Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulerende T-cellen (Tregs) onderdrukken andere immuuncellen en zijn kritische mediatoren van perifere tolerantie voorkomen autoimmuniteit en overmatige ontsteking 1. Het belang van Tregs wordt geïllustreerd door de menselijke ziekte immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathie X-gebonden syndroom (IPEX), waarbij verlies van Tregs door mutaties in het `master' Treg transcriptiefactor forkhead box P3 (FOXP3) leidt tot ernstige systemische auto-immuunziekte, dodelijke op jonge leeftijd. Echter, Tregs fungeren als een tweesnijdend zwaard in het immuunsysteem als ze ook kunnen belemmeren anti-tumor immuniteit in bepaalde instellingen 2. Therapeutische manipulatie van Treg aantal en de functie is dan ook om tal van klinisch onderzoek onderworpen. Bij kanker kunnen depletie van Tregs gewenst zijn en enig succes van klinische benaderingen bevordert verder onderzoek 3. In auto-immuun- en ontstekingsziekten, in aanvulling op therapeutische werking van Tregs in several muis ziektemodellen, recent als eerste in-man proeven van adoptieve Treg overdracht te voorkomen graft versus -host ziekte (GvHD) 4-7 en de veiligheid in de behandeling van type 1 diabetes 8 beoordelen toonde veelbelovende resultaten.

Natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) omvatten-thymus afgeleide tTregs en perifeer veroorzaakte pTregs, met niet-redundante essentiële functies voor het behoud van de gezondheid van 9-11. Echter, nTreg aantallen zijn beperkt, het stimuleren van de complementaire aanpak van het induceren van Tregs (iTregs) in vitro van naïeve T-cel voorlopers 12. Still stabiliteit van iTregs, waarschijnlijk door een gebrek aan demethylering in de zogenoemde Treg-gedemethyleerde specifieke regio (TSDR) in FOXP3 gen locus 13, een punt van zorg en verschillende studies geven aan dat in vivo geïnduceerde Tregs stabieler 14.

Tot op heden, FOXP3 blijft de beste eiwit mArker voor Tregs, maar het is niet absoluut specifiek omdat conventionele menselijke CD4 + CD25 T-cellen die tijdelijk gemiddeld niveau van expressie FOXP3 bij activering 15,16. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van de regulering van FOXP3 meningsuiting, nog veel te ontdekken met betrekking tot de inductie, de stabiliteit en de functie van FOXP3 name in menselijke cellen. Ondanks verschillen nTregs in vitro geïnduceerde FOXP3 + CD4 + T-cellen kunnen worden gebruikt als een modelsysteem voor de moleculaire mechanismen van FOXP3 inductie bestuderen en als uitgangspunt voor protocollen in de toekomst die het mogelijk maken voor het genereren van iTregs die meer lijken op in zijn ontwikkeling vivo gegenereerd Tregs, die van toepassing zijn voor adoptieve overdracht strategieën in de toekomst zou kunnen zijn.

Noch `goud standard' protocol menselijke iTregs induceren en huidige protocollen werden ontwikkeld volgens nabootsen Treg-inducerende omstandigheden in vivo: interleukine 2 (IL-2) En transformerende groeifactor β (TGF-β) signalering cruciaal voor FOXP3 inductie in vivo 17, en all-trans retinoïnezuur (ATRA) - die in vivo wordt geproduceerd door de darm geassocieerde dendritische cellen - wordt vaak gebruikt om FOXP3 inductie verbeteren in vitro 18-21. We hebben extra personeel Treg-inducerende protocollen gebruikt butyraat 22, een darmflora afkomstige korte keten vetzuur dat recentelijk werd aangetoond dat murine Treg inductie 23,24 vergroten ontwikkeld. We hebben ook onlangs een nieuw protocol voor het genereren van iTregs met superieure onderdrukkende functie in vitro met behulp van een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine 22, waarbij de laatste een klinisch goedgekeurd zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmer) waarvan bekend is dat te bevorderen FOXP3 onderhoud tijdens de menselijke Treg expansie 25,26.

Deze methode beschrijft de reproduceerbaarvitro genereren van humane CD4 + FOXP3 + iTregs met een aantal verschillende omstandigheden, en de latere fenotypering van flowcytometrie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) protocol-specifieke expressiepatronen van FOXP3 en andere Treg handtekening moleculen openbaren zoals CD25, CTLA-4, EOS, en onderdrukking van IFN-γ en SATB1 expressie 22. De gegenereerde celpopulaties kan worden gebruikt voor functionele bepalingen inzake onderdrukkende activiteit of voor moleculaire studies, ofwel betreffende algemene FOXP3 regulators of effecten specifiek voor bepaalde verbindingen zoals butyraat of rapamycine bestuderen. Verder inzicht in de moleculaire mechanismen die Treg differentiatie is zeer relevant voor toekomstige therapeutische benaderingen in auto-immuniteit of kanker om specifiek te richten moleculen betrokken bij Treg generatie en functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) werden vers geïsoleerd uit geanonimiseerde gezonde donor buffy coats gekocht van de Karolinska University Hospital, Zweden. Ethische vergunning voor de experimenten werd verkregen van de Regionale Ethische Review Board in Stockholm (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Zweden (erkenningsnummer: 2013 / 1458-31 / 1).

1. T Cell Isolatie uit perifeer bloed

  1. PBMC Isolation
    1. Pre-lay 15 ml dichtheid centrifugeren medium (zoals Ficoll) oplossing in 50 ml buizen (5 tubes per buffy coat). Voorverwarmen tot kamertemperatuur.
    2. Vullen buffy coat met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (kamertemperatuur) tot 180 ml. Als vers bloed wordt gebruikt, verdund bloed met een gelijk volume PBS.
    3. Tilt buis naar de kant en langzaam overlay dichtheid centrifugeren medium met ~ 35 ml verdund bloed per buis. Voeg het bloed zeer voorzichtig, zonder vermenging van de dichtheid centrifugatie medium fase en bloed laag.
    4. Centrifugeer 20 min bij 1150 xg bij kamertemperatuur zonder rem. Bedien de centrifuge zonder rem en zo mogelijk met een lage tot gemiddelde versnelling voor het mengen van de lagen te voorkomen.
    5. Haal de witte ring die PBMCs tussen de dichtheid centrifugeren medium en de plasma-fase. Transfer naar een nieuwe 50 ml buis (1 keer met 5 ml pipet en 2 keer met 2 ml kunststof-Pasteur pipet). Neem zo min mogelijk plasma en dichtheidscentrifugatie medium. Laat de rode erytrocyten pellet niet aanraken.
    6. Wash PBMCs. Splits de PBMCs in 50 ml buisjes (4 buizen per buffy coat). Vul elk 50 ml met PBS.
    7. Centrifuge 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder en gooi supernatant, zwembad de cellen in 1 tube met 10 ml RPMI / 10% foetaal kalfsserum (FCS), medium en goed mengen. Als cel klonten aanwezig zijn, stam cellen door een 40 um cel zeef.
    9. Transfer cellen in T175 celkweek kolf voor adherent cellen. Spoel buizen met 40 ml medium en combineer met cellen (50 ml totaal). Indien nodig, verwijder dan een portie voor flowcytometrie-analyse (zie stap 1.4). Gewoonlijk CD4 + T-cellen bevatten ongeveer 30-40% van de cellen in de lymfocyt gate en naïeve T cellen omvatten ongeveer 30 tot 60% van CD4 + T-cellen afhankelijk van de donor.
    10. Incubeer cellen tot kolf gedurende 45 tot 90 minuten bij 37 ° C / 5% CO2. Deze stap zal monocyten uitputten door plastic therapietrouw. Het is niet verplicht, maar zal het percentage T cel opbrengst per hoeveelheid van PBMCs in de volgende stappen te verhogen.
    11. Resuspendeer cellen (in 50 ml medium in de kolf) en spoel cellaag op de bodem van de kolf zorgvuldig. Verdeel cellen eveneens in twee 50 ml buisjes (de vorige buizen kunnen worden hergebruikt voor dezelfde donor). Spoel kolf met 50 ml vers RPMI / 10% FCS medium, en breng even in dezelfde 2 buizen.
      LET OP: PBMCs kan 's nachts worden bewaard bij 4 ° C met buizen tot opde zijkant of idealiter direct gebruikt voor T cel isolatie.
  2. nTreg Isolation door magnetische-geactiveerde Cell Sorting
    1. Bereid isolatie buffer: 0,5% (w / v) humaan serum albumine en 2 mM EDTA in PBS. Altijd buffer bij 4 ° C. Als alternatief voor humaan albumine, runderalbumine gebruiken.
    2. Resuspendeer en tel PBMCs met een automatische of handmatige celgetalmeter in de aanwezigheid van trypan blauw (tellen niet mee kleine plaatjes). Als cel klonten worden waargenomen, stam cellen door een 40 um cel zeef.
    3. Centrifugeer PBMC bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    4. Resuspendeer cellen (met 1 ml pipet) in 90 pl isolatiebuffer per 10 7 PBMCs een enkele celsuspensie te verkrijgen. Houd cellen in de oorspronkelijke 50 ml buizen (2 tubes per buffy coat).
    5. Voeg 2 ul CD25 parels per 10 7 cellen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    6. Vul met PBS tot 30 ml. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 46; C.
    7. Bereid LS kolommen (2 per buffy coat): in evenwicht met 3 ml isolatie buffer, en gooi doorstromen. Buizen kunnen worden hergebruikt voor verdere kolommen spoelen.
    8. Resuspendeer cellen in 3 ml isolatiebuffer per buis (met 1 ml pipet). Overdracht cellen kolom LS, en laat stroom door in verse 15 ml buizen.
    9. Spoel de 50 ml buizen met 2 ml isolatiebuffer elk. Overdracht spoelbuffer de kolommen.
    10. Waskolom met 2 x 3 ml isolatiebuffer elk. Wacht altijd tot de kolom gestopt druipen, voor het toevoegen van nieuwe vloeistof. WINKEL stromen door bij 4 ° C voor latere stappen.
    11. Kolom verwijderen uit magneet. Elueer 2x met 3 ml isolatie buffer per kolom in 15 ml buis.
      Opmerking: Het eluaat van 2 kolommen per donor te combineren. Laat de kolom niet onderdompelen in de vloeistof.
    12. Bereid en evenwicht nieuwe LS kolommen (1 kolom per buffy coat). Breng het eluaat van 1.2.11 aan de kolom. Doorstroom kan worden weggegooid. Na eluaat heeft passed door de kolom, spoel buis en waskolom met 3 x 3 ml isolatiebuffer.
      LET OP: De tweede kolom is cruciaal nodig om de zuiverheid te verhogen.
    13. Kolom verwijderen uit magneet. Elueer CD25 ++ "nTregs" 2x met 3 ml isolatie buffer.
    14. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant volledig.
