para evitar la evaporación de la solución y un aumento no deseado en la concentración. Además, se debe tener cuidado para mantener el estado de salud de las células utilizadas. Para la sangre humana dibujada a través de punción en el dedo, que debe ser usado dentro de una hora de la extracción de sangre y no se deja secar al almacenar en un recipiente hermético. Para la sangre humana dibujado por punción venosa, las muestras deben almacenarse a 4 ° C durante no más de una semana con anticoagulante (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un anticoagulante común, se utilizó aquí). Para las líneas de células adherentes, las células muertas se deben lavar a fondo de la cultura antes de la tripsinización y células deberán incubarse hasta su uso. La salud de las células en el momento de la levitación es crítica porque la salud celular se sabe que afectan a la densidad y por lo tanto la levitación height.
Modificaciones y solución de problemas
Hemos demostrado la separación y el confinamiento de las células de dos densidades diferentes en lugares predecibles en el campo magnético. Con el fin de extender esta técnica a otras aplicaciones, diferentes formulaciones del medio paramagnético se pueden utilizar para obtener un intervalo deseado de detección para aplicaciones alternativas 3. La concentración de gadolinio rige la solución de detección, así como la gama (por favor refiérase a la figura 6a). Debido a mayores concentraciones de gadolinio aumentan la resistencia de la fuerza magnética aplicada a las células, mayor es la concentración de gadolinio en la solución de suspensión, menor es la diferencia de altura de levitación será para cualquier diferencia en la densidad celular. Si bien esto limita la resolución, definida como la capacidad de distinguir entre pequeñas diferencias en la densidad celular, aumenta la gama de densidades que pueden ser analizanre. Del mismo modo, la disminución de la concentración de gadolinio aumentará la resolución, pero disminuir el rango de detección. Además, la densidad del medio puede ser alterado para cambiar los límites de detección hacia arriba o hacia abajo. La segunda fuerza que controla la altura de levitación es la fuerza de flotación, que depende de la densidad relativa de la célula en comparación con la del medio de suspensión. Aquí, se usa una solución de suspensión a base de agua, lo que significa que las células con una densidad que es la misma que la de la levitar medio en la línea central entre los dos imanes con células menos densos o más densas levitando por encima o por debajo de la línea central, respectivamente (con un rango controlado por la fuerza magnética como se ha descrito anteriormente). Debido a la fuerza de flotación depende de la densidad relativa, el aumento de la densidad del medio se desplazará el rango de detección a una mayor gama de densidades de células. Del mismo modo, el uso de un medio de densidad más baja se desplazará el rango de detección hacia un rango más bajo de las densidades de células. < / P>
También hemos investigado el rendimiento de dispositivo de enfoque magnético asistida por flujo mediante la cuantificación de la cantidad de partículas normalizado a través del ancho capilar (es decir, la probabilidad de una partícula a fluir a una distancia a través del ancho capilar). caudales más bajos tienen más confinamiento de partículas, pero dan como resultado un rendimiento menor volumen, que puede ser un inconveniente para la detección de objetos poco frecuente en muestras de gran volumen. Sin embargo, esto se puede abordar por múltiples pasadas en el campo magnético o por medio de imanes más largos. Separación entre múltiples tipos de células también puede ser aprovechada en futuros estudios para aislar las partículas de diferentes densidades mediante el aprovechamiento de un separador de microfluidos en el extremo del campo magnético.
Cuando la separación de múltiples tipos de células, puede ser útil para hacer levitar cada población individualmente con el fin de establecer la altura media y el rango de cada tipo de célula antes de levitar la población homogénea.
e_content "> limitaciones de la técnicaEl proceso que aquí se presenta se limita a la separación de las partículas de distintas densidades. Con el fin de lograr la identificación fiable de múltiples tipos de células, es importante que tengan intervalos de densidad discretos que no se solapan. Además, las partículas que pueden ser detectados son de tamaño limitado. Deben ser capaces de moverse libremente dentro del tubo capilar se - 200 micras es el límite superior recomendado en el diámetro de las partículas. Además, las partículas deben ser lo suficientemente grandes como para ser fotografiado con claridad - 5 micras es el límite inferior recomendado en el diámetro.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
Este enfoque de análisis celular es simple, que permite un análisis fácil de usar en el lugar. Muchos procedimientos de diagnóstico médico deben llevarse a cabo en los laboratorios de análisis clínicos y requieren equipos y procedimientos realizados por un laboratorio entrenado specialis pruebas especializadast. Sin embargo, este protocolo requiere un dispositivo simple que es más accesible a las clínicas de salud. La preparación de la muestra es simple y se automatiza el análisis, minimizando el riesgo de error del usuario.
Este dispositivo permitirá rápida, las pruebas en el lugar para una variedad de condiciones médicas. El dispositivo es fácil de usar, sin etiquetas, y portátil, por lo que es ideal para el diagnóstico de enfermedades en el punto de atención. En comparación con el estándar actual de las pruebas de laboratorio clínico a distancia, este enfoque permitirá a los médicos para hacer rápidamente decisiones informadas sobre el cuidado del paciente y potencialmente prevenir complicaciones debido a demoras en la atención. La plataforma ha sido diseñada con componentes de fácil acceso y de bajo costo, lo que permite el uso generalizado de este método en la práctica clínica y en desarrollo y la mejora de la accesibilidad a la asistencia sanitaria en todo el mundo.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
Es importante tener en cuenta que laensayos descritos aquí aún no se validan en una población de pacientes a gran escala. Hasta la fecha, el diagnóstico de la enfermedad de células falciformes se ha confirmado en una pequeña cohorte de pacientes 2, 5 y CMB citometría se ha demostrado como una prueba de concepto. Los ensayos clínicos con estas aplicaciones y los desarrollados en el futuro se deben realizar con el fin de validar este método antes de su uso clínico, pero los resultados que aquí se presentan son prometedoras para su posible uso de esta tecnología y la técnica para el diagnóstico clínico de punto de cuidado.
Al utilizar este enfoque para el análisis de citometría de densidad basada en última instancia, puede extenderse a aplicaciones de diagnóstico de enfermedades adicionales. Este enfoque de levitación magnética de las células individuales para el diagnóstico de enfermedades como se describe aquí requiere el uso de una sola célula suspensiones de células de un paciente y a células que se pueden obtener imágenes mediante el sistema actual con sus limitaciones en la resolución debido al usode una cámara inteligente o la óptica de bajo costo. Además, esta técnica es aplicable a las enfermedades que responden a una de las siguientes condiciones: (i) células de interés debe alcanzar una densidad alterada cuando llevan a la enfermedad en comparación con los controles sanos, (ii) un cambio de densidad celular debe ser inducible por adición de un reactivo (o cualquier tratamiento alternativo disponible), o (iii) el diagnóstico debe implicar la identificación de diferentes tipos de células en una sola muestra que o bien inherentemente o por medio de algún tratamiento tienen densidades únicas. Las futuras aplicaciones a otras enfermedades utilizando el mismo dispositivo de plataforma pueden tener un tremendo impacto en la salud mundial. Estos pueden incluir la detección de los componentes biológicos, que se distinguen por la densidad. Ciertos tipos de células, células que están experimentando la muerte celular, y las células enfermas todo se ha demostrado que tienen firmas de densidad únicas y, por tanto patrones magnéticos distintos, y por lo tanto se puede cuantificar y separada por medio de esta plataforma. Las células en números muy bajos también puede be detectado mediante el aprovechamiento de flujo de fluido en el dispositivo de levitación magnética asistida por flujo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gadavist (Bayer) | Jefferson Medical and Imaging | 2068062 | Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca. |
| Square glass microcapillary tubes | Vitrocom | 8270 | 50 mm length is sufficient |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | S9000 | Chemical formula: Na2S2O5 |
| Leica Microsystems Critoseal tube sealant | Fisher Scientific | 02-676-20 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Or other reagent as recommended for the cell type used |
| MICROLET 2 Adjustable Lancing Device | Walgreens | 246567 | Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols |
| Microlet Lancets | Walgreens | 667474 | Must be dispoable and not reused |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Or any preferred method for cell counting |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A1049201 |
References
- Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels. Nature Communications. 5, 4702 (2014).
- Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device. RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).
- Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Sickle Cell Detection Using a Smartphone. Sci Rep. 5, 15022 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), e0134400 (2015).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples . Advanced Materials Technologies. 1, 1600144 (2016).
- Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform. Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100 (2016).
- Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. GeneReviews. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
- Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics. J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).
- Joiner, C. H. Gardos pathway to sickle cell therapies? Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).
- Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers. Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).
- Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization. Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).
- Ernst, D. J. NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition. 27 (26), (2007).
