Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Differensiering av Menneskelig CD4 + foxp3 + Induced regulatoriske T-celler (iTregs) fra naive CD4 + T-celler under anvendelse av et TGF-β holdige Protocol

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver reproduserbar generering og fenotyping av menneskeskapte regulatoriske T-celler (iTregs) fra naive CD4 + T-celler in vitro. Forskjellige protokoller for foxp3 induksjons tillater studiet av spesifikke fenotyper iTreg oppnådd med respektive protokoller.

Introduction

CD4 + CD25 + foxp3 + regulatoriske T-celler (tregs) undertrykke andre immunceller og er kritiske formidlere av perifer toleranse, hindrer autoimmunitet og overdreven betennelse en. Betydningen av Tregs er eksemplifisert ved den humane sykdommen immunodysregulation polyendocrinopathy enteropati X-bundet syndrom (IPEX), i hvilken tap av Tregs på grunn av mutasjoner i `master' Treg transkripsjonsfaktor gaffelhodeboks P3 (foxp3) fører til alvorlig systemisk autoimmun sykdom, dødelig i tidlig alder. Men Tregs fungere som et tveegget sverd i immunsystemet som de kan også hemme anti-tumor immunitet i visse innstillinger 2. Terapeutisk manipulering av treg antall og funksjon er derfor underlagt en rekke kliniske undersøkelser. I kreft, kan uttømming av tregs være ønskelig og noen suksess av kliniske tilnærminger oppmuntrer til videre forskning tre. I autoimmune og inflammatoriske sykdommer, i tillegg til terapeutiske effektene av Tregs i seveRAL mus sykdomsmodeller, nye første i manns forsøk med adoptiv Treg overføring for å hindre graft- versus -host sykdom (GvHD) 4-7 og vurdere sikkerheten i behandling av type 1 diabetes 8 viste svært lovende resultater.

Naturlig forekommende Tregs (nTregs) omfatter thymus-avledet tTregs og perifert indusert pTregs, med ikke-redundante viktige funksjoner i å opprettholde helse 9-11. Men nTreg tallene er begrenset, oppmuntre til komplementær tilnærming som induserer tregs (iTregs) in vitro fra naive T-celle forløpere 12. Fortsatt stabilitet av iTregs, antagelig på grunn av manglende demetylering i den såkalte treg-spesifikke demetylerte region (TSDR) i foxp3 gen locus 13, forblir et problem og flere studier tyder på at in vivo-indusert Tregs er mer 14 stabil.

Til dags dato, foxp3 fortsatt den beste protein mArker for Tregs men det er ikke helt bestemt, fordi menneskekonvensjonelle CD4 + CD25- T-celler forbigående uttrykker middels nivå av foxp3 ved aktivering 15,16. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort i å belyse regulering av foxp3 uttrykk, er fortsatt mye å bli oppdaget med induksjon, stabilitet og funksjon av foxp3 særlig i humane celler. Til tross for forskjeller i nTregs, in vitro indusert foxp3 + CD4 + T-celler kan brukes som et modellsystem for å studere molekylære mekanismer for foxp3 induksjon og som et utgangspunkt for å utvikle protokoller i fremtiden som tillater generering av iTregs som er mer lik den i vivo genererte Tregs, noe som kan være aktuelt for adoptiv overføring strategier i fremtiden.

Det er ingen `gull standard'-protokollen for å indusere humane iTregs, og nåværende protokoller er utviklet basert på å etterligne treg-induserende betingelser in vivo: interleukin 2 (IL-2) Og transformerende vekstfaktor β (TGF-β) signalering er avgjørende for foxp3 induksjon in vivo 17, og all-trans retinsyre (ATRA) - som er produsert in vivo ved tarmassosiert dendrittiske celler - blir ofte brukt for å forbedre foxp3 induksjon in vitro 18 - 21. Vi har utviklet flere menneskelige Treg-induserende protokoller ved hjelp av smørsyre 22, en gut microbiota-avledet kortkjedet fettsyre som nylig ble vist seg å forsterke murine Treg induksjon 23,24. Vi har også nylig etablert en ny protokoll for generering av iTregs med overlegen undertrykkende funksjon in vitro ved hjelp av en kombinasjon av TGF-β, ATRA og rapamycin 22, sistnevnte er en klinisk godkjent pattedyr målet for rapamycin (mTOR) inhibitor som er kjent for å fremme foxp3 vedlikehold under menneskelig treg utvidelse 25,26.

Denne metoden beskriver reproduserbar ivitro generering av humane CD4 + foxp3 + iTregs ved hjelp av et sett av forskjellige forhold, og deres etterfølgende fenotyping ved flow-cytometri og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) for å avsløre protokoll-spesifikke mønstre av ekspresjon av foxp3 og andre treg signatur molekyler slike som CD25, CTLA-4, EOS, såvel som undertrykkelse av IFN-γ og SATB1 uttrykk 22. De genererte cellepopulasjoner kan anvendes for funksjonelle analyser vedrørende undertrykkende aktivitet eller for molekylære studier, enten om generell foxp3 regulatorer eller for å studere effekter som er spesifikke for visse forbindelser slik som butyrat eller rapamycin. Videre forståelse av molekylære mekanismer som driver Treg differensiering er svært relevant for fremtidige terapeutiske tilnærminger i autoimmunitet eller kreft spesifikt mot molekyler involvert i Treg generasjon og funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble nylig isolert fra anonymiserte sunn giver buffy coats kjøpt fra Karolinska universitetssykehus, Sverige. Etisk tillatelse for eksperimentene ble innhentet fra Regional Etisk Review Board i Stockholm (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Sverige (godkjenningsnummer: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. T Cell Isolasjon fra perifert blod