    15. Was de cellen met 15 ml T celkweekmedium, centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant volledig.
    16. Resuspendeer cellen in 0,5 ml T celkweekmedium aangevuld met 100 IU / ml IL-2, elk. Overdracht cellen om 24-well plaat. Spoelen buis met 0,5 ml medium (+ 100 IE / ml IL-2) en te combineren in 24-wells plaat.
    17. Count nTregs (als in stap 1.2.2). De opbrengst is meestal ongeveer 1-4 x 10 6 Tregs per buffy coat. Pas dichtheid van Tregs 1-2 x 10 6 cellen / ml met T celkweekmedium + 100 IE / ml IL-2.
    18. Incubeer Tregs bij 37 ° C / 5% CO 2 tot gebruik.
    Naïeve CD4 + T-cellen Isolatie van magnetische-geactiveerde celsortering
    LET OP: Neem stromen door vanaf stap 1.2.8-1.2.10 om verder te gaan met een mobiele isolement. Als alternatief, als er geen nTregs geïsoleerd werden, gaat rechtstreeks uit PBMCs.
    1. Combineer 2 tubes per donateur van Treg-verarmd PBMC in 50 ml buis. Vul met PBS tot 50 ml bij kamertemperatuur.
    2. Centrifugeer PBMC bij 200 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder en gooi supernatant. Resuspendeer cellen in 50 ml PBS.
    3. Herhaal stap 1.3.2 tweemaal.
      OPMERKING: De PBS wast zijn cruciaal voor het verwijderen van bloedplaatjes, die niet worden verwijderd met de volgende negatieve isolatiekit. Bloedplaatjes blijven in de supernatant bij deze lage-snelheid centrifugatie. Bloedplaatjes uitputting kan worden gecontroleerd in de afzonderlijke stappen op een microscopisch dia. De stappen worden uitgevoerd met PBS en centrifugeren bij kamertemperatuur.
    4. PBMC resuspendeer in 50 ml PBS. Tellen cellen als in stap 1.2.2.
    5. Centrifugeer PBMC bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 40 ui Isolation buffer (4 ° C) per 10 7 cellen.
    6. Voeg 10 ul van naïeve CD4 + T-cel biotine-Antibody Cocktail II per 10 7 cellen.
    7. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    8. Was de cellen door toevoeging van 40 ml PBS (4 ° C) en centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 80 ul isolatie buffer per 10 7 cellen.
    9. Voeg 20 ul van anti-biotine microbolletjes per 10 7 cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    10. Vul aan tot 50 ml met koude PBS en centrifugeer 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    11. Bereid LS kolom (in evenwicht met 3 ml isolatie buffer). Om kolom overbelasting te voorkomen, gebruikt u een kolom voor maximaal 250 x 10 6 PBMCs, of minder als PBMCs bevatten veel rode bloedcellen.
    12. Verwijder supernatant en resuspendeer cells in 3 ml isolatiebuffer. Overdracht cellen LS kolom. Verzamelen stroom door, waarbij de naïeve CD4 + T-cellen bevat, in 15 ml buizen.
    13. Spoel buis met 2 ml isolatiebuffer. Over te dragen aan de kolom.
    14. Waskolom met 3 x 3 ml isolatiebuffer. Wacht altijd tot de kolom stopt druipen, voor het toevoegen van nieuwe vloeistof.
    15. Neem de doorstroom (naïeve CD4 + T-cellen) en centrifugeer 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Kolommen kunnen worden weggegooid.
    16. Verwijder supernatant volledig. Was de cellen met 15 ml medium, centrifuge 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur geroerd en volledig verwijderen supernatant.
      OPMERKING: Isolatie buffer EDTA, waarin calciumionen cheleert en belemmert bijgevolg T-celactivering. Voordat een stimulatie assays, verwijder de isolatie buffer volledig en was cellen tweemaal met 15 ml medium.
    17. Resuspendeer cellen in T cel kweekmedium 2-3 x 10 6 cellen per ml. Rest cellen in geschikte kolf or ruim nacht in de incubator. Als cellen direct worden gebruikt voor de stimulatie assays, nog een keer met medium was ze.
  3. Purity Controle kleuring
    1. Neem ~ 50.000 cellen (Tnaïve; nTreg; PBMCs) per stuk, in 20 pl.
      LET OP: Als zowel Tnaïve en nTreg panel worden gekleurd, neem 2 monsters per stuk.
    2. Bereid 2x geconcentreerde premix antilichaam (in PBS) afhankelijk van het instrument, bijvoorbeeld: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Voor Treg panel, vervang CD45RO-PE met CD25-PE, 01:10.
      OPMERKING: Alleen bepaalde CD25 antilichamen die verschillende epitopen dan de CD25-microkorrels herkennen, kunnen worden gebruikt om nTregs geïsoleerd met CD25 microkralen vlekken.
    3. Voeg 20 ul antilichaam premix 20 pi cellen. Ook bereiden enkele kleuringen voor elke fluorochroom (met behulp van een monster dat positieve cellen, bijvoorbeeld PBMCs) en een ongekleurde monster, voor flowcytometrie settings en compensatie.
    4. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    5. Vul elk monster met 200 pi PBS en centrifugeer 450 xg gedurende 5-10 min.
    6. Neem cellen fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) buffer (= isolatiebuffer zonder EDTA) en geanalyseerd door flowcytometrie. De zuiverheid van naïeve CD4 + T-cellen is gewoonlijk> 95% (zie figuur 2).

2. Treg Inductie Cultuur

  1. Voorbereiding van de Stimulatie Media en Plates
    1. Bereiden en voorverwarmen T celcultuurmedium: serumvrij hematopoietische medium aangevuld met 2 mM L-alanyl-L-glutamine.
    2. Bereid cytokine, stimulatie antilichaam en samengestelde voorraad concentraties.
      1. Bereid IL-2 stock oplossing: 400.000 IU / ml in steriel gefiltreerd (met zuurbestendig filter) 100 mM azijnzuur (167 ug / ml als activiteit van de gebruikte kavel is 2.400 IE per 1 ug; bevestig met de provider). Aliquot gesteriliseerde lage eiwitbinding 0,5 ml buizen afdichting met Parafilm, invriezen op droog ijs en bewaar bij -80 ° C voor langdurige opslag of -20 ° C maximaal 3 maanden.
      2. Bereid TGF-β1 voorraad-oplossing (10 ug flacon, carrier-vrij): Centrifuge TGF-β1 poeder (1000 xg 3 min), voeg 100 ul van 4 mM HCl (steriel gefiltreerd met zuurbestendig filter) om de balans op te bereiden met 100 ug / ml, volledig laten lossen; vortex. Aliquot 5 pi elk gesteriliseerd lage eiwitbinding 0,5 ml buizen afdichting met Parafilm, invriezen op droog ijs en bewaar bij -80 ° C maximaal 6 maanden.
      3. Bereid ATRA voorraadoplossing: Los poeder bij 20 mg / ml (66,6 mM) in DMSO. Bereid voorraadoplossing van 10 mM door verdere verdunning in DMSO en bewaar monsters, beschermd tegen licht, bij -80 ° C tot 1 jaar. ATRA is gevoelig voor licht, warmte en lucht.
      4. Bereid rapamycine voorraadoplossing: 1 mg / ml (1,11 mM) in DMSO, opslag in hoeveelheden bij -80 ° Ctot 1 jaar.
      5. Bereid natriumbutyraat voorraad oplossing: 0,908 M (0,1 mg / ml) voorraad in steriele ultra-pure H 2 O en steriel filter. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    3. Bereid 4x geconcentreerde voormengsels (50 gl per putje) in T-cel kweekmedium zoals in tabel 1.
    4. Op de vorige dag, laag platen met anti-CD3 antilichaam. Coat gewenste aantal putten uit 96 U-well plaat met 5 ug / ml anti-CD3 antilichaam in PBS, 65 ul / putje. Wikkel plaat met folie en incubeer overnacht bij 4 ° C.
      LET OP: Gebruik niet de marge putjes van platen met 96 putjes. Grotere putten worden gebruikt, maar U-vormige putjes vergemakkelijken gebruik van hetzelfde aantal cellen per gebied in experimenten. Als er meer cellen nodig, bundelen de vereiste hoeveelheid putjes na het kweken. Gewoonlijk na 4-6 dagen groei, 2 wells per monster voldoende voor flowcytometrieanalyse en RNA analyse.
      1. Op de dag van plating, kort voor plating, verwijdert anti-CD3 Oplossing uit putten. Vul putjes met 200 ui / putje PBS. Verwijderen PBS. Herhaal wassen met 200 ul / putje PBS. Verwijder PBS volledig en onmiddellijk te gebruiken platen.
    5. Bereid platen (gebruik geen marge putten):
      1. Voor elk putje, voeg 50 ul van 4x anti-CD28 / IL-2 voormengsel (behalve "gestimuleerde" cellen, voeg T celcultuurmedium), 50 ui 4x TGF-β1 premix (voor iTregs) of 50 gl T celkweek medium voor 'slechts stimulatie "mock control, 50 ui 4x ATRA, ATRA / rapamycine of butyraat premix (indien van toepassing) of middelgrote
      2. Vul alle lege putten, met inbegrip van de marge putten, met 200 pi PBS. Voorverwarmen platen bij 37 ° C / 5% CO2.
  2. Bereid naïeve T-cellen voor Plating
    1. Na rustende cellen, over te dragen aan 15 ml tube, spoel kolf / putten met voorverwarmd T cel kweekmedium en het zwembad aan de buis. Vulbuis tot 15 ml met T celkweekmedium. </ Li>
    2. Centrifugeer cellen bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder medium en nemen cellen in verse, voorverwarmde T celkweekmedium tot een dichtheid van 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Aantal cellen volgens stap 1.2.2 en pas dichtheid indien nodig.
    4. cellen toe te voegen aan bereid stimulatie platen (zie 2.1), 50 pl cellen / putje (110,000-130,000 cellen / putje). Elk putje zou bevatten nu een totaal volume van 200 pl.
    5. Wikkel platen in aluminiumfolie om ATRA bescherming tegen licht; incuberen bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende gewenste tijdsperioden.
  3. Monitor Treg Inductie Cultuur
    1. Monitor Treg culturen door het licht microscopie (40x vergroting). Ongeveer dag 2-3 zullen kleine clusters van prolifererende cellen zichtbaar, die worden samengevoegd tot grotere clusters op latere tijdstippen worden. Culturen opgegroeid met rapamycine groeien over het algemeen minder. Zie ook figuur 3.
    2. Op gewenste tijdstippen, monsters te nemen voor RNA-extraction of flowcytometrie fenotypering (zie hieronder). Voor latere tijdstippen met celproliferatie, 1 goed elke voldoende is, anders neem 1 x 10 5 -1 x 10 6 cellen elk voor RNA en 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellen voor flowcytometrie.
  4. Het beoordelen van FOXP3 Stabiliteit
    1. Voor de stabiliteitscontrole van de iTreg fenotype als eerder beschreven 22,27, wast tweemaal met iTregs T celkweekmedium en cultuur iTregs verder T cel kweekmedium ofwel zonder of met anti-CD3 en anti-CD28 opnieuw stimuleren zoals beschreven in 2,1 en 2,2 . cytokines toevoegen, zoals 50 IU / ml IL-2, om hun invloed op FOXP3 stabiliteitsonderzoek.
    2. Op gewenste tijdstippen monsters voor RNA-extractie, flowcytometrie fenotypering (zie hieronder) en TSDR methylatie als beschreven 22,28.

3. Fenotypische analyse van iTregs door qRT-PCR

  1. Voorbereiding vansamples
    1. Op gewenste tijdstippen, neem 1 x 05-01 oktober x 10 6 cellen per monster voor RNA-extractie. Overdracht cellen aan een RNase-vrij 1,5 ml buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten.
    2. Indien nodig, verwijderen van supernatant en bevriezen enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) of een soortgelijke analyse. Volledig verwijderen resterende supernatant van cellen. Verrichten meteen RNA extractie of bevriezen celpellet op droog ijs en bewaar bij -20 ° C tot -80 ° C gedurende maximaal 2 weken.
    3. Extract RNA en uitvoeren qRT-PCR voor FOXP3 en een huishoud-gen (zoals RPL13A) volgens standaardprotocollen. Daarnaast meten expressie van andere Treg handtekening genen (bijvoorbeeld `Treg up' genen IL2RA, CTLA4, IKZF4 en` Treg down' genen IFNG, SATB1).

4. fenotypische analyse door flowcytometrie

LET OP: Dit protocol is geoptimaliseerd voor staining in 96U well plaat formaat met 3 x 10 5 -1 x 10 6 cellen. Als er minder cellen per putje, beginnen met een aantal putten en pool zoals hieronder beschreven.

  1. Cel opnieuw stimuleren (optioneel)
    1. Indien kleuring voor intracellulaire cytokinen gewenst, pulse cellen met Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) / Ionomycine in aanwezigheid van een remmer van proteïne.
      Opmerking: Dit is niet van invloed FOXP3 expressie hierboven beschreven iTreg culturen, maar andere merkers kunnen veranderen - bijvoorbeeld wordt CD4 neerwaarts gereguleerd.
    2. Bereid 10x Brefeldine A / PMA / Ionomycin premix (20 ul per putje) in T-cel kweekmedium: Brefeldine Een voorraad oplossing 1: 100, Ionomycin (stock 5 ug / ul) 1: 1300, PMA (stock 12.35 ug / ul, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 van de pre-verdunde voorraad.
    3. 4 uur voor vlekken, voeg 20 ul Brefeldine A / PMA / Ionomycin 10x mix per putje tot het einde concentraties van 1 te verkrijgen: 1000 Brefeldine A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomycine, 10 ng / ml PMA.
    4. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C / 5% CO 2
  2. oppervlak kleuring
    LET OP: Het paneel hier voorgesteld, is een suggestie; andere panelen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de antigenen van interesse en instrument setup.
    1. Cool PBS op ijs. Bereid FACS buffer (PBS met 0,5% humaan serumalbumine, HSA) en koel op ijs. BSA of FBS kan worden gebruikt als alternatief voor HSA.
    2. Re-plaat cellen in kleuring plaat: Resuspendeer cellen met een pipet en overdracht van de cellen in een nieuw 96U well plaat, het verlaten van een goed vrij rond elk putje (om spillover in latere kleuring procedure te voorkomen). Als er minder dan gewenste cel getallen aanwezig zijn in de originele waterput, haalt een deel van de bovenstaande vloeistof vóór resuspensie en zwembad meerdere putten in een kleuring ook.
    3. Centrifugeer plaat 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant. Giet supernatant in de afvalbak, laat de plaat op zijn kopnaar beneden en onmiddellijk (zonder terug te draaien de plaat) tikt de plaat eenmaal op absorberend papier. Dan zet meteen weer de plaat. Vortex plaat om de cellen opnieuw in suspensie in de resterende vloeistof.
    5. Voeg 25 ul oppervlak vlekken premix (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 in FACS buffer) en resuspendeer.
      OPMERKING: Neem ook één kleuringen voor elk van de gebruikte fluorochromen met monsters die positieve cellen voor de respectievelijke antigeen; en beschikken over een ongekleurde monster. Deze zijn nodig voor het instrument compensatie setup. U kunt ook gebruik maken van compensatie kralen.
    6. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    7. Voeg 200 ul PBS, centrifugeren plaat 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    8. Herhaal stap 4.2.7 tweemaal.
  3. levensvatbaarheid kleuring
    LET OP: De levensvatbaarheid kleuring is onmisbaar, want na fixatie / permeabilisatie dode cellen kan niet voldoende worden uitgeslotenfsc / ssc en kunnen aanleiding geven tot niet-specifieke signalen. Een vastzetbaar levensvatbaarheid kleurstof worden gebruikt.
    1. Resuspendeer cellen in 130 ul levensvatbaarheid vlek premix (opgelapt levensvatbaarheid dye-eFlour780 1: 1400 in PBS) en onmiddellijk resuspendeer cellen met de multichannel pipet.
      OPMERKING: Neem ook een kleuring voor levensvatbaarheid kleurstof bevattende dode cellen, bijvoorbeeld niet-gestimuleerde T-cellen gekweekt gedurende verscheidene dagen of cellen te doden door warmte zoals de instructies van de fabrikant. Deze zullen nodig zijn voor een vergoeding.
    2. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    3. Centrifugeer plaat bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    4. Vul met 200 ul FACS buffer. Herhaal stap 4.3.3.
    5. Vul met 200 ul PBS. Herhaal stap 4.3.3.
  4. Intracellulaire kleuring met FOXP3 kleuring Buffer Set
    1. Voor elk putje, voor te bereiden: 150 ul Fix / Perm buffer (verdunnen Fix / Perm concentrate 1: 4 met verdunner); 850 ul 1x permeabilisatie buffer (verdunnen 10x permeabilisatie buffer 01:10 met ultra-pure H 2 O).
    2. Na het vortexen, resuspendeer cellen in 150 ul Fix / Perm buffer en onmiddellijk mengen met pipet. Het is belangrijk om direct mengen fixatie van celklompjes voorkomen.
      Let op: Fixatie buffer bevat paraformaldehyde en moeten worden behandeld en op de juiste wijze weggegooid.
    3. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker.
    4. Voeg 100 ul koud PBS. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
      Opmerking: Van deze stap verder de centrifugeersnelheid verhoogd tot celverlies voorkomen. Na fixatie cellen onzichtbaar en voorzichtigheid is geboden bij supernatanten verwijderd zoals beschreven in 4.2.4 stap en onmiddellijk na het centrifugeren wordt afgewerkt celverlies minimaliseren.
    5. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
      LET OP: De kleuring kan worden gepauzeerd bij deze stap; indit geval was de cellen tweemaal met 200 gl PBS; neem vervolgens in 250 pl PBS en opgeslagen bij 4 ° C, beschermd tegen licht. De cellen kunnen worden bewaard gedurende enkele dagen, vervolgens verder met permeabilisatie. Echter optimale resultaten bereikt wanneer direct verder permeabilisatie.
    6. Na het vortexen, voeg 200 ul permeabilisatie buffer. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    7. Voeg 200 ul permeabilisatie buffer te mengen.
      LET OP: Hier kunnen samples worden opgesplitst in intracellulaire kleuring en isotype controle monster (weg te nemen de helft van elk monster). Als cel aantallen beperken, kan een samengevoegde isotype monster worden voorbereid (weg te nemen 10-20 ul van elk monster en het zwembad). Ook kunnen monsters worden genomen voor Fluorescentie-Minus-One (FMO) controles.
    8. Centrifugeer bij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant zoals beschreven in stap 4.2.4. Vortex plaat.
    9. Resuspendeer pellet in44 gl Permeabilisatie buffer plus 1 pl normaal muizenserum (voorgemengd) om onspecifieke binding te blokkeren.
      Opmerking: Dit geldt als antilichamen die in de volgende stap zijn murine isotype. Indien andere antilichamen, zoals verkregen uit ratten, worden gebruikt, de passende serum voor het blokkeren (bijvoorbeeld rat serum).
    10. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten in het donker.
    11. antilichamen toe te voegen:
      OPMERKING: Informeer het antilichaam concentraties voor de specifieke Lots. Indien niet in stap 4.2 met antilichamen tegen oppervlakteantigenen (bijvoorbeeld CD4) met de respectieve fluorochromen gedaan, ook één kleuringen voor elk van de gebruikte fluorochromen met monsters die positieve cellen voor compensatie bevatten.
      1. Voeg 15 ul antilichaam premix om monsters (met uitzondering van enkele kleuringen, onbevlekt monsters, isotype controle monsters en FMO controles): Mengvoeder per monster: 0,7 pl (0,35 pg) anti-Interferon gamma (IFN-γ) FITC (indien van toepassing na opnieuw stimuleren )2,3 pl (0,115 ug) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pl (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 gl PBS.
      2. Met controlemonsters isotype, voeg 15 ul isotype antilichaam premix, met dezelfde hoeveelheden antilichaam als de antilichamen die in 4.4.11.1: Premix per monster: 0,7 pl (0,35 ug) muis IgG1 K isotype controle FITC (indien van toepassing), 0,58 pl (0,115 ug) muizen IgG2a-isotype BV421, 0,5 pl (0,05 ug) muis IgG1 isotype controle APC K, 13,2 gl PBS.
      3. FMO controles antilichamen toevoegen in 4.4.11.1, vervangt één antilichaam elk met PBS.
    12. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
    13. Voeg 200 ul permeabilisatie buffer. Centrifuge, verwijder supernatant en vortex als in stap 4.4.8. Herhaal dit een keer.
    14. Resuspendeer cellen in koude FACS-buffer (volume afhankelijk van het gebruikte instrument) en verwerven, idealiter onmiddellijk op de flowcytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een schema van de experimentele opstelling. Figuur 2 toont een representatief zuiverheid- kleuring voor magnetisch geïsoleerde naïeve CD4 + T-cellen en nTregs.

F IGUUR 3A toont de flowcytometrie gating strategie en Figuur 3B toont representatieve FOXP3 en CD25 flowcytometrie kleuringen op dag 6 van de cultuur onder de aangegeven iTreg of de controle omstandigheden. Na in vitro stimulatie, de meeste cellen upregulate CD25, dat werd gereduceerd in de aanwezigheid van rapamycine. Alleen onder toevoeging van iTreg-inducerende factoren, een duidelijke populatie van FOXP3 + cellen blijkt, dat ook binnen de CD25 + cellen is verrijkt onder iTreg omstandigheden. Figuur 3C toont de fenotypische verschijning van iTreg culturen in de microscoop met prolifererende cellen gezien als donkere clusters. elke i Treg voorwaarde toont een specifiek en reproduceerbaar patroon van celproliferatie: Onder deze kweekomstandigheden, TGF-β verhoogt proliferatie lichtjes, en ATRA verhoogt de verdere verspreiding. Tegelijkertijd, de remming van proliferatie door rapamycine blijkt door de sterk verminderde clustergrootte. De microscopische verschijning van proliferatie kracht komt ook overeen met de totale celtellingen (gegevens niet inbegrepen).

Figuur 4 toont representatieve resultaten van qRT-PCR analyses van FOXP3 mRNA inductie bij iTreg (en controle) kweken op verschillende tijdstippen. Wat FOXP3 eiwit, FOXP3 mRNA expressie hoger in alle iTregs vergelijking met gestimuleerde cellen te controleren, met rapamycine behandelde iTregs met relatief lage niveaus in vergelijking met andere iTregs. FOXP3 mRNA in nTregs hoger dan in iTregs.

es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Figuur 1: Experimentele regeling voor iTreg inductie, nTreg isolement en Treg analyse. Humane naïeve CD4 + T-cellen werden geïsoleerd uit buffy coats en gestimuleerd in serumvrij medium met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen plus 100 U / ml IL-2 tot 6 dagen, hetzij in afwezigheid ( `mock controlecellen ) of aanwezigheid van verschillende Treg-inducerende factoren ( `iTreg') zoals aangegeven. nTregs worden geïsoleerd en getest in parallel. Fenotypische analyse kan door stroomcytometrie en qRT-PCR. Aangepast van Schmidt, A. et al. 2016 22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Cel zuiverheid starten populaties. Naïve menselijk CD 4 + T-cellen werden geïsoleerd door naïeve CD4 T Cell Isolation Kit II, humaan. Bovenpaneel: Naïeve CD4 + T-cel zuiverheid op basis van CD4 CD45RA en CD45RO, was 94-98% en de zuiverheid van een representatieve donor van meer dan 30 wordt getoond ( `Tnaïve'). Ex vivo Tregs ( `nTreg') werden geïsoleerd door beperkte hoeveelheden CD25 microkralen en gebruikt als een positieve controle voor iTreg experimenten. nTreg zuiverheid van een representatieve donor op basis van CD25 en CD4, weergegeven. Onderste paneel: Intracellulaire kleuring FOXP3 (uitgevoerd zoals in figuur 3 en pre-gated op levende CD4 + cellen) wordt getoond naïeve CD4 + T-cellen en nTregs respectievelijk, waarbij cellen van dezelfde donor als van de bovenkant. Aangepast van Schmidt, A. et al. 2016 22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 3
Figuur 3: Fenotypische verschijning van iTregs en nTregs. Humane naïeve CD4 + T-cellen werden gekweekt in serumvrij medium onder de aangegeven omstandigheden. T-cellen werden gestimuleerd met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen plus 100 U / ml IL-2 ( `Stim.'). Waar aangegeven, TGF-β1 ( `TGF'), rapamycine (` Rapa'), all-trans retinoïnezuur ( `ATRA') of butyraat werden toegevoegd. nTregs (ex vivo geïsoleerde perifeer bloed CD25 ++ cellen) werden niet gestimuleerd ( `unstim.') en gebruikt als positieve controle. Ongestimuleerde naïeve T cellen werden gebruikt als negatieve controle. (A) Op dag 6 van de kweek werden cellen gekleurd met oppervlakte antilichamen waaronder anti-CD25 en anti-CD4, vervolgens gekleurd met fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof en vervolgens vast / permeabel en intracellulair gekleurd met anti-FOXP3 en anti-CTLA-4 of isotype cont rol antilichamen. Acquisitie en compensatie werd uitgevoerd op een cyaan ADP flowcytometer en de gegevens werden geanalyseerd met de FlowJo software. De gating strategie wordt aangegeven door de rode pijlen en het getoonde voorbeeld is een iTreg monster geïnduceerd met TGF + ATRA. (B) Cellen werden gekleurd zoals in (A) en FOXP3 en CD25 expressie in controle T-cellen en iTregs geïnduceerd door verschillende protocollen weergegeven. De pseudocolor plots tonen representatieve FOXP3 en CD25 kleuringen één donor, pre-gated on singlet, leef CD4 + cellen als in (A). De isotype voorbeeld wordt getoond voor een iTreg (stim. + TGF + ATRA) monster. (C) Representatieve microscopiebeelden (40x vergroting) van individuele 96U-putjes cellen gekweekt gedurende 4 dagen. Donkere clusters van cellen zijn prolifererende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 4
Figuur 4: FOXP3 mRNA expressie na gebruik van verschillende protocollen voor iTreg differentiatie. iTregs werden gegenereerd zoals in figuur 3 onder de vermelde omstandigheden, en op de aangegeven tijdstippen werden monsters genomen en cel RNA werd geëxtraheerd. Ongestimuleerde naïeve T-cellen en ongestimuleerde nTregs werden bemonsterd op dag 0. De monsters werden geanalyseerd met qRT-PCR en FOXP3 mRNA expressie werd genormaliseerd naar RPL13A uitdrukking voor elk monster. FOXP3 mRNA expressie in niet-gestimuleerde naïeve T-cellen werd ingesteld op 1, en voudige verandering van mRNA FOXP3 berekend. Getoond worden gemiddelde waarden reeks PCR herhalingsputjes een representatieve donor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven protocol kan de robuuste inductie van menselijke CD4 + FOXP3 + iTregs van naïeve humane CD4 + T-cellen. Het omvat een nieuw protocol dat we onlangs beschreven met een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine, voor inductie van iTregs met superieure in vitro onderdrukkende functie 22. In vergelijking met andere gepubliceerde protocollen ander voordeel is de inductie van verschillende iTreg populaties parallel door verschillende protocollen, die de directe vergelijking van de effecten van bepaalde iTreg-inducerende factoren maakt, samen met controlecellen die worden geactiveerd in aanwezigheid van IL-2 alleen . De beschreven protocols mogelijk maken reproduceerbare inductie van FOXP3 met lage donor variatie. Naïeve CD4 + T-cellen in dit protocol worden geïsoleerd door magnetisch geactiveerde celsortering, maar fluorescentie-geactiveerde celsortering is ook mogelijk. De verwachte opbrengst van naïeve CD4 + T-cellen met dit protocol is typisch tussen 5-10%, maar sterk afhankelijk van de donor (leeftijd) en lijkt ook lager bij hoge fracties van erytrocyten aanwezig zijn. Als een schatting nodig is, kan PBMCs worden gekleurd (zie stap 1.4) tijdens de monocyte depletie stap. Typisch is de opbrengst van naïeve CD4 + T-cellen is ongeveer de helft van de "percentage naïeve CD4 + T-cellen van de lymfocyt gate" in de PBMC vlek. Dit protocol maakt gebruik van beperkte hoeveelheden CD25 kralen om CD25-high (nTreg) cellen 29 te verkrijgen. Dit zijn echter niet zuiver Tregs, maar dit zijn slechts verrijkt in Tregs worden gebruikt als positieve controle. Als pure Tregs nodig zijn, moeten andere kits worden gebruikt (bijvoorbeeld in combinatie met CD4 verrijking en CD127-depletie) of als alternatief, CD25 + cellen pre-verrijkt met 8 ul CD25 korrels per 10 7 cellen en gekleurd en naargelang hun fluorescentie-geactiveerde cel sorteren met strenge CD4 + CD25 ++ gating. Ook mogelijk andere markers, zoals CD127 uitsluiting, worden overwogen.

_content "> Het is belangrijk om te overwegen dat FOXP3 is noodzakelijk, maar niet voldoende om Treg identiteit 30 verlenen. Terwijl iTregs kan worden gebruikt om bepaalde aspecten van bijvoorbeeld studie, FOXP3 regelgeving, is het echter van belang op te merken dat iTregs afwijken van nTregs in verschillende aspecten. daarom is het essentieel cultuur nTregs (bij voorkeur afgeleid van dezelfde donor) parallel aan iTregs in alle assays voor vergelijking. het verschil tussen nTregs en iTregs wordt toegelicht met slechts gedeeltelijke overlap van de nTreg en iTreg transcriptoom gemeten in murine iTregs 31. Andere Treg handtekening genen naast FOXP3 moet worden gemeten om deze reden, en discriminatie van activatie geïnduceerde FOXP3 expressie in humane cellen te waarborgen. Zo zou iTregs hogere expressie van CD25 in, CTLA-4 en EOS vergeleken aan geactiveerde T-cellen, terwijl de expressie van IFN-γ en SATB1 weinig nTregs en iTregs geïnduceerd door de hier beschreven protocollen moeten worden, zoals eerder bekendgemaakt 13. Ook op een genoom-brede schaal, werd beschreven dat epigenetische patronen van DNA-methylatie en histon modificaties in muizen iTregs niet de patronen gevonden in nTregs 30 weerspiegelen. We hebben eerder beschreven dat iTregs geïnduceerd door de hier beschreven protocollen, anders dan nTregs heeft TSDR demethylering vertonen. Dienovereenkomstig iTregs FOXP3 verloren wanneer opnieuw gestimuleerd, maar handhaafde FOXP3 uitdrukking wanneer verder gekweekt in aanwezigheid van IL-2 en 22 zonder herstimulatie. Interessant is iTregs veroorzaakt door een alternatief protocol met behulp van M2 macrofaag supernatanten weergegeven verbeterde FOXP3 stabiliteit, ondanks het gebrek aan TSDR demethylering en TGF-β zijn oorzakelijke voor FOXP3 inductie 27.

Wijziging van iTreginducerende protocollen door toevoeging van verbindingen (zoals vitamine C of waterstofsulfide) die invloed Tien elf Translocatie (TET) methylcytosine dioxygenase enzymen, zoals beschreven onlangs 32-34's kan stabiliseren FOXP3 door het beïnvloeden van DNA-methylatie. Ook de stimulatie sterkte en timing beïnvloedt FOXP3 expressie en stabiliteit 35. In deze zin het gebruik van kralen gekoppelde CD3 / CD28 antilichamen in plaats van plaatgebonden antilichamen werd aangetoond dat murine iTreg in vivo onderdrukkende functie en stabiliteit te verhogen zij onafhankelijk van TSDR demethylering 36. Een andere factor die moet als een mogelijke bron van variatie te hebben is het gebruik van serum dat undefined factoren, waaronder TGF-β die zelfs van runderen bron 100% kruisreactief met menselijke cellen bevat. Ook kan de bron en de activiteit van IL-2 aanzienlijk beïnvloeden de resultaten van FOXP3 inductie.

Een belangrijke feature van Tregs is hun onderdrukkende vermogen, dat moet vervolgens worden getest met iTregs gegenereerd in dit protocol. Opgemerkt zij dat onderdrukking assays met iTregs zijn niet triviaal en literatuur onderdrukkende vermogen van iTregs is controversieel. 41 met in vitro proliferatie assays gebaseerd op flowcytometrie uitlezingen zoals verdunning van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) is de meest gebruikte - verschillende methoden en protocollen onderdrukkende functie van menselijke Tregs elders gepubliceerd 22,37 beoordelen. Het is belangrijk te wassen en rusten iTregs Voor gebruik in assays onderdrukking, en het moet worden aangenomen dat iTregs, anders dan nTregs kan niet anergisch maar prolifereren zich gedurende onderdrukking assays. Wij vinden het zeer belangrijk voor gebruik 'mock' gestimuleerde T-cellen als controle suppressor cellen aan de mate van niet-specifieke suppressie (bijvoorbeeld door CTLA-4 expressie identificeren, IL-2 consumption en cultuur overgroei door geactiveerde T-cellen), die geen verband houdt met FOXP3 + Treg-specifieke effecten, en het veelvuldig ontbreken van deze controle kan bijdragen aan een aantal controverses in de literatuur. Met behulp van deze controle, we bepaald dat alleen TGF-β / ATRA / Rapa-geïnduceerde iTregs weergegeven onderdrukkende activiteit in vitro 22. Derhalve concluderen wij dat betrekking onderdrukkende activiteit (zij het niet grootste percentage FOXP3 + cellen), TGF-β / ATRA / Rapa is de beste combinatie van elementen van de beschreven protocollen iTregs induceren. Toch hoeft onderdrukkende activiteit in vitro niet noodzakelijk overeen met onderdrukkende activiteit in vivo, en inderdaad we vastgesteld dat de menselijke iTregs gegenereerd door deze protocollen niet onderdrukken in een xenogene graft versus -host ziektemodel althans onder de geteste 22 omstandigheden. Dit kan verband houden met instabiele FOXP3 expressie die verloren in iTregs bij restimulatie, in overeenstemming met een gebrek aan TSDR demethylering 22

Afhankelijk van welk aspect van iTreg eigenschappen (hoge fractie FOXP3 + cellen, superieure onderdrukkende activiteit FOXP3 stabiliteit) is het belangrijkste voor een bepaalde vraagstelling, kunnen andere protocollen geschikt om deze vragen te bestuderen, waardoor het moeilijk de algemeen beste omschrijven 'protocol voor Treg inductie. Verder kunnen verschillende bovenbeschreven subtiele verschillen experimentele resultaten beïnvloeden en kunnen bijdragen tot controverses opzichte van fenotype en onderdrukkende werking van TGF-β-geïnduceerde iTregs die verschijnen tussen rapporten zelfs schijnbaar soortgelijke protocollen voor iTreg generatie 42. Bijvoorbeeld, zelfs binnen één laboratorium namen wij waar dat iTregs geïnduceerd met TGF-β en IL-2 in serum bevattend RPMI medium weergegeven enkele onderdrukkende activiteit vergeleken met controle cellen 27, terwijl TGF-β / IL-2 geïnduceerde iTregs gegenereerd gedefinieerd, serumvrij T celkweekmedium niet 22, despite een vergelijkbaar niveau van FOXP3.

Toekomstige toepassingen op basis van deze protocollen moeten streven naar Treg inductie voorwaarden verder te optimaliseren tot een fenotype met stabiele FOXP3 meningsuiting, TSDR demethylering, stabiele fenotype bereiken zonder conversie naar cytokine producerende effector-T-cellen en een optimale onderdrukkende activiteit. Verdere ontwikkeling van iTreg inductieprotocollen kan nuttig zijn voor adoptieve overdracht zal in de toekomst, waarbij de therapie door Treg overdracht veelbelovend voor de potentiële behandeling van auto-immuun- en ontstekingsziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

Immunologie regulatoire T cellen Treg CD4 + T-cellen magnetische celisolatie, cytokines FOXP3 TGF-β IL-2 intracellulaire Flowcytometrie qRT-PCR
<em>In vitro</em> differentiatie van humane CD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup> geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 <sup>+</sup> T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter