Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + תאי T רגולטוריים (Tregs) לדכא תאי חיסון אחרים והם מתווכים קריטיים של סובלנות היקפית, אוטואימוניות במניעת 1 דלקת מופרזת. חשיבותה של Tregs מודגמת על ידי enteropathy האדם המחלה immunodysregulation polyendocrinopathy תסמונת ה- X-צמודות (אייפקס), שבו אובדן Tregs עקב מוטציות בשנות ה P3 תיבת forkhead גורם שעתוק Treg master' (FOXP3) מוביל למחלות אוטואימוניות מערכתי חמור, קטלן בגיל צעיר. עם זאת, Tregs לפעול כחרב פיפיות במערכת החיסונית: הם גם יכולים להפריע חסינות אנטי סרטנית במסגרות מסוימות 2. מניפולציה טיפולית של מספר ותפקוד Treg לפיכך כפופה חקירות קליניות רבות. בשנת סרטן, דלדול של Tregs יכול להיות רצוי והצלחה חלק גישות קליניות מעודדת מחקר נוסף 3. במחלות אוטואימוניות ודלקתיות, בנוסף השפעות טיפוליות של Tregs ב seveמודלי עכבר מחל RAL, ניסויים-האדם ראשונים האחרונים של העברת מאמצת Treg למנוע graft- מול מחל -host (GvHD) 4 - 7 ועל מנת להעריך את בטיחות בטיפול בסוכרת סוג 1 8 הראו תוצאות מבטיחות מאוד.

בטבע הופעת Tregs (nTregs) מהווה tTregs נגזרות הרתי ואת שולה מושרה pTregs, עם פונקציות חיוניות לא יתירים בשמירה על בריאות 9 - 11. עם זאת, מספרי nTreg מוגבלים, עידוד הגישה המשלימה של Tregs התרמה (iTregs) במבחנה מן מבשרי תא T נאיביים 12. עדיין יציבות iTregs, ככל הנראה בשל חוסר demethylation באזור demethylated שנקרא Treg הספציפי (TSDR) ב לוקוס גן FOXP3 13, נותרת חשש וכמה מחקרים מצביעים על כך in vivo מושרה Tregs יציבים יותר 14.

נכון להיום, FOXP3 נשאר מ 'החלבון הטוב ביותרarker עבור Tregs אבל זה לא ספציפי לחלוטין כי תאי CD4 + T CD25- קונבנציונאלי אדם זמני מבטאים רמות ביניים של FOXP3 באקטיבציה 15,16. למרות התקדמות משמעותית נעשתה הבהרת בקרת הביטוי FOXP3, הרבה נשאר להתגלות לגבי אינדוקציה, יציבות ותפקוד של FOXP3 במיוחד בתאים אנושיים. למרות ההבדלים כדי nTregs, במבחנה המושרה FOXP3 + CD4 + T תאים יכול לשמש כמערכת מודל ללמוד המנגנונים המולקולריים של אינדוקציה FOXP3 ו כנקודת המוצא לפיתוח פרוטוקולים בעתיד המאפשרים דור iTregs כי הם דומים יותר ב vivo שנוצר Tregs, אשר יכול להיות רלוונטי עבור אסטרטגיות העברת מאמצת בעתיד.

יש `אין פרוטוקול הזהב standard' לגרום iTregs אדם, ופרוטוקולים נוכחיים פותחו בהתבסס על מחק תנאי Treg וישכנע in vivo: אינטרלוקין 2 (IL-2) והאיתות גורם הגדילה הפיכת β (TGF-β) הם קריטיים לזירוז FOXP3 in vivo 17, וכל-טרנס החומצה הרטינואית (ATRA) - אשר מופק in vivo על ידי תאים דנדריטים הקשורים במעיים - משמש לעתים קרובות כדי לשפר אינדוקציה FOXP3 במבחנה 18 - 21. פתחנו פרוטוקולי Treg וישכנעו אדם נוספים באמצעות בוטיראט 22, בטן חיידקים נגזרת חומצת שומן קצרה שרשרת אשר הוצגה לאחרונה להגדיל בעכברי Treg אינדוקציה 23,24. אנחנו גם קימה לאחרונה פרוטוקול חדש עבור דור של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנה באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו Rapamycin 22, האחרון הוא יעד יונק אשר קליני של rapamycin (mTOR) מעכב כי ידוע כדי לקדם תחזוקת FOXP3 במהלך התרחבות אדם Treg 25,26.

שיטה זו מתארת את לשחזורדור במבחנה של CD4 אדם + FOXP3 + iTregs באמצעות סדרה של תנאים שונים, phenotyping הבא שלהם על ידי cytometry זרימת תגובת שרשרת פולימראז השעתוק כמוני הפוך (qRT-PCR) לחשוף את דפוסי פרוטוקול ספציפי ביטוי של FOXP3 ומולקולות חתימת Treg אחרים כגון כמו CD25, CTLA-4, EOS, כמו גם הדיכוי של-γ IFN ו- SATB1 הביטוי 22. אוכלוסיות התאים שנוצרו יכולות לשמש מבחנים תפקודיים לגבי פעילות מדכאת או עבור מחקרים מולקולריים, בין אם בנוגע רגולטורי FOXP3 כלליים או ללמוד השפעות ספציפיות תרכובות מסוימות כגון בוטיראט או rapamycin. הבנה נוספת של מנגנונים מולקולריים נהיגת בידול Treg רלוונטית ביותר עבור גישות טיפוליות עתידיות אוטואימוניות או סרטן למקד מולקולות מעורבות במיוחד בדור Treg ותפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תאי דם היקפיים mononuclear האדם (PBMCs) היו מבודדים טרי מ מעילים באפי מתורם בריא ואנונימי שנקנו החולים האוניברסיטאי קרולינסקה שבשבדיה. היתר אתי עבור הניסויים התקבל המועצה לביקורת האתית האזורית בשטוקהולם (Regionala etikprövningsnämnden אני שטוקהולם), שוודיה (מספר אישור: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. בידוד תא T מ דם היקפי