  1. PBMC Isolation
    1. Pre-lå 15 ml tetthetssentrifugering medium (for eksempel Ficoll) oppløsning i 50 ml rør (5 rør pr buffy coat). Forhånds varme til romtemperatur.
    2. Fyll opp buffy coat med fosfatbufret saltvann (PBS) (romtemperatur) til 180 ml. Hvis friskt blod blir brukt, fortynnet blod med like stort volum av PBS.
    3. Tilt rør til siden og langsomt overlegg densitetssentrifugering medium med ~ 35 ml fortynnet blod per rør. Tilsett blod svært nøye, uten noen blanding av tetthetssentrifugering over medium fase og blod lag.
    4. Sentrifuger i 20 minutter ved 1150 xg ved romtemperatur uten brems. Driften av sentrifugen uten brems og om mulig med lav til middels akselerasjon for å forhindre sammenblanding av lagene.
    5. Ta ut den hvite ring inneholdende mellom PBMC av tetthetssentrifugeringsmediet og plasmafasen. Overføring til en ny 50 ml tube (en gang med 5 ml pipette og 2 ganger med 2 ml plast-Pasteur pipetter). Ta så lite som mulig plasma og tetthet sentrifugering medium. Ikke berør den røde erytrocytt pellet.
    6. Vask PBMC. Splitte PBMC i 50 ml rør (4 rør per buffycoat). Fyll hver til 50 ml med PBS.
    7. Sentrifuger 450 xg i 10 minutter ved romtemperatur.
    8. Fjern og kast supernatant, basseng cellene inn i en slange med 10 ml RPMI / 10% føtalt kalveserum (FCS) medium og resuspender brønnen. Hvis celle klumper er til stede, strekk celler gjennom en 40 mikrometer celle sil.
    9. Overfør cellene i T175 cellekultur kolbe for annonsenHerent celler. Skyll rør med 40 ml medium og kombinere med celler (50 ml totalt). Hvis det er nødvendig, fjerner en delmengde for flowcytometri analyse (se trinn 1.4). Vanligvis, CD4 + T-celler utgjør omtrent 30-40% av celler i lymfocytt gate, og naive T-celler omfatte omtrent 30 til 60% av CD4 + T-celler, avhengig av donoren.
    10. Inkuber cellene i legging av kolben i 45 til 90 min ved 37 ° C / 5% CO2. Dette trinnet vil utarme monocytter av plast tilslutning. Det er ikke obligatorisk, men vil øke andelen T-celle avkastning per mengde PBMC i følgende trinn.
    11. Resuspender celler (i 50 ml medium som inneholdes i kolben) og skyll cellelaget på bunnen av kolben brønnen. Fordel celler like opp i to 50 ml rør (de foregående rør kan brukes om igjen for den samme donor). Skyll kolben med 50 ml frisk RPMI / 10% FCS medium, og overføre like inn i den samme 2 rør.
      MERK: PBMC kan lagres over natten ved 4 ° C med rør liggende påden side, eller ideelt sett, direkte anvendt for T-celle-isolasjon.
  2. nTreg Isolering av Magnetic-aktivert Cell Sorting
    1. Fremstille isolasjon buffer: 0,5% (vekt / volum) humant serumalbumin og 2 mM EDTA i PBS. Alltid holde buffer ved 4 ° C. Alternativt til menneskelig albumin, bruker bovin albumin.
    2. Resuspender og telle PBMC med en automatisk eller manuell celleteller i nærvær av trypanblått (teller ikke små blodplater). Hvis celleklumper er observert, belastningsskader celler gjennom en 40 mikrometer celle sil.
    3. Sentrifuger PBMC ved 450 xg i 10 min ved romtemperatur.
    4. Resuspender celler (med 1 ml pipette) i 90 mL isolasjonsbuffer per 10 7 PBMC for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Hold celler i de opprinnelige 50 ml rør (2 rør pr buffycoat).
    5. Tilsett 2 mL CD25-perler per 10 7 celler, blandes, og inkuber i 15 min ved 4 ° C.
    6. Fyll med PBS til 30 ml. Sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 46 C.
    7. Forbered LS kolonner (2 per buffycoat): likevekt med 3 ml isolasjon buffer, og kast strømme gjennom. Rør kan brukes på nytt for å skylle ytterligere kolonner.
    8. Resuspender celler i 3 ml isoleringsbuffer per rør (med 1 ml-pipette). Overfør cellene til LS kolonne, og samle strømningen gjennom i friske 15 ml rør.
    9. Skyll 50 ml rør med 2 ml Isolation buffer hver. Overføring skylling buffer til kolonnene.
    10. Kolonnen vaskes 2 ganger med 3 ml isolasjonsbuffer hver. Vent alltid til kolonnen stoppet dryppende, før du legger noen ny væske. Lagres strømme gjennom ved 4 ° C i senere trinn.
    11. Fjern kolonne fra magnet. Elute 2 ganger med 3 ml isoleringsbuffer per kolonne i 15 ml rør.
      MERK: eluat fra 2 kolonner per donor kan kombineres. Ikke dypp kolonnen inn i væsken.
    12. Utarbeide og likevekt nye LS kolonner (en kolonne per buffycoat). Overfør eluatet fra 1.2.11 til kolonnen. Strømme gjennom kan kastes. Etter eluat har passertd gjennom kolonnen, skylle røret og vask kolonne 3 ganger med 3 ml isoleringsbuffer.
      MERK: Den andre kolonnen er avgjørende for å øke renheten.
    13. Fjern kolonne fra magnet. Eluer CD25 ++ "nTregs" 2x med 3 ml Isolation buffer.
    14. Sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten helt.
    15. Vask cellene med 15 ml T-cellekulturmedium, sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten helt.
    16. Resuspender celler i 0,5 ml T-cellekulturmedium, supplert med 100 IU / ml IL-2, hver. Overfør cellene til 24-brønners plate. Skylling rør med 0,5 ml medium (+ 100 IU / ml IL-2) og kombinere i 24-brønns plate.
    17. Count nTregs (som i trinn 1.2.2). Utbyttet er vanligvis ca 1-4 x 10 6 Tregs per buffycoat. Justere tettheten av Tregs til 1-2 x 10 6 celler / ml med T-cellekulturmedium + 100 IU / ml IL-2.
    18. Inkuber Tregs ved 37 ° C / 5% CO2 inntil bruk.
    Naive CD4 + T Cell Isolation av Magnetic-aktivert Cell Sorting
    MERK: Ta strømme gjennom fra trinn 1.2.8-1.2.10 å fortsette med celleisolasjon. Alternativt, hvis ingen nTregs ble isolert, gå direkte fra PBMC.
    1. Kombiner 2 rør per donor av Treg-utarmet PBMC i 50 ml tube. Fyll med PBS til 50 ml ved romtemperatur.
    2. Sentrifuger PBMC ved 200 x g i 5-10 minutter ved romtemperatur. Fjern og kast supernatanten. Resuspender celler i 50 ml PBS.
    3. Gjenta trinn 1.3.2 to ganger.
      MERK: PBS-vaskinger er avgjørende for fjerning av blodplater, som ikke vil bli fjernet med følgende negative isolasjonskit. Blodplatene forblir i supernatanten ved denne lave hastighet sentrifugering. Blodplate uttømming kan overvåkes i de enkelte trinnene på en mikroskopisk lysbilde. Trinnene må utføres med PBS og sentrifugering ved romtemperatur.
    4. Resuspender PBMC i 50 ml PBS. Cellene telles som i trinn 1.2.2.
    5. Sentrifuger PBMC ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender cellene i 40 ul Isolation-buffer (4 ° C) per 10 7 celler.
    6. Tilsett 10 mL av naive CD4 + T Cell Biotin-antistoff Cocktail II per 10 7 celler.
    7. Bland, og inkuberes i 10 min ved 4 ° C.
    8. Vask cellene ved tilsetning av 40 ml PBS (4 ° C), og sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 80 mL isolasjonsbuffer per 10 7 celler.
    9. Tilsett 20 ul av anti-biotin mikroperler pr 10 7 celler. Bland godt og inkuber i 15 min ved 4 ° C.
    10. Fyll opp til 50 ml med kald PBS, sentrifuger og 450 xg i 10 min ved 4 ° C.
    11. Forbered LS kolonner (likevekt med 3 ml isolasjon buffer). For å unngå kolonne overbelastning, bruker en kolonne i maksimalt 250 x 10 6 PBMC, eller mindre hvis PBMC inneholde mange røde blodlegemer.
    12. Fjern supernatanten og resuspender calen i 3 ml isolasjon buffer. Overfør cellene til LS kolonne. Samle strømme gjennom, som inneholder de naive CD4 + T-celler, i 15 ml rør.
    13. Skyll røret med 2 ml isolasjon buffer. Overfør til kolonnen.
    14. Kolonnen vaskes 3 ganger med 3 ml isoleringsbuffer. Vent alltid til kolonne stopper dryppende, før du legger noen ny væske.
    15. Ta strømmen gjennom (naive CD4 + T-celler) og sentrifuger 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Kolonner kan kastes.
    16. Fjern supernatanten helt. Vask cellene med 15 ml medium, sentrifuger 450 xg i 10 min ved romtemperatur og fjern supernatanten helt.
      MERK: Isolation bufferen inneholder EDTA, som chelates kalsiumioner og således forringer T-celleaktivering. Før noen stimulerings analyser, fjerne isolasjon buffer helt og vaske cellene to ganger med 15 ml medium.
    17. Resuspender celler i T-cellekulturmedium til 2-3 x 10 6 celler pr ml. Rest celler i passende kolbe or godt over natten i kuvøse. Hvis celler brukes direkte for stimulering analyser, vaske dem en gang med medium.
  3. Purity Kontroll Farging
    1. Ta ~ 50.000 celler (Tnaïve, nTreg; PBMC) hver, i 20 pl.
      MERK: Hvis både Tnaïve og nTreg panel er å være farget, ta 2 prøver hver.
    2. Forbered 2x konsentrert antistoff premix (i PBS) som passer for instrumentet, for eksempel: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. For treg panel, erstatte CD45RO-PE med CD25-PE, 01:10.
      MERK: Bare visse CD25 antistoff som gjenkjenner ulike epitoper enn CD25-mikroperler, kan brukes til å farge nTregs isolert med CD25 mikroperler.
    3. Tilsett 20 mL antistoff premiks til 20 mL celler. Også forberede enkelt stainings for hver fluorochrome (ved hjelp av en prøve som inneholder positive celler, f.eks PBMC) og en uplettet prøve, for flowcytometri stillings og kompensasjon.
    4. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
    5. Fyll hver prøve med 200 pl PBS, sentrifuger og 450 x g i 5-10 min.
    6. Ta opp celler i fluorescensaktivert cellesortering (FACS) buffer (= isolering buffer uten EDTA) og analysere ved strømningscytometri. Renheten av naive CD4 + T-celler er vanligvis> 95% (se figur 2).

2. treg Induksjon Culture

  1. Utarbeidelse av Stimulering Media og Plates
    1. Fremstille og pre-varm T-cellekulturmedium: serumfritt hematopoetiske medium supplert med 2 mM L-alanyl-L-glutamin.
    2. Forbered cytokin, stimulering antistoff og sammensatte aksje konsentrasjoner.
      1. Forbered IL-2 stamløsning: 400.000 IE / ml i steril-filtrert (med syrefast filter) 100 mM eddiksyre (167 mikrogram / ml dersom aktiviteten av brukte mye er 2400 IE per 1 mikrogram, bekreft med leverandør). Delmengde å sterilisert lav proteinbinding 0,5 ml rør, forsegle med Parafilm, fryse på tørris og oppbevares ved -80 ° C for langtidslagring eller -20 ° C i inntil 3 måneder.
      2. Fremstille TGF-β1 stamløsning (for 10 ug hetteglass, bærer-fri): Sentrifuge TGF-β1 pulver (1000 xg 3 min), tilsett 100 pl 4 mM HCl (sterilfiltrert med syrebestandige filter) for å fremstille stamløsning med 100 ug / ml, tillates å oppløses fullstendig; vortex. Delmengde 5 mL hver for å sterilisert lav proteinbinding 0,5 ml rør, forsegle med Parafilm, fryse på tørris og oppbevares ved -80 ° C i opp til 6 måneder.
      3. Forbered Atrå stamløsning: Løs opp pulveret på 20 mg / ml (66,6 mm) i DMSO. Fremstille stamløsning av 10 mM ved ytterligere fortynning i DMSO og lagre aliquoter, beskyttet mot lys, ved -80 ° C i opp til ett år. Atrå er følsom for lys, varme og luft.
      4. Forbered rapamycin stamløsning: 1 mg / ml (1,11 mm) i DMSO, lagre i porsjoner ved -80 ° C forinntil 1 år.
      5. Forbered natriumbutyrat stamløsning: 0,908 M (0,1 mg / ml) i sterilt lager ultrarent H2O og sterilfilter. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
    3. Forbered 4x konsentrerte premixes (50 mL per brønn) i T cellekulturmedium som i tabell 1.
    4. På forrige dagen, pels plater med anti-CD3 antistoff. Coat ønskede antall brønner fra 96 ​​U-brønns plate med 5 ug / ml anti-CD3-antistoff i PBS, 65 ul / brønn. Pakk plate med folie og inkuber natten ved 4 ° C.
      MERK: Ikke bruk margin brønner på 96 brønners plater. Større brønner kan brukes, men U-formede brønner forenkle bruk av de samme celletall per område på tvers av eksperimenter. Dersom flere celler er nødvendig, basseng den nødvendige mengde av brønner etter kultur. Vanligvis, etter 4-6 dager med vekst, 2 brønner hver prøve er tilstrekkelig for strømningscytometri-analyse og RNA-analyse.
      1. På dagen for plating, kort tid før plating, fjerne anti-CD3 Løsning fra brønner. Fyll brønnene med 200 ul / brønn PBS. Fjern PBS. Gjenta vask med 200 ul / brønn PBS. Fjern PBS helt og bruke platene umiddelbart.
    5. Forbered plater (ikke bruk margin brønner):
      1. For hver brønn, tilsett 50 pl 4 x anti-CD28 / IL-2 forblanding (bortsett fra "ikke-stimulerte" celler, legge til T-cellekulturmedium), 50 ul 4x TGF-β1 forblanding (for alle iTregs) eller 50 ul T-cellekultur medium for "bare stimulering" mock-kontroll, 50 mL 4x Atrå, Atrå / rapamycin eller smørsyre premiks (hvor gjeldende) eller medium
      2. Fyll alle tomme brønner, inkludert margin brønner, med 200 mL PBS. Pre-varme plater ved 37 ° C / 5% CO2.
  2. Forbered Naive T celler for plating
    1. Etter å ha hvilt celler, overføring til 15 ml tube, skylle kolben / brønner med forvarmet T cellekulturmedium og basseng til røret. Fylle rør til 15 ml med T-cellekulturmedium. </ Li>
    2. Sentrifuger cellene ved 450 xg i 10 min ved romtemperatur.
    3. Fjern medium og ta opp celler i frisk, forvarmet T-celle-kulturmedium til en tetthet på 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Cellene telles som i trinn 1.2.2 og justere densitet, om nødvendig.
    4. Legg celler til preparerte stimuleringsplater (se 2.1), 50 ul celler / brønn (110,000-130,000 celler / brønn). Hver brønn skal nå inneholde et totalvolum på 200 ul.
    5. Pakk plater i aluminiumsfolie for å beskytte Atrå mot lys; Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i ønskede tidsperioder.
  3. Overvåk treg Induksjon Culture
    1. Overvåk treg kulturer ved lysmikroskopi (40X forstørrelse). Fra omtrent dag 2 og 3, skal små klynger av prolifererende celler bli synlig, som går over i større klynger ved senere tidspunkter. Kulturer som dyrkes med rapamycin generelt vokser mindre. Se også figur 3.
    2. På ønskede tidspunkter, ta prøver for RNA extraction eller flowcytometri fenotyping (se nedenfor). For senere tidspunkter med celledeling, en godt hver er tilstrekkelig, ellers ta 1 x 10 5 -1 x 10 6 celler hver for RNA og 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler for flowcytometri.
  4. Vurdere foxp3 Stabilitet
    1. For å vurdere stabiliteten av iTreg fenotype som beskrevet tidligere 22,27, vask iTregs to ganger med T-cellekulturmedium, og kultur iTregs ytterligere i T-cellekulturmedium, enten uten eller sammen med anti-CD3 og anti-CD28 restimulering som beskrevet i 2.1 og 2.2 . Legge til cytokiner, slik som 50 IE / ml IL-2, for å studere deres innflytelse på foxp3 stabilitet.
    2. På ønskede tidspunkter, ta prøver for RNA-ekstraksjon, strømningscytometri fenotyping (se nedenfor), og TSDR metylering analyse som beskrevet 22,28.

3. Fenotypisk Analyse av iTregs ved QRT-PCR

  1. Forberedelse avPrøver
    1. På ønskede tidspunkter, ta 1 x 10 5 til 1 x 10 6 celler per prøve for RNA ekstraksjon. Overføre celler til en RNase-fri 1,5 ml rør, og sentrifuger ved 500 xg i 5 min.
    2. Om nødvendig, fjerne en del av supernatanten og fryse for enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) eller lignende analyse. Fjern gjenværende supernatant helt fra celler. Gå direkte til RNA ekstraksjon eller fryse celle pellet på tørris og oppbevares ved -20 ° C til -80 ° C i opptil 2 uker.
    3. Ekstrahere RNA og utføre QRT-PCR for foxp3 og en husholdningsgenet (for eksempel RPL13A) i henhold til standard protokoller. I tillegg måle uttrykket av andre Treg signatur gener (for eksempel `Treg up' gener IL2RA, CTLA4, IKZF4 og` treg down' gener IFNg, SATB1).

4. fenotypeanalyser ved flowcytometri

MERK: Denne protokollen er optimalisert for flekkening i 96U godt plateformat med 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler. Hvis det er færre celler per brønn, start med flere brønner og basseng som beskrevet nedenfor.

  1. Cell restimuleringen (valgfritt)
    1. Ved farging for intracellulære cytokiner er ønskelig, puls celler med Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) / Ionomycin i nærvær av et protein transport inhibitor.
      MERK: Denne prosedyren påvirker ikke foxp3 uttrykk i ovennevnte iTreg kulturer, men andre markører kan endre seg - for eksempel CD4 nedregulert.
    2. Forbered 10x Brefeldin A / PMA / Ionomycin forblanding (20 ul per brønn) i T-cellekulturmedium: Brefeldin En stamløsning på 1: 100, Ionomycin (lager 5 mg / mL) 1: 1300, PMA (lager 12,35 ug / ul, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 av pre-utvannet lager.
    3. 4 timer før farging, legger 20 mL Brefeldin A / PMA / Ionomycin 10x mix per brønn for å oppnå sluttkonsentrasjoner på 1: 1000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomycin, 10 ng / ml PMA.
    4. Inkuber i 4 timer ved 37 ° C / 5% CO2
  2. Surface Farging
    MERK: Panelet foreslo her er et forslag; andre paneler kan brukes avhengig av antigener av interesse og instrumentoppsett.
    1. Kule PBS på is. Forbered FACS buffer (PBS med 0,5% humant serum albumin, HSA) og kjølig på is. BSA eller FBS kan anvendes som et alternativ til HSA.
    2. Re-plate celler i farging plate: Resuspender celler med en pipette og overfør cellene inn i en ny 96U godt plate, og etterlater en godt gratis rundt hver brønn (for å hindre smitteeffekter i senere flekker prosedyre). Hvis mindre enn ønskede celleantall er til stede i den opprinnelige brønnen, fjerne en del av supernatanten før resuspensjon, og bassenget flere brønner inn i en fargings brønnen.
    3. Sentrifuger plate 400 x g i 10 min ved romtemperatur.
    4. Fjern supernatanten. Hell ut supernatant i avfallsboksen, la platen oppned og umiddelbart (uten å slå tilbake plate) på platen én gang på absorberende papir. Deretter umiddelbart snu platen. Vortex plate for å resuspendere cellene i gjenværende væske.
    5. Legg 25 mL flate flekker premix (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 i FACS buffer) og resuspender.
      Merk også omfatte enkelt stainings for hver av de benyttede fluorokromer med prøver som inneholder positive celler for det respektive antigen; og inkluderer en unstained prøve. Disse vil være behov for instrument kompensasjon oppsett. Alternativt kan du bruke kompensasjon perler.
    6. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørket.
    7. Tilsett 200 ul PBS, sentrifuger plate 400 x g i 10 min ved 4 ° C og fjern supernatanten som beskrevet i trinn 4.2.4. Vortex plate.
    8. Gjenta trinn 4.2.7 to ganger.
  3. Livskraftig Farging
    MERK: Livskraftig farging er uunnværlig, siden etter fiksering / permeabilization døde celler kan ikke tilstrekkelig utelukkes vedFSC / ssc og kan gi opphav til uspesifikke signaler. En rettes levedyktighet fargestoff må brukes.
    1. Resuspender celler i 130 mL levedyktighet flekken premix (fikses levedyktighet dye-eFlour780 1: 1400 i PBS) og umiddelbart resuspender celler med flerkanals pipette.
      MERK: inkluderer også en enkel farging for levedyktigheten fargestoff som inneholder døde celler, f.eks stimulerte T-celler dyrket i flere dager eller drepe celler ved å bruke varme som etter produsentens instruksjoner. Disse vil være behov for kompensasjon.
    2. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørket.
    3. Sentrifuger plate ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatant som i trinn 4.2.4. Vortex plate.
    4. Fyll med 200 ul FACS buffer. Gjenta trinn 4.3.3.
    5. Fyll med 200 mL PBS. Gjenta trinn 4.3.3.
  4. Intracellulær Farging med foxp3 Farging Buffer Set
    1. For hver brønn, forberede: 150 ul Fix / Perm buffer (fortynne Fix / Perm konsentrate 1: 4 med fortynningsmiddel); 850 mL 1x permeabiliseringsbuffer (fortynne 10x permeabiliseringsbuffer 01:10 med ultra-ren H 2 O).
    2. Etter virvling, resuspender celler i 150 ul Fix / Perm buffer og umiddelbart suspendere med pipette. Det er viktig å umiddelbart resuspendere for å unngå fiksering av celleklumper.
      Forsiktig: Fixation buffer inneholder paraformaldehyde og skal håndteres og kastes på riktig måte.
    3. Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørket.
    4. Tilsett 100 ul kald PBS. Sentrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C.
      MERK: Fra dette trinnet fremover sentrifugeringshastigheten økes for å unngå tap av celler. Etter fiksering, celler blir usynlig og må velges med omhu for å fjerne supernatanter som beskrevet i trinn 4.2.4 og umiddelbart etter at sentrifugeringen er ferdig for å minimalisere tap av celler.
    5. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 4.2.4. Vortex plate.
      MERK: flekker kan bli stanset på dette trinnet; idette tilfelle, vaskes cellene to ganger med 200 ul PBS; deretter ta opp i 250 pl PBS og lagres ved 4 ° C, beskyttet mot lys. Cellene kan lagres i noen dager, og deretter fortsette med permeabilization. Imidlertid er optimale resultater oppnås når direkte fortsatte å permeabilization.
    6. Etter virvling, tilsett 200 mL permeabiliseringsbuffer. Sentrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 4.2.4. Vortex plate.
    7. Tilsett 200 mL permeabiliseringsbuffer å suspendere.
      MERK: Her kan prøvene deles inn i intracellulær farging og isotype kontrollprøve (ta bort halvparten av hver prøve). Hvis celle tall er begrensende, kan en samle isotype prøve være forberedt (ta bort 10-20 mL av hver prøve og basseng). Dessuten kan det tas ut prøver for fluorescens-minus-en (FMO) kontrollene.
    8. Sentrifuger ved 850 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten som beskrevet i trinn 4.2.4. Vortex plate.
    9. Resuspender pellet i44 ul Permeabilization buffer pluss 1 pl normalt museserum (forblandet) for å blokkere uspesifikk binding.
      MERK: Dette gjelder hvis antistoffer som brukes i følgende trinn er av muse isotype. Hvis andre antistoffer, så som avledet fra rotte, anvendes, omfatter passende serum for å blokkere (f.eks rotteserum).
    10. Inkuber ved 4 ° C i 15 minutter i mørket.
    11. Legg antistoffer:
      MERK: Spør de antistoffkonsentrasjoner for de spesifikke Lots. Hvis det ikke gjøres i trinn 4.2 med antistoffer mot overflateantigener (f.eks CD4) med de respektive fluorokromer, omfatter også enkle stainings for hver av de benyttede fluorokromer med prøver som inneholder positive celler for kompensasjon.
      1. Tilsett 15 mL antistoff premiks til prøver (bortsett fra i enkelt stainings, ufargede prøver, isotype kontrollprøver og FMO kontroller): Premiks per sample: 0,7 mL (0,35 mikrogram) anti-interferon gamma (IFN-γ) -FITC (hvis aktuelt etter restimulering )2.3 mL (0,115 mikrogram) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pl (0,05 mikrogram) Anti-foxp3-APC, 10 mL PBS.
      2. Å isotype kontrollprøver, tilsett 15 mL isotype antistoff premix, med de samme mengder antistoff som for antistoffer som brukes i 4.4.11.1: Premiks per sample: 0,7 mL (0,35 mikrogram) mus IgG1 K isotypekontrollantistoff FITC (hvis aktuelt), 0,58 ul (0,115 mikrogram) mus IgG2a-BV421 isotype, 0,5 mL (0,05 mikrogram) mus IgG1 K isotypekontrollantistoff APC, 13,2 mL PBS.
      3. For FMO kontroller, legge antistoffer som i 4.4.11.1, erstatte en antistoff hver med PBS.
    12. Inkuber ved 4 ° C i 30 min i mørket.
    13. Tilsett 200 ul permeabiliseringsbuffer. Sentrifuger, fjern supernatanten og virvle som i trinn 4.4.8. Gjenta en gang.
    14. Resuspender celler i kaldt FACS buffer (volum i henhold til instrumentet brukes) og tilegne seg, helst med en gang, på flowcytometeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser en ordning av den eksperimentelle oppsettet. Figur 2 viser en representativ styre renhet farging for magnetisk isolerte naive CD4 + T-celler og nTregs.

F igur 3A viser flowcytometri gating strategi og Figur 3B viser representative foxp3 og CD25 flowcytometri stainings på dag 6 av kultur i henhold til de angitte iTreg eller kontrollforhold. Ved in vitro-stimulering, de fleste cellene oppregulere CD25, som reduseres i nærvær av rapamycin. Bare under tilsetning av iTreg-induserende faktorer, blir en klar populasjon av foxp3 + -celler tydelig, som også er anriket i CD25 + celler i henhold iTreg betingelser. Figur 3C viser fenotypiske utseendet iTreg kulturer i mikroskopet med voksende celler sett på som mørke klynger. hvert jeg Treg tilstand viser en spesifikk og reproduserbar mønster av celleproliferasjon: Under disse dyrkningsbetingelser, øker TGF-β spredning svakt, og ATRA øker proliferasjon ytterligere. På samme tid, er inhibering av proliferasjon av rapamycin fremgå av den sterkt reduserte klyngestørrelsen. Den mikroskopiske utseende spredning styrke tilsvarer også totalt celletall (data ikke inkludert).

Figur 4 viser representative resultater av QRT-PCR analyser av foxp3 mRNA induksjon i iTreg (og kontroll) kulturer på ulike tidspunkter. Som for foxp3 protein, er foxp3 mRNA-ekspresjon høyere i alle iTregs sammenlignet med kontroll stimulerte celler, med rapamycin-behandlede iTregs som har relativt lave nivåer sammenlignet med andre iTregs. Foxp3 mRNA i nTregs er høyere enn i iTregs.

es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Figur 1: Experimental ordning for iTreg induksjon, nTreg isolasjon, og treg analyse. Humane naive CD4 + T-celler ble isolert fra buffy coats og stimulert i serumfritt medium med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer pluss 100 U / ml IL-2 i opp til 6 dager, enten i fravær ( 'mock kontrollcellene ') eller nærvær av forskjellige treg-induserende faktorer (' iTreg') som angitt. nTregs er isolert og analysert i parallell. Fenotypisk analyse kan gjøres ved flow-cytometri og QRT-PCR. Modifisert fra Schmidt, A. et al. 2016 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Celle renhet starter populasjoner. Naive menneske CD 4 + T celler ble isolert av den naive CD4 T Cell Isolation Kit II, menneske. Øvre panel: naive CD4 + T-celle-renhet, basert på CD4, CD45RA og CD45RO, var 94 til 98% og renheten for et representativt donor på over 30 er vist ( 'Tnaïve'). Ex vivo Tregs ( 'nTreg') ble isolert ved hjelp av begrensede mengder av CD25-mikroperler og anvendt som en positiv kontroll for iTreg eksperimenter. nTreg renhet av et representativt donor, basert på CD25 og CD4, er vist. Nedre panel: Intracellulær foxp3 farging (utført som i figur 3 og pre-gated på levende CD4 + celler) er vist for henholdsvis naive CD4 + T-celler og nTregs, ved hjelp av celler fra den samme donor som i det øvre felt. Modifisert fra Schmidt, A. et al. 2016 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3: Fenotypisk utseendet iTregs og nTregs. Humane naive CD4 + T-celler ble dyrket i serumfritt medium under de angitte betingelser. T-celler ble stimulert med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer pluss 100 U / ml IL-2 ( 'Stim.'). Hvor angitt, ble TGF-β1 ( 'TGF'), rapamycin (' Rapa'), all-trans-retinsyre ( 'ATRA') eller butyrat tilsatt. nTregs (ex vivo isolerte perifert blod CD25 ++ celler) ble forlatt unstimulated ( `unstim.') og brukt som positiv kontroll. Ustimulerte naive T-celler ble anvendt som negativ kontroll. (A) På dag 6 av kulturen, ble cellene farget med overflate antistoffer, inkludert anti-CD25 og anti-CD4, deretter farget med festbar levedyktighet fargestoff og deretter fast / permeabiliserte og farget intracellulært med anti-foxp3 og anti-CTLA-4 eller isotype forts rol antistoffer. Oppkjøp og kompensasjon ble utført på en Cyan ADP flowcytometer og dataene ble analysert med FlowJo programvare. Portstyringsstrategi er angitt med de røde pilene, og det viste eksempelet er en iTreg prøven indusert med TGF + ATRA. (B) Cellene ble farget som i (A), og foxp3 og CD25 ekspresjon i kontroll T-celler og iTregs indusert av forskjellige protokoller er vist. De pseudocolor plott viser representative foxp3 og CD25 stainings for en donor, pre-gated på singlett, lever CD4 + -celler som i (A). Isotypen eksempel er vist for en iTreg (Stim. + TGF + ATRA) prøve. (C) Representative mikroskopi bilder (40X forstørrelse) av individuelle 96U-platebrønner med celler dyrket i 4 dager. Mørke klynger av celler representerer prolifererende celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 4
Figur 4: foxp3 mRNA-ekspresjon ved bruk av forskjellige protokoller for iTreg differensiering. iTregs ble samlet som i Figur 3 under de angitte betingelser, og ved de gitte tidspunkter, ble celleprøver tatt, og RNA ble ekstrahert. Ustimulerte naive T-celler og ikke-stimulerte nTregs, ble prøvetatt på dag 0. Prøvene ble analysert ved hjelp av QRT-PCR, og foxp3 mRNA-ekspresjon var normalisert til RPL13A uttrykk for hver prøve. Foxp3 mRNA uttrykk i ustimulerte naive T-celler ble satt til 1, og fold endring av foxp3 mRNA ble beregnet. Vist er middelverdier og utvalg av PCR replikere brønner for et representativt donor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne protokollen gjør den robuste induksjon av menneskelig CD4 + foxp3 + iTregs fra menneskelige naive CD4 + T-celler. Det inkluderer en ny protokoll som vi nylig beskrevet, ved hjelp av en kombinasjon av TGF-β, ATRA og rapamycin, for induksjon av iTregs med overlegen in vitro undertrykkende funksjon 22. Sammenlignet med andre publiserte protokoller, er en annen fordel induksjon av forskjellige iTreg populasjoner i parallell med forskjellige protokoller, som muliggjør direkte sammenligning av virkningene av visse iTreg-induserende faktorer, sammen med kontrollceller som aktiveres i nærvær av IL-2 alene . De beskrevne protokoller aktivere reproduserbar induksjon av foxp3 med lav donor variasjon. Naive CD4 + T-celler i denne protokollen blir isolert ved magnetisk aktivert cellesortering, men fluorescens-aktivert cellesortering er også mulig. Den forventede avkastningen av naive CD4 + T-celler med denne protokollen er vanligvis mellom 5-10%, men avhenger sterkt av donor (alder) og vises også lavere når høye fraksjoner av erytrocytter er til stede. Hvis et overslag er nødvendig, kan PBMC være farget (se trinn 1.4) i løpet av monocytt uttømming trinnet. Vanligvis er utbyttet av naive CD4 + T-celler omtrent halvparten av de "prosent naive CD4 + T-celler av lymfocytt gate" i PBMC flekken. Denne protokollen bruker begrensede mengder CD25 perler å oppnå CD25-høy (nTreg) celler 29. Dette er imidlertid ikke rene Tregs, men disse er bare anriket i Tregs å bli brukt som positiv kontroll. Hvis rene tregs er nødvendig, bør andre kits brukes (for eksempel kombinert med CD4 berikelse og CD127-depletion) eller alternativt, CD25 + -celler pre-beriket med 8 pl CD25 perler per 10 7 celler og flekker og sortert etter fluorescens-aktivert celle sortering med strenge CD4 + CD25 ++ gating. Også inkludering av andre markører som CD127 eksklusjon, bør vurderes.

_content "> Det er viktig å tenke på at foxp3 er nødvendig, men ikke tilstrekkelig til å gi treg identitet 30. Mens iTregs kan brukes til å studere visse aspekter av, for eksempel, foxp3 regulering, er det imidlertid viktig å merke seg at iTregs avvike fra nTregs i flere aspekter. det er derfor viktig å dyrknings nTregs (ideelt sett er avledet fra den samme donor) i parallell til iTregs i alle analyser for sammenligning. forskjellen mellom nTregs og iTregs er eksemplifisert ved bare delvis overlapping av de nTreg og iTreg transkriptomet målt i murine iTregs 31. Andre treg signatur gener i tillegg til foxp3 bør måles på grunn av dette, og for å sikre diskriminering fra aktivering-indusert foxp3 uttrykk i humane celler. for eksempel bør iTregs vise høyere uttrykk av CD25, CTLA-4 og EOS sammen til aktiverte T-celler, mens ekspresjon av IFN-γ og SATB1 bør være lav i nTregs og iTregs indusert ved protokollen beskrevet her, som er publisert tidligere 13. Også på et genom-wide skala, ble det beskrevet at epigenetiske mønstre av DNA metylering og histonmodifikasjonene i murine iTregs ikke reflekterer de mønstrene som finnes i nTregs 30. Vi har tidligere beskrevet at iTregs indusert av den her beskrevne protokoller, i motsetning til nTregs, viste ikke TSDR demetylering. Følgelig iTregs tapt foxp3 når stimulert på nytt, men opprettholdt foxp3 uttrykk når ytterligere dyrket i nærvær av IL-2 og uten restimulering 22. Interessant, iTregs indusert av en alternativ protokollen med M2 makro supernatanter vises forbedret foxp3 stabilitet, til tross for mangel på TSDR demetylering og TGF-β være utløsende for foxp3 induksjon 27.

Endring av iTregsom induserer protokoller ved tilsetning av forbindelser (for eksempel vitamin C eller hydrogensulfid) som påvirker Ti-elleve translokasjon (TET) metylcytosin dioxygenase enzymer, slik som beskrevet ganske nylig '32 - 34, kan legge til ved stabilisering av foxp3 ved å påvirke DNA-metylering. Dessuten har stimulering styrke og timing en innflytelse på foxp3 ekspresjon og stabilitet 35. Langs disse linjene, ble bruken av kule-koplet CD3 / CD28-antistoffer i stedet for plate-bundet antistoffer vist seg å øke murine iTreg in vivo undertrykkende funksjon og stabilitet riktignok uavhengig av TSDR demetylering 36. En annen faktor som må betraktes som en potensiell kilde til variasjon er anvendelsen av serum, som inneholder udefinerte faktorer, inkludert TGF-β som selv fra bovin kilde er 100% kryssreaktivt med humane celler. Dessuten kan kilden og aktivitet av IL-2 drastisk påvirke resultatet av foxp3 induksjon.

En viktig feature av tregs er deres undertrykkende evne, som må testes senere med iTregs genereres i denne protokollen. Det bør bemerkes at undertrykkelse analyser med iTregs er ikke trivielt og litteraturen om undertrykkende evner iTregs er kontroversielt. Flere metoder og protokoller for å vurdere undertrykkende funksjon av humane Tregs stemt i andre sammenhenger 22,37 - 41, med in vitro proliferasjonsanalyser basert på flowcytometri avlesninger så som fortynning av karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) er den mest brukte. Det er viktig å vaske og hvile iTregs før bruk i undertrykkelse analyser, og det må tas i betraktning at iTregs, i motsetning til nTregs, ikke kan være anergiske, men sprer seg i løpet av slukkeanalyser. Vi anser det ekstremt viktig å bruke `mock' stimulerte T-celler som kontroll suppressorceller for å identifisere graden av uspesifikk undertrykkelse (for eksempel ved CTLA-4-ekspresjon, IL-2 consumption og kultur overvekst av aktiverte T-celler) som er relatert til foxp3 + treg-spesifikke effekter, og den hyppige mangel på denne kontrollen kan bidra til noen kontroverser i litteraturen. Ved hjelp av denne kontrollen, definert vi at kun TGF-B / Atrå / Rapa-indusert iTregs vises undertrykkende aktivitet in vitro 22. De konkluderer dermed med at om undertrykkende aktivitet (riktignok ikke høyeste fraksjon av foxp3 + -celler), er TGF-β / ATRA / Mana den beste kombinasjon av faktorer av de beskrevne protokoller for å indusere iTregs. Likevel ikke undertrykkende aktivitet in vitro ikke nødvendigvis reflekterer undertrykkende aktivitet in vivo, og faktisk vi fastslått at menneskelig iTregs som genereres av disse protokollene ikke undertrykke i en xenogenisk graft- versus -host sykdomsmodell i det minste under de betingelser som ble testet 22. Dette kan ha sammenheng med ustabil foxp3 uttrykk som ble tapt i iTregs ved restimulering, i tråd med en mangel på TSDR demetylering 22

Avhengig av hvilket aspekt ved iTreg egenskaper (høy fraksjon av foxp3 + celler, overlegen undertrykkende aktivitet, foxp3 stabilitet) er viktigst for en bestemt problemstilling, kan forskjellige protokoller være mest egnet for å studere disse spørsmål, slik at det er vanskelig å definere det vanligvis "beste 'protokoll for treg induksjon. Videre kan flere ovenfor beskrevne små eksperimentelle forskjeller påvirke resultatene, og kan bidra til stridsspørsmål med hensyn til fenotype og undertrykkende funksjon av TGF-p-indusert iTregs som vises mellom rapporter, selv med tilsynelatende lignende protokoller for iTreg generasjon 42. For eksempel, selv innenfor en laboratorium, observerte vi at iTregs indusert med TGF-β og IL-2 i serum-inneholdende RPMI medium vises noen undertrykkende aktivitet sammenlignet med kontrollceller 27, mens TGF-β / IL-2-indusert iTregs generert i definert, serumfritt T-cellekulturmedium ikke har 22 despite tilsvarende nivåer av foxp3.

Fremtidige applikasjoner basert på disse protokollene bør bestrebe seg på å ytterligere optimalisere treg induksjons forhold til å oppnå en fenotype med stabil foxp3 uttrykk, TSDR demetylering, stabil fenotype uten konvertering til cytokin-produserende effektor T-celler og optimal undertrykkende aktivitet. Videreutvikling av iTreg induksjonsprotokoller kan være nyttig for adoptiv overføring nærmer seg i fremtiden, i hvilken behandlingen av treg overføring er meget lovende for den potensielle behandling av autoimmune og inflammatoriske sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

Immunologi regulatoriske T-celler treg CD4 + T-celler magnetisk celle isolasjon, cytokiner foxp3 TGF-β IL-2 intracellulær Strømningscytometri QRT-PCR
<em>In vitro</em> Differensiering av Menneskelig CD4 <sup>+</sup> foxp3 <sup>+</sup> Induced regulatoriske T-celler (iTregs) fra naive CD4 <sup>+ T-celler</sup> under anvendelse av et TGF-β holdige Protocol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter