Magnetisk levitation Tillsammans med Portable Imaging och analys for Disease Diagnostics

Introduction

Här presenterar vi en teknologiplattform och en teknik som använder magnetisk levitation i kombination med automatiserad bildbehandling och analys för att analysera fördelningen av en patients celler densitet som en indikator för sjukdom. Denna mångsidiga tillvägagångssätt för densitetsbaserad cytometrisk analys kan i slutändan tillämpas på en rad diagnostik sjukdomar. Men för att vara kompatibel med point-of-care testning och användning i utvecklingsländerna, måste tekniken uppfyller kraven på låg kostnad, bärbarhet och användbarhet. Anordningen och förbrukningsvaror måste vara lätt erhållas till en låg kostnad. Vid provberedningen måste vara enkel, bör analysen automatiseras med minimala krav på användarinmatning eller tolkning och resultat ska returneras snabbt. Vidare måste apparaten vara kompakt och portabel att vara användbar i kliniska miljöer samt utvecklingsländerna. Därför har vi utvecklat en anordning och metod för att använda magnetisk levitation i point-of-care-kompatibel Technolnik genom koppling automatiserad bildbehandling och bildanalys för att visa resultatet om fördelningen av en population av en patients celler densitet.

Point-of-care teknik ger en märkbar fördel gentemot aktuella kliniska laboratorietestprocedurer. Den teknik som finns tillgänglig är för dyrt att ägas av en läkare eller för komplexa för att utföras av sjukvårdspersonal. Många av dessa förfaranden kräver arbetsintensiva protokoll som skall utföras av en utbildad tekniker. Av dessa skäl är patientprover såsom blod eller urin i allmänhet samlas i läkarens kontor överfördes sedan till en avlägsen, centraliserad testlaboratorium för klinisk testning, vilket kan ta flera dagar för läkaren att få resultatet av testet. Detta kan leda till förseningar eller komplikationer i samband med behandling i vissa fall gör denna testning mycket kostsam och ineffektiv (orsakar en ekonomisk börda för försäkrings betalare), och vidare gör mångadiagnostik otillgängliga i resurssnåla inställningar och utvecklingsländer.

Här presenterar vi en magnetisk levitation teknik i kombination med automatiserad bildbehandling och analys i både en enhet med inbyggd bildbehandling och bearbetning (figur 1) och en smartphone-kompatibel enhet (Figur 2). Dessa magnetisk levitation-baserade enheter representerar en brett tillämpbar plattformsteknologi som har potential som skall tillämpas på en rad olika medicinska diagnostiska tillämpningar. De magnetiska levitation inflygnings funktioner baserade på en jämvikt mellan två krafter: en magnetisk kraft och en flytkraft ^{1, 2, 3.} När en partikel är upphängd i en paramagnetisk medium och insatt i ett magnetfält som genereras av två magneter med lika poler vända mot varandra, en magnetisk kraft verkar på partikeln i riktningen mot centrumlinjen mellan de två magn ets. Flytkraften som orsakas av den relativa densiteten hos partikeln jämfört med suspensionsmediet och är uppåt i fallet med partiklar mindre täta än det mediet och nedåt i fallet med partiklar med högre densitet än det omgivande mediet. Baserat på dessa två krafter, kommer partiklarna når en jämvikt levitation position inom området som balanserar dessa två krafter; denna position är direkt relaterad till densiteten hos partikeln, med tätare partiklar svävar lägre inom området än mindre täta partiklar. En bildgenererande modulen, antingen en inbyggd smartphone kamera ^{4, 5, 6} eller oberoende optiska komponenter som är utrustade med en förstoringslins ^{7, 8,} används för att visualisera positionerna för partiklarna. Bildbehandling, antingen genom en smartphone ansökan ^{4, 5,}= "xref"> 6 eller en inbäddad behandlingsenhet ^{7, 8,} behandlar sedan de tagna bilderna för att kvantifiera den geografiska fördelningen och därmed fördelningen av befolkningstäthet. För att analysera större prov (såsom de med endast ett fåtal partiklar av intresse per milliliter, kan flöde integreras direkt i enheten sådana partiklarna svävande och analyseras när de passerar genom avbildningsregionen (Figur 2).

Figur 1: Sluten magnetisk levitation Platform. (A) Kompakt magnetisk levitation anordning innefattande en magnetisk fokusering modul, avbildande komponenter (en lysdiod (LED), en optisk lins, och en kamera detektor), och en behandlingsenhet med en bildskärm. (B) Magnetisk fältstyrka i cross-sektionen av området mellan magneterna där provet insatta. Fältstyrkan är som störst vid ytan av magneterna och närmar sig noll vid centrumlinjen mellan dem. (C) partiklar, såsom celler, inom de magnetfält experience flera krafter: en magnetisk kraft (F _m) mot centrumlinjen mellan de magnetics, med magnitud varierar baserat på positionen för partikeln; en gravitationskraft (F _g '), som är beroende av partikeldensiteten i förhållande till den hos suspensionsmediet, och en dragkraft (F _d) motstånd mot partikelrörelse. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁸ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fikonure 2: Smartphone-kompatibel Flow-assisterad magnetisk levitation Platform. (A - c) Fram (a), sida (b), och tillbaka (c) vyer av magnetisk levitation enhet (d) Komponenterna i enheten inkluderar: 1) Magnetisk levitation modul, inklusive permanentmagneter, förstoringsglas, och en LED och ljus diffusor, 2) smartphone fall, 3) elektronik, inklusive en mikrokontroller, pump förare, och Bluetooth-mottagare, 4) mikropumphållare, 5) justerbar öppning, 6) avfall rörhållaren, 7) batterihållaren, 8 ) provhållare, 9) dubbel funktion monter och lock. (E) Flödesschematisk, som visar pumpning av provet genom det magnetiska fältet. (F) Tvärsnitt av magnetisk levitation modulen, som visar hur partiklar av olika densiteter kommer att anpassa de pumpas genom fältet; mindre täta partiklar, såsom Particle 1, kommer i jämvikt vid en högre levitation höjden tHan tätare partiklar, såsom partikel 2. reproduceras, med tillåtelse, från Amin et al. ¹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Minimikraven för användning av prov för analys täthetsfördelningen i detta system inkluderar möjligheten att erhålla en suspension av celler eller partiklar större än ca 5 fim och mindre än cirka 250 um i storlek (för avbildning och bildbehandling) och dess förenlighet med blandning i en lösning av en paramagnetisk lösning såsom den gadobutrol användas här. För diagnostik av sjukdom, kompatibla program inkluderar de i vilka (i) celler av intresse i sig ha en förändrad täthet när de bär en sjukdom jämfört med friska kontroller, (ii) en densitet förändring kan induceras i cellen genom tillsats av ett reagens eller en del alternativ behandling för en kort icubation tid, eller (iii) olika celltyper håller på att identifieras i ett enda prov och i sig (eller via någon behandling) har unika karakteristiska densiteter.

Sicklecellsjukdom är en genetisk sjukdom som orsakar en muterad form av hemoglobin, HbS, att produceras i en persons röda blodkroppar (RBC), vilket kan resultera i intermittenta vaso-ocklusiva händelser och kronisk hemolytisk anemi ^9. Det diagnostiseras med antingen hemoglobin isoelektrisk fokusering, HPLC (HPLC) fraktionering, eller hemoglobin elektrofores som är mycket exakt, men måste utföras i ett kliniskt testlaboratorium, eftersom de är oförenliga med point-of-care inställningar. Löslighet och pappersbaserade tester för sicklecellanemi har föreslagits, men kräver i allmänhet subjektivt användar tolkning och bekräftande tester. Här använder vi en densitetsbaserad metod för att identifiera skäran RBC, som uppnår en högre densitet än RBCs från personer utan sicklecellsjukdom. Mekanismen inbegriper polymerisation av den muterade formen av hemoglobin, HbS, som orsakar RBC uttorkning hos sickle RBCs cellsjukdomen under deoxygenerade betingelser ^{10, 11, 12, 13.}

Kan också tillämpas denna densitet baserad metod för att separera celler av olika typer på grundval av densitet: vita blodkroppar (WBC) och röda blodkroppar ^7. VBK är i allmänhet ansvariga för att bekämpa infektioner i kroppen. WBC cytometry kan användas för att kvantifiera antal av dessa celler i blodet och fungerar som ett användbart diagnostiskt verktyg. WBC räknar högre än normalt (i allmänhet vara större än 11.000 celler per mikroliter) kan tyda på infektion, immun nervsystemet, eller leukemi. WBC räknar under det normala intervallet (cirka 3500 celler per mikroliter) kan orsakas av autoimmuna sjukdomar eller conditjoner som skador benmärg. Till skillnad från alternativa tekniker, gör processen presenteras här förlitar sig på lys av RBC eller fläckar i syfte att identifiera VBK. Denna cell-baserat test drar fördel av de unika inneboende densiteterna hos de två celltyper för att utföra separation, eftersom WBC-populationen densiteten har rapporterats vara lägre än den hos RBC befolkningen som tidigare beräknats med användning av densitetsgradientcentrifugering ^{2, 3.}

Jämfört med alterative testning på avlägsna platser, är detta test en snabb, med enkla provberedning (Figur 3), separation av celler i anordningen ligger inom 10 - 15 min, och automatiserad bildbehandling och analys som kräver mindre än 1 min. På detta sätt kan enheten ger resultat snabbt att bättre informera medicinska beslut, tillåta behandling ges omedelbart för att lindra fysisk och psykisk smärta, och minska risken för komplikationer Associpade med en fördröjning i sjukvården. Denna teknik kan utföras på plats, antingen i kliniska situationer på grund av enkla provberedning och automatiserad bildbehandling och analys, som ger ett resultat med minimal användarinmatning eller tolkning. På grund av användningen av en enkel metod att använda permanentmagneter för provanalys och användning av antingen en smartphone eller enkla elektriska komponenter för avbildning och bildbehandling, enheten samt per-testet kostnaderna är minimala jämfört med vissa sofistikerade testförfaranden.

Protocol

Etisk Uttalande: Alla procedurer involverande humana blodprov utfördes i enlighet med de institutionella föreskrifter. Alla protokoll granskades och godkändes av Institutional Review Board. Ett informerat samtycke gavs av alla deltagare.

1. Provberedning för sicklecellsjukdom Diagnos ^{5, 8}

1. Bered en 50 mM lösning av gadobutrol i Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
2. Lös upp 10 mM natriummetabisulfit i gadolinium lösning.
   OBS: Natriummetabisulfit är giftig vid inandning och starkt irriterar hud och vävnad. Det är en korrosiv syra när den blandas med vatten. Det kan sönderdelas till avge giftiga oxid rök av svavel och natrium vid upphettning till hög temperatur.
3. Erhålla blodprov via antingen finger eller venpunktion.
   1. Dra blod med användning av en lansettanordning med en ren, engångs lansetten. apply trycket nära borrade platsen och torka blodet droppen bildas tre till fyra gånger innan uppsamling av blod med hjälp av en pipett; se till att inte "mjölk" fingret genom att klämma vävnaden, eftersom detta kommer att resultera i kontaminering av provet med vävnadsvätska.
   2. Alternativt, dra blod med användning av standard venpunktion ^14.
      OBS: Om prover kommer att lagras i mer än några timmar, samla blodet i en Vacutainer med en antikoagulant, såsom EDTA.
4. Lägga mindre än 1 mikroliter av blod till 100 pl av gadolinium-natriummetabisulfitlösning.

2. Provberedning för WBC Cytometry ⁷

1. Erhålla blodprov via antingen finger eller venpunktion, som i avsnitt 1.
2. Tillval: Lyse RBC med en RBC lyseringsbuffert. Pipettera 5 mikroliter av blod i 500 mikroliter av lyseringsbuffert och inkubera vid rumstemperatur i 3-5 min.
   NOTERA:Detta kan göras för att bekräfta levitation utbud av en isolerad population av VBK. Det är dock inte nödvändigt att utföra detta steg, eftersom resultaten som presenteras här visar att de röda blodkropparna sväva på en klart lägre position än VBK.
3. Späd helblod 1: 1000 i 25 mM Gd i HBSS
   OBSERVERA: om cellys utfördes, späd den lyserade provet 9: 1 lyserade provet: 250 mM Gd för att erhålla ett prov innehållande 25 mM Gd.

3. Analys av prover Använda magnetisk levitation plattformen ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Starta magnetisk levitation enheten:
   1. För fristående enhet, koppla in enheten gör det möjligt att driva upp och placera på en plan yta.
   2. För smartphone-kompatibel version, starta smartphone ansökan och dra åt vänster för att öppna bildinfångningsläge, och placera på en plan yta.
2. För statisk magnetisk levitation:
   1. Ladda beredda provet i en fyrkantig glas microcapillary röret genom doppning av änden i lösningen och låta provet att fylla kapillären via kapillärverkan.
   2. Täta änden med ett rör tätningsmedel genom att långsamt trycka en ände kapillären in i materialet.
   3. Sätt kapillär mellan magneterna i magnetisk levitation anordningen så att endast en cm av röret förblir synlig (se figur 3 för en illustration av provberedning).
      OBS: Detta steg är densamma för både smartphone-kompatibla och fristående enhet.
   4. Vänta 10 minuter utan att störa enheten eller kapillär.
3. För flödes assisterad magnetisk levitation:
   1. Ladda provet i provröret.
   2. Anslut inloppsslangen mellan provbehållaren och microcapillary och anslut utloppsröret mellan microcapillary och avfallsbehållare.
   3. Ställ in LED intensitet och flödesparametrar.
4. Se till att cellerna är synliga i synfältet, tryck sedan på inspelningsknappen för att ta en bild (knapp 3 på fristående enhet och kameraknappen på undersidan av skärmen i smartphone ansökan).
   OBS: Om en USB används för att lagra bilder, skapa en mapp som heter "bilder" och sätt in USB innan du slår på enheten. Om ingen enhet är närvarande, kommer enheten att lagra bilderna i internminnet och överförs senare.
   OBS: Flera bilder kan tas och analyseras för att minska risken för avvikelser genom att flytta kapillär in eller ut om ½ cm mellan bildtagning.
   OBS: Om antalet celler i synfältet är för hög eller för låg (som upptäcks och rapporteras på användargränssnittet), flytta kapillär i eller ut ur anordningen eller förbereda en annan sample.
5. Ta bort provet och kassera provet i enlighet med de institutionella eller lokala föreskrifter. Kapillärer ska kasseras som en skarp.

Figur 3: Provberedning och användargränssnitt. (A) Förfarandet provberedning innebär lancing motivets finger, bildar en droppe blod, överföra bloddroppen till provtestlösning, omröring av provet och laddning i ett kapillärrör via kapillärverkan, och att sätta in provet i magnetisk levitation anordning. (B) Dessa provberedningsstegen också visas på skärmen på enheten för att styra provberedning. (C) Enheten innehåller fyra knappar: en knapp för att zooma in i provbild för att korrekt ställa in skärpan med inställningsratten; en knapp för att få ett enda measurement (5 fördröjning genomförs för att ge tid för användaren att sätta provet); en time-lapse mätning (6 bilder tas med 5 s intervall); och en knapp för att stänga av enheten efter användning. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁸ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Bildanalys ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Kör bildanalys programvara som finns på enheten för lämpligt prov (cellfördelning eller celltyp separation).
   OBS: För fristående enhet, är den analys som utförs automatiskt och visas på det grafiska användargränssnittet. För smartphone-kompatibel enhet för att utföra analysen, gå till galleriet ennd välja önskad videofil som ska analyseras.
2. Observera och registrera utsignalen från analysen visas på skärmen.
   NOTERA: För analys cellfördelning (såsom sicklecellsjukdom diagnos), kommer utsignalen att vara bredden på inneslutning av cellpopulationen.
   OBS: För celltyp separation (t.ex. WBC identifiering), kommer produktionen att vara en bild med WBC-populationen identifierats. För att beräkna antalet celler per mikroliter, multiplicera det genomsnittliga antalet VBK per bild med en faktor av 2000. Till exempel om 5 VBK observerades, skulle detta indikera 10.000 VBK / mikroliter. Det normala intervallet anses allmänt vara 3.500 - 11.000 VBK / mikroliter.
3. Upprepa analysen genom att flytta provrör i eller ut ur anordningen om ½ cm och fånga en annan bild som skall analyseras, såsom beskrivits ovan.
   OBS: Det rekommenderas att upprepa analysen 5 - 6 gånger per prov för att undvika fel.

Representative Results

För celldensitet fördelningsanalys, vilket är den teknik som används för sicklecellsjukdom diagnos, är syftet att identifiera bredden av fördelningen av cellpopulationen. Blodkroppar från patienter utan sicklecellanemi kommer att begränsas inom en förutsägbar bredd. Celler från patienter med sicklecellanemi kommer att distribueras under en större region, med en nedåtgående skevhet i cellfördelningen (se figur 4.) För varje särskild tillämpning, kan en tröskel ställas in mellan bredden av kontrollprover fördelning mot det friska prover som cutoff mellan "friska" och "positivt för sjukdomen" ^{5, 8.}

Figur 4: Exempel på magnetisk levitation Analysera Density Distribution som en indikator för sicklecellsjukdom i blodprov. Till vänster är röda blodkroppar väl innesluten i ett smalt område. Till höger en delmängd av röda blodkroppar uppnå en högre densitet och därmed en lägre levitation höjd, skeva fördelningen nedåt och öka bredden av instängdhet. Skalstreck = 200 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att analysera fördelningen av en provdensitet, är en beräkningsalgoritm genomförs inom enheten. Först är de pixelintensitets gradienter längs de vertikala och horisontella axlarna beräknas. Magnet kanter och de kapillära kanterna detekteras som topparna i de vertikala pixel gradient profiler. Avståndet mellan de inre kapillära kanterna, i pixlar, är känd för att vara 0,7 mm och används därför som en Scaling faktor för att omvandla avstånd från pixlar till millimeter. Pixelintensitets gradienten utmed den horisontella axeln är som störst där celler är belägna. Denna gradient profil analyseras och anpassas till en Gaussisk kurva. Värdet 4 gånger standardavvikelsen för denna kurva rapporteras som den inneslutning bredd.

Resultaten i fig 5 visar inneslutnings bredder för både kontroll och sicklecellanemi prover. Här skulle prover med en större inneslutning bredd (över 50 pm) anses sicklecellanemi positiv och de under denna tröskel skulle anses vara negativa för sjukdomen. Det bör noteras att andra metoder för analys av sicklecell-fördelningen har undersökts och rapporterats av Yenilmez, et al. ⁸

Figur5: Kvantifiering av inneslutningen bredd för sicklecellanemi diagnos. Experimentella resultat inneslutning bredd av kontroll (n = 48 bilder över 4 patienter) och sicklecellanemi (n = 93 bilder över 10 försökspersoner) röda blodkroppar. Resultaten är statistiskt säkerställd enligt en Mann-Whitney-Wilcoxon dubbelsidig test (normal approximation, n ₁ = 3, n ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). De whiskers representerar lägsta och högsta inneslutningsbredder från prover och asterisker representerar extremvärden. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁸ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För partikelseparation, som kan användas för att identifiera VBK i blodprov, är syftet att identifiera två olika populheten. Om populationerna har olika densiteter, kommer de observeras i distinkta regioner i synfältet. Således kan homogena populationer av två eller flera partiklar med distinkta densiteter svävande och vid separation kan observeras flera populationer i bilden och detekteras med hjälp av bildanalysalgoritmen ⁴ (se figur 6).

För att analysera separationen av två olika celltyper, är en algoritm implementeras som särskiljer de två separerade populationer vid jämvikt. På ett liknande sätt som det som beskrivits för sickle analys cellsjukdom, två gaussiska distributioner är lämpliga till provet, snarare än en enda kurva. Varje topp i pixelintensitets lutningar representerar en annan cellpopulation. De gausskurvorna passar till dessa data att ge både den genomsnittliga levitation höjd (i förhållande till läget av botten magnet) som medelvärdet av den gaussiska kurvan ochinneslutningen bredd som standardavvikelsen av kurvan ^7.

Figur 6: Exempel på magnetisk levitation av en blandad population av mikropartiklar med Distinkta densiteter. (A) Kalibreringskurvor korrelerar mikrosfärdensitet med levitation höjd i fem olika Gd-koncentrationer som sträcker sig från 12,5 till 200 mm. Lutningen är störst vid de lägsta koncentrationerna av Gd, vilket ger en högre upplösning (dvs. känslighet för små densitetsskillnader). Lutningen är lägst för högre koncentrationer av Gd, som visar ökat utbud av upptäckt men med lägre upplösning. (B) Tidsberoende separation av ett homogent prov mikrosfärer med två distinkta densiteter under loppet av två minuter. Vid jämvikt (till höger) är två distinkta band detekteras av bild anallys algoritm. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁷ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att identifiera enskilda celltyper med olika densiteter för en given tillämpning, är det lämpligt att först sväva en celltyp i taget för att kvantifiera förväntade levitation höjd. Figur 7a visar levitation höjden av WBCs från ett blodprov i vilken de röda blodkropparna har lyserats. Detta definierar regionen inneslutning av VBK för vidare analys. Resultaten tyder på att RBCs levitera lägre än WBCs och således kan VBK särskiljas från blodprover baserade på levitation position. Volymen inuti varje givet synfält är 0,5 mikroliter. I prover som späddes 1: 1000, antalet VBK / mikroliter kan beräknas genom att räknaantalet VBK i synfältet och multiplicera med en faktor av 2000 ^7.

Figur 7: WBC Cytometry i helblod. (A) Levitation av VBK från blodet efter RBC lys. Detta definierar det område där VBK sväva i magnetfältet i 25 mM Gd. (B) Exempel på WBC räkning (VBK markerade med blå pilar). Toppramen inlay visar WBCs och bottenramen och bottenramen infällning visar RBC befolkningen. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁷ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Kritiska faktorer i denna process inkluderar den korrekt inriktning av magneterna. Om magneterna lossna eller separerade mer än normalt i anordningen, kan detta påverka resultaten. För att kontrollera för detta fel eller andra i processen, en densitet kontrollerad partikel, såsom polystyren-mikrosfärer, kan användas periodiskt för att kontrollera för förändringar över tiden. Vidare är levitation tid viktigt att tillåta cellerna att nå jämvikt. För röda blodkroppar, är 10 min är tillräcklig för att tillåta alla celler för att nå jämvikt. Det är emellertid viktigt att notera att mindre partiklar eller celler kan kräva längre tid för att nå jämvikt. Detta kan bedömas genom att ta tid förfaller bilder med en 5 s intervall och rita begränsnings bredd över tiden; jämvikt kan bestämmas som den punkt vid vilken förändringen i inneslutning bredd är försumbar.

Andra kritiska steg inom protokollet inkluderar preSeparation av gadolinium lösning på den exakta koncentrationen eftersom detta i hög grad påverkar prov levitation höjd. Detta kan göras i förväg och användas från en förrådslösning, men måste tätas ordentligt för att undvika avdunstning av lösningen och en oavsiktlig ökning av koncentrationen. Vidare måste försiktighet iakttas för att upprätthålla hälsotillståndet hos de celler som används. För human blod dras via fingerstick, bör det användas inom en timme efter blodprovstagning och inte fick torka genom lagring i en sluten behållare. För human blod dras genom venpunktion, bör proverna förvaras vid 4 ° C under inte mer än en vecka med antikoaguleringsmedel (etylendiamintetraättiksyra (EDTA), ett vanligt antikoaguleringsmedel, användes här). För vidhäftande cellinjer, bör döda celler tvättas noggrant från odlingen före trypsinering och celler bör inkuberas fram till användning. Hälsan hos cellerna vid tidpunkten för levitation är kritisk, eftersom cellernas hälsotillstånd är känt för att påverka densiteten och därför levitation Height.

Ändringar och felsökning
Vi har demonstrerat separationen och inneslutning av celler av två olika densiteter vid förutsägbara platser i det magnetiska fältet. För att utvidga denna teknik till andra program, kan olika formuleringar av den paramagnetiska medel användas för att erhålla ett önskat område av detektion för alternativa tillämpningar ^3. Koncentrationen av gadolinium styr upplösningen för detektion, samt även intervallet (se fig 6a). Eftersom större koncentrationer av gadolinium öka styrkan hos det magnetiska kraft som appliceras till cellerna, desto större koncentration av gadolinium i den suspenderande lösningen, desto mindre blir skillnaden i levitation höjd kommer att vara för någon skillnad i celldensiteten. Även om detta begränsar upplösningen, definierad som förmågan att skilja mellan små skillnader i celltäthet, det ökar området av densiteter som kan analyserad. På samma sätt kommer minskning av koncentrationen av gadolinium öka upplösningen men minskar området av detektion. Vidare kan densiteten hos mediet ändras för att skifta detektionsgränser uppåt eller nedåt. Den andra kraften, som styr levitation höjden är den flytkraft, som beror på den relativa densiteten hos cellen jämfört med den för den suspenderingsmedium. Här, är en vattenbaserad suspenderande lösningen som används, vilket innebär att celler med en täthet som är densamma som den för den medellevitate vid mittlinjen mellan de två magneter med mindre täta eller tätare celler sväva ovanför eller under centrumlinjen, respektive (med ett intervall som styrs av magnetkraft, såsom beskrivits tidigare). Eftersom upptryck är beroende av relativ densitet, att öka densiteten av mediet kommer att förskjuta intervallet detekteringen till ett högre område av celltätheter. På samma sätt kommer att använda en lägre densitet mediet skifta intervallet detektions mot en lägre intervallet av celldensiteter. < / P>

Vi har även undersökt utförandet av flödesassisterade magnetiska fokuseringsanordning genom att kvantifiera den normaliserade partikelantalet över kapillären bredden (dvs. sannolikheten för att en partikel att flyta på ett avstånd över kapillären bredd). Lägre flödeshastigheter har mer inneslutning av partiklar men resulterar i en lägre volym genomströmning, vilket kan vara en nackdel för sällsynt objektdetektering i stora volymer prover. Detta kan dock lösas genom flera passager i magnetfältet eller via längre magneter. Separation mellan flera celltyper kan också tas tillvara i framtida studier för att isolera de partiklar med olika densiteter genom att utnyttja ett mikrofluid separator vid slutet av det magnetiska fältet.

När separera flera celltyper, kan det vara bra att sväva varje population individuellt för att fastställa den genomsnittliga höjden och utbudet av varje celltyp före svävande den homogena populationen.

e_content "> Begränsningar av tekniken
Processen som presenteras här är begränsad till separation av partiklar i distinkta densiteter. I syfte att uppnå tillförlitlig identifiering av flera celltyper, är det viktigt att de har diskreta densitetsintervall som inte överlappar. Vidare är de partiklar som kan detekteras begränsad storlek. De måste kunna röra sig fritt inom microcapillary röret - 200 um är den rekommenderade övre gränsen för partikeldiametern. Vidare måste partiklarna vara tillräckligt stora för att kunna avbildas tydligt - 5 ^ m är det rekommenderade undre gränsen på diametern.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Denna syn på cellulär analys är enkel, så användarvänliga analys på plats. Många medicinska diagnostiska procedurer måste utföras i kliniska testlaboratorier och kräver specialiserad testutrustning och förfaranden som utförs av en utbildad laboratorie specialist. Detta kräver dock protokoll en enkel anordning som är mer tillgängliga för vårdcentraler. Provberedningen är enkel och analysen är automatiserad, vilket minimerar risken för användarfel.

Denna anordning kommer att möjliggöra snabb, på plats-testning för en rad olika medicinska tillstånd. Enheten är användarvänligt, etikett-fri och portabel, vilket gör den idealisk för diagnostik point-of-care sjukdom. Jämfört med den nuvarande standarden av fjärr kliniska laboratorietester, kommer denna metod gör det möjligt för läkare att snabbt fatta välgrundade beslut om vård och eventuellt förhindra komplikationer på grund av förseningar i vården. Plattformen har utformats med lättillgängliga och billiga komponenter, vilket gör att en utbredd användning av denna metod i kliniska miljöer och utvecklingsländer och förbättra hela världen tillgång till hälso- och sjukvård.

Framtida tillämpningar eller riktningar efter Mastering denna teknik
Det är viktigt att notera atttester som beskrivs här är ännu inte godkänts för en storskalig patientgrupp. Hittills har sicklecellanemi diagnos bekräftats i en liten patientgruppen ^{2, 5} och WBC cytometri har visats som en proof of concept. Kliniska prövningar med dessa program och de utvecklas i framtiden måste utföras för att validera denna metod före klinisk användning, men de resultat som presenteras här visar lovande för eventuell användning av denna teknik och teknik för point-of-care klinisk diagnostik.

Genom att använda denna metod för densitetsbaserad cytometrisk analys kan slutligen utökas till ytterligare sjukdom diagnostiska tillämpningar. Detta tillvägagångssätt av magnetisk levitation av enskilda celler för sjukdomsdiagnostik som beskrivs här kräver användning av encelliga suspensioner av en patients celler och celler som kan avbildas med det nuvarande systemet med sina begränsningar på upplösning på grund av användningav en smartphone kamera eller låga optik. Vidare är denna teknik tillämpas på sjukdomar som uppfyller ett av följande villkor: (i) cellerna av intresse måste uppnå en förändrad täthet när de bär sjukdomen jämfört med friska kontroller, (ii) en celldensitet förändring måste vara inducerbar genom tillsats av ett reagens (eller alla tillgängliga alternativ behandling), eller (iii) den diagnostiska måste innebära att identifiera olika celltyper i ett enda prov som antingen i sig eller via någon behandling har unika densiteter. Framtida tillämpningar till andra sjukdomar som använder samma plattform anordningen kan ha en enorm inverkan på den globala hälsan. Dessa kan innefatta detektering av biologiska komponenter, som kännetecknas av densitet. Vissa celltyper, celler som genomgår celldöd och sjuka celler har alla visat sig ha unika densitet signaturer och därmed skilda magnetiska mönster, och kan därför kvantifieras och separeras med hjälp av denna plattform. Celler i mycket lågt antal kan också be detekteras genom att utnyttja vätskeflöde i flödesassisterade magnetisk levitation enhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201