  1. בידוד PBMC
    1. צפיפות צנטריפוגה טרום שכב 15 מ"ל בינוני (כגון Ficoll) פתרון ב 50 מ"ל צינורות (5 צינורות לכל מעיל באפי). טרום חמים לטמפרטורת החדר.
    2. מלאו את המעיל באפי עם בופר פוספט (PBS) (בטמפרטורת החדר) 180 מ"ל. אם דם טרי משמש, לדלל דם עם נפח שווה של PBS.
    3. צינור הטית לצד ובינוני צנטריפוגה צפיפות כיסוי לאט עם ~ 35 מיליליטר דם מדולל לכל צינור. מוסיפים את הדם בזהירות רבה, ללא כל ערבוב של צנטריפוגה צפיפות medשלב ium שכבת הדם.
    4. צנטריפוגה 20 דקות ב 1,150 XG בטמפרטורת החדר ללא בלם. הפעל את צנטריפוגות ללא בלם ואם אפשר עם נמוך להאצה בינונית כדי למנוע ערבוב של השכבות.
    5. קח את טבעת לבן המכיל PBMCs בין מדיום צנטריפוגה צפיפות ואת שלב הפלזמה. מעבירים צינור חדש 50 מ"ל (1 זמן עם פיפטה 5 מ"ל ו -2 פעמים עם 2 מ"ל פיפטה פלסטיק-פסטר). לקחת קצת כמו פלזמה אפשרית ובינוני צנטריפוגה צפיפות. אל תיגעו גלולה הכדורית האדומה.
    6. לשטוף PBMCs. פיצול PBMCs לתוך 50 מ"ל צינורות (4 צינורות לכל מעיל באפי). ממלאים כל 50 מ"ל עם PBS.
    7. צנטריפוגה 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. סר וזורק supernatant, לרכז את התאים לתוך 1 שפופרת עם 10 מיליליטר סרום RPMI / 10% עוברי עגל (FCS) בינוני ו resuspend היטב. אם גושי תאים נוכחים, תאי זן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
    9. עבר תאי בקבוק תרבית תאי T175 מודעהתאי Herent. לשטוף צינורות עם 40 בינוני מ"ל ולשלב עם תאים (50 מ"ל סה"כ). במידת הצורך, להסיר aliquot לניתוח cytometry זרימה (ראה שלב 1.4). בדרך כלל, CD4 + T תאים מהווים כ 30-40% של תאים בשער לימפוציטים, ותאי T נאיביים מהווים כ 30 עד 60% של תאי CD4 + T תלויים התורם.
    10. דגירה תאים בהנחת הבקבוק עבור 45 עד 90 דקות ב 37 2 ° C / 5% CO. שלב זה יהיה לרוקן מונוציטים ידי דבקות פלסטיק. זה לא חובה, אבל יגדיל את התשואה תא אחוז T לכל כמות PBMCs בשלבים הבאים.
    11. תאי Resuspend (ב 50 המ"ל כלול בינוניים הבקבוק) ולשטוף שכבת תאים בחלק התחתון של הבקבוק היטב. פזר התאים באופן שווה לשתי צינורות 50 מ"ל (הצינורות הקודם ניתן להשתמש בהן שוב ושוב על אותו התורם). לשטוף הבקבוק עם 50 מ"ל טרי RPMI / 10% בינוני FCS, ולהעביר באופן שווה לאותו 2 צינורות.
      הערה: PBMCs ניתן לאחסן לילה בשעת 4 ° C עם צינורות סמיכיםבצד, או באופן אידיאלי, להשתמש בהם ישירות על בידוד תא T.
  2. בידוד nTreg ידי מיון התא מגנטי מופעל
    1. הכן חיץ בידוד: 0.5% (w / v) אלבומין אנושי 2 mM EDTA ב PBS. שמור תמיד חיץ על 4 מעלות צלזיוס. לחלופין כדי אלבומין אנושי, להשתמש אלבומין שור.
    2. Resuspend ולספור PBMCs עם דלפק תא אוטומטי או ידני בנוכחות trypan כחול (לא סופרים טסיות קטן). אם גושי תאים הם נצפו, תאי זן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
    3. PBMCs צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. תאים Resuspend (עם 1 מ"ל pipet) במאגר בידוד 90 μl לכל 10 7 PBMCs לקבל השעיה תא בודד. שמור את התאים ב -50 צינורות מ"ל המקורי (2 צינורות לכל מעיל באפי).
    5. מוסיפים 2 חרוזים CD25 μl לכל 10 7 תאים, לערבב, ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 °.
    6. מלאו עם PBS 30 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 46; C.
    7. הכן עמודות LS (2 לכל מעיל באפי): לאזן עם חיץ בידוד 3 מ"ל, וזורקים לזרום. צינורות ניתן להשתמש בהן שוב ושוב לשטוף עמודות נוספות.
    8. תאים Resuspend במאגר 3 מ"ל בידוד לכל צינור (עם 1 מ"ל pipet). העברת התאים LS טור, ולאסוף הזרימה דרך צינורות 15 מ"ל טריים.
    9. שוטפים את צינורות 50 מ"ל עם 2 מ"ל בידוד חיץ כל. העברת שטיפת חיץ כדי העמודים.
    10. 2x טור לשטוף עם 3 מ"ל בידוד חיץ כל. תמיד לחכות עד עצר הטור מטפטף, לפני הוספת כל נוזל חדש. חנות לזרום ב 4 ° C עבור צעדים מאוחר יותר.
    11. הסר עמודה מגנט. Elute 2x עם 3 מ"ל בידוד חיץ לכל עמודה לתוך 15 צינור מ"ל.
      הערה: eluate מ 2 טורים תורמים יכולה להיות משולבת. אין לטבול את העמודה לתוך הנוזל.
    12. הכן לאזן עמודות LS החדשה (1 עמודה לכל מעיל באפי). מעבירים את eluate מ 1.2.11 לעמודה. זרימת דרך יכולה להיות מושלך. לאחר eluate יש פאסהד דרך העמודה, לשטוף צינור ולשטוף 3x העמודה עם חיץ 3 מ"ל בידוד.
      הערה: הטור השני נדרש, אפוא, צורך להגדיל טוהר.
    13. הסר עמודה מגנט. "NTregs" ++ Elute CD25 2x עם 3 מ"ל בידוד חיץ.
    14. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant לחלוטין.
    15. שטוף תאים עם מדיום תרבות 15 מיליליטר T תא, צנטריפוגות ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant לחלוטין.
    16. תאים Resuspend במדיום תרבות 0.5 מ"ל T התא, בתוספת 100 IU / ml IL-2, כל אחד. העברת תאים לצלחת 24 באר. צינור לשטוף עם 0.5 מ"ל בינוני (+ 100 IU / ml IL-2) ולשלב לתוך צלחת 24 גם.
    17. רוזן nTregs (כמו בשלב 1.2.2). התשואה היא בדרך כלל כ 1-4 x 10 6 Tregs לכל המעיל באפי. התאם צפיפות של Tregs 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל עם מדיום תרבית תאים T + 100 IU / ml IL-2.
    18. דגירה Tregs ב 37 ° C / 5% CO 2 עד השימוש.
    בידוד תא הנאיבי CD4 + T על ידי מיון תא מגנטי מופעל
    הערה: קח לזרום דרך משלב 1.2.8-1.2.10 להמשיך בידוד תא. לחלופין, אם לא nTregs בודד, להמשיך ישירות PBMCs.
    1. שלב 2 צינורות לכל תורם של PBMCs מדולדל Treg ב 50 מ"ל צינור. מלאו עם PBS 50 מ"ל בטמפרטורת החדר.
    2. PBMCs צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר. סר וזורק supernatant. תאים Resuspend ב 50 מ"ל PBS.
    3. חזור על שלב 1.3.2 פעמים.
      הערה: שוטף PBS הוא קריטי עבור הסרת טסיות, אשר לא יוסרה עם ערכת הבידוד השלילית הבאה. טסיות להישאר supernatant ב צנטריפוגה במהירות נמוכה זה. דלדול טסיות ניתן לנטר הצעדים הבודדים בשקופית מיקרוסקופית. הצעדים צריכים להתבצע עם PBS centrifugations בטמפרטורת החדר.
    4. Resuspend PBMCs ב 50 מ"ל PBS. ספירת תאים כמו בשלב 1.2.2.
    5. PBMCs צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 40 חיץ בידוד μl (4 ° C) לכל 10 7 תאים.
    6. הוסף 10 μl של נאיבית CD4 + T Cell ביוטין-נוגדן הקוקטייל שני לכל 10 7 תאים.
    7. מערבבים, דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    8. שטפו תאים על ידי הוספת 40 מ"ל PBS (4 ° C), ו צנטריפוגות ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסרת תאים supernatant ו resuspend במאגר בידוד 80 μl לכל 10 7 תאים.
    9. הוסף 20 μl של microbeads אנטי ביוטין לכל 10 7 תאים. מערבבים היטב, דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
    10. מלאו 50 מ"ל עם קר PBS, צנטריפוגות 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
    11. הכן עמודות LS (לאזן עם חיץ 3 מ"ל בבידוד). כדי למנוע עומס יתר עמודה, השתמש בעמודה אחת עבור מקסימאלי 250 x 10 6 PBMCs, או פחות אם PBMCs מכיל כדוריות דם אדומות רבות.
    12. הסר ג supernatant ו resuspendאמות חיץ 3 מ"ל בידוד. העברת תאים בעמודת LS. אסוף זרימה דרך, אשר מכילה את תאי CD4 + T הנאיביים, ב 15 מיליליטר צינורות.
    13. לשטוף בצינור עם חיץ בידוד 2 מ"ל. העבר לעמודה.
    14. 3x טור לשטוף עם חיץ 3 מ"ל בידוד. תמיד לחכות עד בעמודה מפסיקה מטפטפת, לפני הוספת כל נוזל חדש.
    15. קח את זרימת דרך (תאים נאיביים CD4 + T) ו צנטריפוגות 450 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. יכול להיות מושלך עמודות.
    16. הסר supernatant לחלוטין. שטפו תאים עם 15 בינוני מ"ל, צנטריפוגה 450 XG עבור טמפרטורה 10 דקות ב חדר ולהסיר supernatant לחלוטין.
      הערה: בידוד חיץ מכיל EDTA, אשר chelates יוני הסיד ובכך פוגע הפעלת תא T. לפני כל מבחני גירוי, להסיר את החיץ בידוד לחלוטין ולשטוף תאים פעמיים עם 15 מ"ל בינוני.
    17. Resuspend תאים בינוני תרבית תאי T 2-3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. תאים נוח על משכבך o הבקבוק המתאיםr גם במשך הלילה בחממה. אם תאים משמשים ישירות עבור מבחני גירוי, לשטוף אותם עוד פעם אחת עם מדיום.
  3. טוהר בקרה מכתימה
    1. קח ~ 50,000 תאים (Tnaïve; nTreg; PBMCs) כל אחת, ב 20 μl.
      הערה: אם שני Tnaïve ו nTreg פאנל הם להיצבע, לקחת 2 דוגמאות לכל.
    2. כן 2x premix נוגדן מרוכז (PBS) בהתאם המכשיר, למשל: לוח Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. לקבלת לוח Treg, להחליף CD45RO-PE עם CD25-PE, 1:10.
      הערה: נוגדנים CD25 מסוימות בלבד, שמזהים אפיטופים שונים מאשר-microbeads CD25, שניתן להשתמש בהם כדי להכתים nTregs מבודד עם microbeads CD25.
    3. הוסף 20 μl premix נוגדן ל -20 תאים μl. כמו כן להכין האחת stainings לכל fluorochrome (באמצעות מדגם המכיל תאים חיוביים, למשל, PBMCs) ו מדגם בלא כתם עבור זרימת cytometry settinGS ופיצוי.
    4. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. ממלא כל מדגם עם 200 μl PBS, צנטריפוגות 450 XG למשך 5-10 דקות.
    6. קח את התאים בתא מופעל קרינת מיון (FACS) חיץ (= חיץ בידוד ללא EDTA) ולנתח ידי cytometry זרימה. הטוהר של תאים נאיביים CD4 + T הוא בדרך כלל> 95% (ראה איור 2).

2. Treg אינדוקציה תרבות

  1. הכנת מדיה גירוי וצלחות
    1. כן בינוני תרבות טרום חם T תא: השלם בינוני hematopoietic סרום ללא עם 2 מ"מ גלוטמין L-alanyl-L.
    2. כן ציטוקינים, נוגדני גירוי וריכוזי מניות מתחמים.
      1. כן פתרון מניות IL-2: 400,000 IU / ml ב סטרילי, מסונן (מסנן עם חומצה עמידה) 100 מ"מ חומצה אצטית (167 מיקרוגרם / מיליליטר אם פעילות של המגרש משמש היא 2,400 IU לכל 1 מיקרוגרם; לאשר עם ספק). Aliquot לנמוך חלבון מעוקר מחייב צינורות 0.5 מ"ל, חותם עם Parafilm, הקפאת קרח ולאחסן יבש ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך או -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
      2. כן פתרון מניות TGF-β1 (ל -10 מיקרוגרם בקבוקון, מוביל-חינם): אבקת צנטריפוגה TGF-β1 (1,000 דקות XG 3), להוסיף 100 μl של 4 המ"מ HCl (סטרילי, מסונן עם מסנן עמיד חומצה) להכין פתרון מניות עם 100 מיקרוגרם / מ"ל, ולאפשר להתמוסס לחלוטין; מְעַרבּוֹלֶת. Aliquot 5 μl כל לנמוך חלבון מעוקר מחייב צינורות 0.5 מ"ל, חותם עם Parafilm, הקפאת קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      3. הכן פתרון המניות ATRA: ממיסים אבקת ב 20 מ"ג / מ"ל ​​(66.6 מ"מ) ב DMSO. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ על ידי דילול נוסף aliquots DMSO ולאחסן, מוגן מפני אור, ב -80 ° C עד 1 שנה. ATRA הוא רגיש לאור, חום ואוויר.
      4. הכן פתרון המניות rapamycin: 1 מ"ג / מ"ל ​​(1.11 מ"מ) ב DMSO, חנות aliquots ב -80 מעלות צלזיוס במשךעד 1 שנה.
      5. הכן פתרון המניות בוטיראט נתרן: 0.908 M (0.1 מ"ג / מ"ל) מניות H סטרילי אולטרה-טהור 2 O ולסנן סטרילית. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    3. כן 4x premixes המרוכז (50 μl לכל טוב) במדיום תרבית תאי T כמו בטבלה 1.
    4. ביום הקודם, צלחות מעיילות עם נוגדן אנטי CD3. מעיל הרצוי מספר בארות מ -96 צלחת U-היטב עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​נוגדן אנטי CD3 ב PBS, 65 μl / טוב. עוטפים בנייר כסף צלחת דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אין להשתמש בארות מרווח של 96 צלחות היטב. בארות בגרו ניתן להשתמש, אך בארות בצורת U להקל את השימוש של אותם מספרי התא ליחידת שטח פני ניסויים. אם יותר תאים נדרשים, ברכה את הכמות הנדרשת של בארות אחרי התרבות. בדרך כלל, לאחר 4-6 ימים של הרחבה, 2 בארות מדגם מספיקים ניתוח תזרים cytometry וניתוח RNA.
      1. ביום ציפוי, זמן קצר לפני הציפוי, להסיר אנטיפתרון -CD3 מבאר. מלאו בארות עם 200 μl / גם PBS. הסר PBS. חזור כביסה עם 200 μl / גם PBS. הסר PBS לחלוטין ולהשתמש צלחות מיד.
    5. כן צלחות (לא להשתמש בבארות מרווח):
      1. עבור כל טוב, להוסיף 50 μl של premix אנטי CD28 / IL-2 4x (למעט תאים "unstimulated", להוסיף בינוני תרבית תאים T), 50 μl 4x premix TGF-β1 (לכל iTregs) או 50 μl T תרבית תאים בינוני לשליטה "גירוי רק" מדומה, 50 μl 4x ATRA, ATRA / rapamycin או premix בוטיראט (אם ישים) או בינוני
      2. מלא את כל הבארות הריקות, כוללת בארות המרווח, עם 200 μl PBS. טרום חמים צלחות ב 37 ° C / 5% CO 2.
  2. כן תאי T הנאיבי עבור ציפוי
    1. אחרי שנחתי תאים, להעביר 15 צינור מ"ל, לשטוף בקבוק / בארות עם תרבית תאים בינוניים מחומם מראש T ובריכת צינור. מלאו צינור עד 15 מיליליטר עם מדיום תרבית תאי T. </ Li>
    2. תאים צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר בינוני תופסים התאים בינוני תרבית תאים טרי, מחומם מראש T לצפיפות של 2.2-2.6 x 10 6 / ml. ספירת תאים כמו בשלב 1.2.2 ולהתאים צפיפות במידת הצורך.
    4. הוספת תאי צלחות גירוי מוכנות (ראה 2.1), 50 תאי μl / טובים (110,000-130,000 תאים / טוב). כל טוב צריך עכשיו מכילים בנפח כולל של 200 μl.
    5. גלישת צלחות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ATRA; לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 לתקופות זמן רצויות.
  3. צג Treg אינדוקציה תרבות
    1. צג תרבויות Treg ידי מיקרוסקופ אור (בהגדלה 40X). מכ יום 2 עד 3, אשכולות קטנים של תאים מתרבים צריכים להיות גלויים, אשר מתמזגים אשכולות גדולים בנקודות מאוחר יותר זמן. תרבויות גדלו עם rapamycin כלל בגידולו. ראה גם איור 3.
    2. בנקודות זמן רצויות, לקחת דגימות עבור דואר רנ"אxtraction או cytometry זרימה phenotyping (ראה להלן). לקבלת נקודות במועד מאוחר יותר עם התפשטות תאים, 1 גם כל מספיקה, אחרת לקחת 1 x 10 5 -1 x 10 6 תאים עבור כל רנ"א 3 x 10 5 -1 x 10 6 תאים cytometry הזרימה.
  4. הערכת FOXP3 יציבות
    1. להערכת היציבות של פנוטיפ iTreg כפי שתואר לעיל 22,27, לשטוף iTregs פעמיים עם תרבית תאים בינוניים T, ו iTregs תרבות נוספת במדיום תרבית תאים T או בלי או עם אנטי CD3 ואנטי-CD28 restimulation כמתואר 2.1 ו -2.2 . הוסף ציטוקינים, כגון 50 IU / ml IL-2, ללמוד את השפעתם על יציבות FOXP3.
    2. בנקודות זמן רצויות, לקחת דגימות להפקת RNA, cytometry זרימת phenotyping (ראה להלן), וניתוח מתילציה TSDR כמתואר 22,28.

ניתוח פנוטיפי 3. iTregs ידי qRT-PCR

  1. הכנה שלדגימות
    1. בנקודות זמן רצויות, לקחת 1 x 10 5 כדי 1 x 10 6 תאים לדגימה להפקת RNA. העברת התאים צינור RNase ללא 1.5 מ"ל, ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות.
    2. במידת הצורך, להסיר חלק supernatant ולהקפיא עבור assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) או ניתוח דומה. הסר הנותרים supernatant לחלוטין מתאי. להמשיך ישירות מיצוי RNA או להקפיא גלולת תא על קרח יבש חנות ב -20 ° C ל -80 ° C עד 2 שבועות.
    3. חלץ RNA ולבצע qRT-PCR עבור FOXP3 וכן גן משק (כגון RPL13A) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בנוסף, למדוד ביטוי של גנים החתימה Treg אחרים (למשל `Treg up' גנים IL2RA, CTLA4, IKZF4, וה גנים down' Treg IFNG, SATB1).

4. ניתוח פנוטיפי על ידי זרימת cytometry

הערה: פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור כתםing בפורמט צלחת היטב 96U עם 3 x 10 5 -1 x 10 6 תאים. אם יש פחות תאים לכל טוב, תתחיל עם כמה בארות וברכה כמתואר להלן.

  1. Cell Restimulation (אופציונלי)
    1. אם מכתים ציטוקינים תאיים הוא רצוי, תאים דופקים עם phorbol 12-myristate 13-תצטט (PMA) / ionomycin בנוכחות מעכב תחבורת חלבון.
      הערה: הליך זה אינו משפיע על ביטוי FOXP3 ב מתוארות לעיל תרבויות iTreg, אבל סמנים אחרים עשויים לשנות - לדוגמה, CD4 הוא downregulated.
    2. כן 10x Brefeldin A / PMA / ionomycin premix (20 μl לכל טוב) במדיום תרבית תאי T: Brefeldin פתרון מניות 1: 100, ionomycin (מנייה 5 מיקרוגרם / μl) 1: 1,300, PMA (מניית 12.35 מיקרוגרם / μl, מראש -dilute 1: 1235) 1: 100 של המניה מראש מדולל.
    3. 4 שעות לפני מכתים, להוסיף 20 μl Brefeldin A / PMA / ionomycin 10x תערובת לכל טוב להשיג ריכוזים סוף 1: 1,000 Brefeldin, 0.5 μM (375 ng / ml) ionomycin, 10 ng / ml PMA.
    4. דגירה של 4 שעות ב 37 ° C / 5% CO 2
  2. מכתים Surface
    הערה: הפאנל הציע הנה הצעה; לוחות אחרים עשויים לשמש תלוי את האנטיגנים של עניין ההתקנה המכשיר.
    1. מגניב PBS על קרח. הכן חיץ FACS (PBS עם 0.5% אלבומין בסרום אדם, HSA) ומצננים על הקרח. BSA או FBS ניתן להשתמש כחלופה HSA.
    2. תאים מחדש צלחת צלחת מכתים: גלולת תאים עם טפטפתי ולהעביר את התאים לתוך צלחת היטב 96U חדש, עוזב אחד חינם היטב סביב כל טוב (כדי למנוע זליגה בהליך מכתים מאוחר יותר). אם פחות מ מספרי תא רצויים נמצאים הבאר המקורית, סר חלק supernatant לפני resuspension, וברכה כמה בארות לתוך מכתים גם.
    3. צלחת צנטריפוגה 400 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את supernatant. שפוך supernatant לתוך תיבת פסולת, לעזוב את הצלחת הפוכהלמטה ומיד (ללא דרך חזרה לצלחת) הקש על הצלחת פעם אחת על נייר סופג. ואז מייד להחזיר את הצלחת. צלחת וורטקס כדי resuspend תאי נותרים נוזליים.
    5. הוסף 25 premix מכתים משטח μl (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 במאגר FACS) ו resuspend.
      הערה: כמו כן כוללים יחיד stainings עבור כל אחד fluorochromes בשימוש עם דגימות המכילות תאים חיוביים עבור אנטיגן בהתאמה; וכולל מדגם בלא כתם. אלה יהיו צורך התקנת פיצוי מכשיר. לחלופין, להשתמש חרוזי פיצויים.
    6. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    7. הוסף 200 μl PBS, צלחת צנטריפוגות 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    8. חזור על שלב 4.2.7 פעמים.
  3. כדאיות מכתימה
    הערה: מכתים כדאיות הוא הכרחי, שכן לאחר הקיבוע / permeabilization תאים מתים לא ניתן לשלול באופן מספק על ידיFSC / SSC ועשויים מולידים אותות נוקבים. יש לצבוע כדאיות fixable לשמש.
    1. Resuspend תאי premix הכתם כדאי 130 μl (כדאיות fixable צבען eFlour780 1: 1,400 ב PBS) ותאי resuspend מייד עם pipet רב ערוצית.
      הערה: כמו כן כוללת מכתים יחיד עבור צבע הכדאיות המכיל תאים מתים, למשל, תאי T unstimulated בתרבית למשך כמה ימים או להרוג תאים על ידי הפעלת חום כמו על ידי 'הוראות היצרן. אלה יהיה צורך לפיצוי.
    2. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    3. צלחת צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant כמו בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    4. מלא עם 200 μl חיץ FACS. חזור על שלב 4.3.3.
    5. מלא עם 200 μl PBS. חזור על שלב 4.3.3.
  4. מכתים תאי עם FOXP3 מכתים הצפת גדר
    1. עבור כל טוב, להכין: 150 תקן μl / חיץ פרם (לדלל תקן / פרם קונצרט כלשהוentrate 1: 4 עם diluent); 850 μl 1x חיץ permeabilization (לדלל 10x permeabilization חיץ 1:10 עם O טהורים H 2).
    2. לאחר vortexing, תאים resuspend ב 150 μl תקן / פרם חיץ ומיד resuspend עם פיפטה. חשוב מיד resuspend להימנע קיבעון של גושי תאים.
      זהירות: קיבוע חיץ מכיל paraformaldehyde יש לטפל וזנוח כראוי.
    3. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    4. הוספת 100 μl PBS קר. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
      הערה: משלב זה ואילך מהירות צנטריפוגה היא גדלה כדי למנוע אובדן של תאים. לאחר קיבוע, תאים לבלתי נראים וטיפול יש לנקוט כדי להסיר supernatants כמתואר בשלב 4.2.4 ומיד לאחר צנטריפוגה נגמר כדי להקטין את איבוד של תאי.
    5. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
      הערה: מכתים עלול להיות מושהה בשלב זה; בבמקרה זה, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μl PBS; אז תופסים 250 μl PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור. התאים יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים, ולאחר מכן להמשיך עם permeabilization. עם זאת, תוצאות אופטימליות מושגות כאשר המשיך ישירות permeabilization.
    6. לאחר vortexing, להוסיף 200 חיץ Permeabilization μl. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    7. הוספת 200 חיץ Permeabilization μl כדי resuspend.
      הערה: כאן, דגימות ניתן לפצל מכתים תאיים מדגם לשלוט אלוטיפ (לקחת חצי של כל דגימה). אם מספרים סלולריים מגבילים, מדגם אלוטיפ ונקווה ניתן להכין (לקחת 10-20 μl של כל דגימה וברכה). כמו כן, דגימות ניתן לקחת עבור הקרינה מינוס-One (FMO) שולטת.
    8. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    9. Resuspend גלולה ב44 סרום עכבר רגיל μl חיץ Permeabilization פלוס 1 μl (premixed) לחסום מחייב נוקב.
      הערה: זו חלה אם נוגדנים המשמשים בשלב הבא הם של אלוטיפ בעכברים. אם נוגדנים אחרים, כגון נגזר מן החולדה, משמשים, כולל את הנסיוב המתאים לחסימה (למשל, סרום עכברוש).
    10. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
    11. הוספת נוגדנים:
      הערה: חקרי ריכוזי הנוגדן עבור הסדרה הספציפית. אם לא נעשה צעד 4.2 עם נוגדנים כנגד אנטיגנים פני השטח (למשל, CD4) עם fluorochromes בהתאמה, כוללים גם stainings יחיד עבור כל אחד fluorochromes בשימוש עם דגימות המכילות תאים חיוביים לפיצוי.
      1. הוסף 15 μl premix נוגדנים דגימות (למעט stainings יחיד, דגימות בלא כתם, דגימות בקרה אלוטיפ ובקרות FMO): Premix לדגימה: 0.7 μl (0.35 מיקרוגרם) גמא אנטי-אינטרפרון (IFN-γ) -FITC (אם זה אפשרי לאחר restimulation ),2.3 μl (0.115 מיקרוגרם) CTLA-4 מבריק ויולט 421, 2 μl (0.05 מיקרוגרם) Anti-FOXP3-APC, 10 μl PBS.
      2. כדי אלוטיפ דגימות בקרה, להוסיף 15 μl premix נוגדן אלוטיפ, באמצעות אותן כמויות של נוגדנים ובאשר נוגדנים המשמשים 4.4.11.1: Premix לדגימה: 0.7 μl (0.35 מיקרוגרם) FITC אלוטיפ עכבר IgG1 K (אם רלוונטי), 0.58 μl (0.115 מיקרוגרם) עכבר IgG2a-BV421 אלוטיפ, 0.5 μl (0.05 מיקרוגרם) APC אלוטיפ עכבר IgG1 K, 13.2 μl PBS.
      3. עבור פקדים FMO, להוסיף נוגדנים כמו 4.4.11.1, החלפת נוגדן אחד כל אחד עם PBS.
    12. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    13. הוספת 200 חיץ Permeabilization μl. צנטריפוגה, להסיר supernatant ו מערבולת כמו בשלב 4.4.8. חזור פעם אחת.
    14. תאים Resuspend במאגר קר FACS (נפח פי המכשיר בשימוש) ולרכוש, אידיאלי מיד, על cytometer את הזרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג סכמה של הגדרת הניסוי. איור 2 מראה מכתים מלא טוהר נציג תאי nTregs CD4 + T מבודדים מגנטי נאיביים.

F igure 3A מראה את זרימת cytometry האסטרטגיה gating ואיור 3 ב מציג FOXP3 ו CD25 נציג cytometry זרימה stainings ביום 6 של התרבות בתנאים iTreg או שליטה המצוין. עם במבחנה גירוי, רוב התאים upregulate CD25, אשר מצטמצם בנוכחות rapamycin. רק תחת תוספת של גורמי iTreg וישכנע, אוכלוסייה ברורה של FOXP3 + תאים מתברר, שגם הוא מועשר בתוך CD25 + תאים בתנאים iTreg. איור 3 ג מתאר את המראה פנוטיפי של תרבויות iTreg במיקרוסקופ עם מתרבים תאים לראות אשכולות כהה. אני כל מצב Treg מציג דפוס ספציפי לשחזור של התפשטות תאים: בתנאי התרבות אלה, TGF-β מגביר התפשטות מעט, ATRA מגדילה עוד יותר תפוצה. במקביל, עיכוב של התפשטות ידי rapamycin ניכר על ידי גודל האשכול מופחת מאוד. המראה המיקרוסקופי של כוח ההתפשטות גם תואם את ספירת תאים כוללת (נתונים לא כלולים).

תוצאות איור 4 מציג נציג qRT-PCR ניתוחים של אינדוקציה mRNA FOXP3 ב iTreg (ובקרה) תרבויות בנקודות זמן שונות. באשר חלבון FOXP3, ביטוי mRNA FOXP3 גבוה בכל iTregs לעומת שליטה תאים מגורה, עם iTregs שטופלו rapamycin שיש רמות נמוכות יחסית בהשוואה iTregs אחרים. FOXP3 mRNA ב nTregs הוא הגבוה ביותר מבין iTregs.

es / ftp_upload / 55,015 / 55015fig1.jpg "/>
איור 1: מערך ניסוי לזירוז iTreg, בידוד nTreg, וניתוח Treg. האדם תאים נאיבי CD4 + T בודדו מעילים באפי ועורר במדיום סרום ללא עם אנטי CD3 ונוגדנים אנטי CD28 בתוספת 100 U / ml IL-2 עד 6 ימים, או בהעדר ( `תאים שליטה מדומה ') או נוכחות של Treg וישכנע גורמים שונים ( `iTreg') כפי שצויין. nTregs מבודדת assayed במקביל. ניתוח פנוטיפי יכול להיעשות על ידי cytometry זרימה qRT-PCR. שונה מן שמידט, ואח א. 2016 22. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: טוהר נייד של החל אוכלוסיות. CD אדם נאיבי 4 + T תאים בודדו על ידי ערכת בידוד תא הנאיבית CD4 T השני, האדם. פנל עליון: טוהר תא הנאיבי CD4 + T, מבוסס על CD4, CD45RA ו CD45RO, עומד על 94 עד 98% ועל טוהר על שם תורם נציג של יותר מ -30 מוצג ( `Tnaïve'). Ex vivo Tregs ( `nTreg') בודד באמצעות כמויות מוגבלות של microbeads CD25 והשתמש כביקורת חיובית עבור ניסויי iTreg. טוהר nTreg של תורם נציג, מבוסס על CD25 ו CD4, מוצג. פנל תחתון: מכתים FOXP3 תאי (יבוצע כמו איור 3 ו מגודר מראש על תאי CD4 + live) מוצג עבור תאי CD4 + T נאיביים nTregs בהתאמה, באמצעות תאים מאותו התורם כמו הפנל העליון. שונה מן שמידט, ואח א. 2016 22. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3
איור 3: מראה פנוטיפי של iTregs ו nTregs. תאים אנושיים נאיבי CD4 + T היו בתרבית בינוני סרום ללא בתנאים מצוינים. תאי T היו מגורה עם אנטי CD3 ונוגדנים אנטי CD28 בתוספת 100 U / ml IL-2 ( `Stim.'). צוין, TGF-β1 ( `TGF'), rapamycin (` Rapa'), כל-טרנס החומצה הרטינואית ( `ATRA') או בוטיראט נוספו. nTregs (לשעבר vivo CD25 דם ההיקפי מבודדים ++ תאים) נותר unstimulated ( `unstim.') ושמש בקרה חיובית. תאים unstimulated T נאיבי שימשו כביקורת שלילית. (א) ביום 6 של תרבות, תאים הוכתמו נוגדני משטח כולל אנטי CD25 ואנטי-CD4, אז מוכתם כדאיות ניתן לתקן לצבוע ובהמשך קבוע / permeabilized ומוכתם intracellularly עם אנטי FOXP3 ואנטי CTLA-4 או אלוטיפ המשך נוגדני רול. רכישת ופיצוי בוצעה על זרימת ציאן ADP cytometer ואת הנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo. האסטרטגיה gating מותווה על ידי החיצים האדומים, ואת הדוגמה המוצגת היא מדגם iTreg המושרה עם TGF + ATRA. (ב) תאים הוכתמו כמו ב (א), וכן FOXP3 ו CD25 ביטוי בתאי T מלא iTregs המושרה על ידי פרוטוקולים שונים מוצג. מגרשי pseudocolor להראות stainings FOXP3 ו CD25 נציג תורם אחד, טרום מגודר על גופייה, לחיות CD4 + תאים כמו ב (א). דוגמא אלוטיפ מוצגת עבור iTreg (Stim. + TGF + ATRA) מדגם. (ג) נציג תמונות מיקרוסקופיה (בהגדלה 40X) בארות 96U-צלחת הפרט של תאים בתרבית למשך 4 ימים. אשכולות אפלים של תאים מייצגים תאים מתרבים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 4
איור 4: ביטוי mRNA FOXP3 על שימוש בפרוטוקולים שונים לבידול iTreg. iTregs נוצר כמו באיור 3 בתנאים שצוינו ולאחר בנקודות הזמן הנתונות, דגימות תאים נלקחו RNA הופק. Unstimulated תאי T תמימים, nTregs unstimulated, נדגמו ביום 0. דוגמאות נותחו על ידי qRT-PCR, וביטוי FOXP3 mRNA היה מנורמל ביטוי RPL13A עבור כל דגימה. ביטוי FOXP3 mRNA בתאי T הנאיביים unstimulated נקבע ל -1, ומקפל שינוי של FOXP3 mRNA חושב. מוצגים הם ערכים ממוצעים ומגוון PCR לשכפל בארות תורמות נציג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר האינדוקציה החזקה של CD4 + אדם FOXP3 + iTregs מתאי אדם נאיביים CD4 + T. היא כוללת פרוטוקול חדשות שתארנו לאחרונה, באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו rapamycin, לזירוז של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנת 22. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים, יתרון נוסף הוא הגיוס של אוכלוסיות iTreg שונות במקביל על ידי פרוטוקולים שונים, המאפשר השוואה הישירה של השפעות של גורמים iTreg וישכנעו מסוימים, יחד עם תאי שליטה אשר מופעלים בנוכחות IL-2 בלבד . הפרוטוקולים המתואר לאפשר אינדוקציה לשחזור של FOXP3 עם וריאציה התורם נמוכה. תאי CD4 + T נאיביים בפרוטוקול זה מבודדים ידי מיון תא מגנטי מופעל, אבל מיון תא מופעל קרינה הוא גם אפשרי. התשואה הצפויה של תאי CD4 + T נאיביים עם פרוטוקול זה היא בדרך כלל בין 5-10%, אבל מאוד תלוי התורם (גיל) ומופיע גם נמוך יותר כאשר שברים גבוהים של אריתרוציטים נוכחים. אם אומדן נדרש, PBMCs יכול להיות מוכתם (ראה שלב 1.4) במהלך שלב הדלדול מונוציטים. בדרך כלל, את התשואה של תאים מסוג CD4 + T נאיבי הוא כמחצית "תאים נאיבי אחוז CD4 + T של השער הלימפוציטים" את הכתם PBMC. פרוטוקול זה משתמש כמויות מוגבלות של חרוזים CD25 להשיג גבוהה CD25 (nTreg) תאים 29. עם זאת, אלה אינם Tregs טהור, אבל אלה הם רק מועשר Tregs לשמש כביקורת חיובית. אם Tregs הטהור נדרשים, ערכות אחרות אמורות לשמש (כגון בשילוב עם העשרה CD4 ו-דלדול CD127) או לחלופין, CD25 + תאים טרום מועשרים 8 μl חרוזי CD25 לכל 10 7 תאים ומוכתמים וממוינות לפי תא מופעל קרינה מיון עם gating ++ מחמירים CD4 + CD25. כמו כן הכללת סמנים אחרים, כגון אי הכללת CD127, צריך להיחשב.

_content "> חשוב לשקול FOXP3 כי הוא הכרחי, אך לא מספיק כדי להעניק Treg זהות 30. בעוד שניתן להשתמש iTregs ללמוד היבטים מסוימים של, למשל, תקנה FOXP3, חשוב עם זאת לציין כי iTregs נבדלים nTregs בכמה היבטים. לכן חיוני כדי nTregs התרבות (נגזר באופן אידיאלי מאותו התורם) במקביל iTregs בכל המבחנים להשוואה. ההבדל בין nTregs ו iTregs מודגם על ידי חפיפה חלקית בלבד של transcriptome nTreg ו iTreg כפי שהיא נמדדת iTregs בעכברים 31. גני חתימת Treg אחרים בנוסף FOXP3 צריך להימדד מסיבה זו, ועל מנת להבטיח אפליה מן ביטוי FOXP3 מושרה הפעלה בתאים אנושיים. לדוגמה, צריך iTregs להציג ביטוי גבוה של CD25, CTLA-4 ו EOS לעומת לתאים מופעלים T תוך צריך להיות ביטוי של-γ IFN ו- SATB1 נמוך nTregs ו iTregs המושרה על ידי הפרוטוקולים המתואר כאן, כפי שפורסם בעבר 13. גם בקנה מידה הגנום כולו, היא תוארה שדפוסים אפיגנטיים של מתילציה דנ"א שינויים היסטון iTregs בעכברים אינם משקפים את דפוסי נמצא nTregs 30. שתיארנו קודם לכן כי iTregs המושרה על ידי כאן תיאר פרוטוקולים, בניגוד nTregs, לא להפגין demethylation TSDR. בהתאם לכך, iTregs איבד FOXP3 כאשר restimulated, אך שמרו על הביטוי FOXP3 כאשר נוספת בתרבית בנוכחות IL-2 וללא restimulation 22. מעניין, iTregs המושרה על ידי פרוטוקול חלופי באמצעות supernatants מקרופאג M2 מוצג משופר יציבות FOXP3, למרות חוסר demethylation TSDR ו TGF-β להיות סיבתי לזירוז FOXP3 27.

שינוי של iTreg-inducing פרוטוקולים על ידי תוספת של תרכובות (כגון ויטמין C או מימן גופרתי) המשפיעים עשר-עשר טרנסלוקציה (TET) אנזימים dioxygenase methylcytosine, כמתואר לאחרונה מאוד 32 - 34, רשאי להוסיף בייצוב FOXP3 ידי המשפיע מתילציה DNA. כמו כן, כוח הגירוי והעיתוי יש השפעה על ביטוי FOXP3 ויציבות 35. ברוח דברים אלה, שימוש נוגדני CD28 CD3 / מצמידים חרוזים במקום נוגדנים נכנסי צלחת הוצג כדי להגדיל בעכברי iTreg in vivo תפקוד ויציבות מדכאים אם כי עצמאי של demethylation TSDR 36. גורם נוסף אשר צריך להיחשב כמקור פוטנציאלי של וריאציה הוא השימוש בסרום, אשר מכיל גורמים מוגדרים כולל TGF-β אשר אפילו ממקור שור הוא 100% צלב-reactive עם תאים אנושיים. כמו כן, המקור והפעילות של IL-2 יכולים להשפיע על תוצאות FOXP3 אינדוקציה דרסטי.

F חשובeature של Tregs הוא היכולת המדכאת שלהם, אשר צריכה להיבדק לאחר מכן עם iTregs שנוצר בפרוטוקול זה. יצוין כי מבחני דיכוי עם iTregs אינם טריוויאליות והספרות על יכולות מדכאות של iTregs שנויה במחלוקת. שיטות ופרוטוקולים כמה להעריך פונקציה מדכאת של Tregs האדם פורסם במקומות אחר 22,37 - 41, עם מבחני התפשטות חוץ גופייה מבוססת על תזרים cytometry readouts כגון דילול של אסתר succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE) להיות נפוץ ביותר. חשוב לשטוף ומנוחה iTregs לפני השימוש ב מבחני דיכוי, וזה צריך להיחשב כי iTregs, בניגוד nTregs, לא יכול להיות anergic אבל להתרבות עצמם במהלך מבחני דיכוי. אנחנו רואים את זה מאוד חשוב להשתמש `mock' מגורה תאי T כתאים מדכאי בקרה לזהות את מידת דיכוי נוקב (כגון דרך ביטוי CTLA-4, IL-2 consumption ואת יתר התרבות ידי תאים מופעלים T) כי אינו קשור FOXP3 + אפקטי Treg ספציפיים, ואת החוסר התכוף שליטה זה עשוי לתרום מחלוקות כמה בספרות. באמצעות שליטה זו, הגדרנו שרק TGF-β / ATRA / Rapa נגרמת iTregs מוצגת פעילות מדכאת במבחנת 22. לפיכך, אנו מסיקים כי לגבי פעילות מדכאת (גם אם לא גבוה ביותר בשבריר של FOXP3 + תאים), TGF-β / ATRA / Rapa הוא השילוב הטוב ביותר של גורמים של הפרוטוקולים תארו לגרום iTregs. עם זאת, פעילות מדכאת במבחנה אינה משקפת בהכרח פעילות מדכאת in vivo, ואכן קבענו כי iTregs האנושי שנוצר על ידי פרוטוקולים אלה לא לדכא במודל מחל xenogeneic graft- לעומת -host לפחות בתנאים נבדקו 22. זה עשוי להיות קשור ביטוי FOXP3 היציב אשר אבד iTregs על restimulation, עולה בקנה אחד עם חוסר demethylation TSDR 22

תלוי באיזה היבט של תכונות iTreg (שיעור גבוה של FOXP3 + תאים, פעילות מדכאת מעולה, יציבות FOXP3) הוא חשוב ביותר עבור שאלת מחקר בפרט, פרוטוקולים שונים עשויים להיות מתאימים ביותר בחקר שאלות אלה, מה שהופכים אותו קשה להגדיר את הכלל 'הטוב ביותר 'פרוטוקול לזירוז Treg. יתרה מזו, מספר מתואר לעיל הבדלים הניסיונות עדינים יכולים להשפיע על תוצאות ועשויים לתרום מחלוקות ביחס פונקציה הפנוטיפ המדכאת של iTregs נגרם TGF-β המופיעות בין דיווחים אפילו עם פרוטוקולים דומים כנראה לייצור iTreg 42. לדוגמא, אפילו בתוך מעבדה אחד, צפינו כי iTregs מושרה עם TGF-β ו- IL-2 במדיום סרום המכיל RPMI מוצג כמה פעילות מדכאות לעומת שליטת תאים 27, בעוד TGF-β / IL-2-induced iTregs שנוצר מוגדר, תרבית תאים בינוניים T סרום ללא לא 22, דespite רמות דומות של FOXP3.

יישומים עתידיים מבוססים על פרוטוקולים אלה צריכים לשאוף להמשיך לייעל תנאי אינדוקצית Treg להשיג פנוטיפ עם ביטוי FOXP3 יציב, demethylation TSDR, פנוטיפ יציב ללא המרה לתאי T מפעיל מייצר ציטוקינים ופעילות מדכאת אופטימלית. פיתוח נוסף של פרוטוקולי אינדוקצית iTreg עשוי להיות שימושי עבור העברת מאמצת גישות בעתיד, שבו טיפול באמצעות העברת Treg נראה המבטיחה ביותר לטיפול הפוטנציאל של מחלות אוטואימוניות ודלקתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 118 תאי T רגולטורים Treg תאי CD4 + T בידוד תא מגנטי, ציטוקינים FOXP3 TGF-β IL-2 תאיים Cytometry זרימה qRT-PCR
<em>במבחנה</em> בידול של האדם CD4 <sup>+</sup> FOXP3 <sup>+</sup> מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 <sup>+</sup> T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter