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Immunology and Infection

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Introduction

As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva 1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master' Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determinadas configurações 2. manipulação terapêutica de número e função Treg é, portanto, sujeitas a inúmeras investigações clínicas. No câncer, esgotamento de Tregs pode ser desejável e algum sucesso de abordagens clínicas incentiva novas pesquisas 3. Em doenças auto-imunes e inflamatórias, além de efeitos terapêuticos de Tregs em Sevemodelos de doenças de rato RAL, recentes primeiros ensaios em-man de transferência de Treg adotiva para evitar enxertia versus doença -host (GVHD) 4-7 e para avaliar a segurança no tratamento de diabetes tipo 1 8 mostraram resultados muito promissores.

Que ocorre naturalmente Tregs (nTregs) compreendem tTregs derivado de timo e pTregs induzidas perifericamente, com funções essenciais não redundantes na manutenção da saúde 9-11. No entanto, os números nTreg são limitados, estimulando a abordagem complementar de induzir Tregs (iTregs) in vitro a partir de precursores de células T naive 12. Ainda estabilidade de iTregs, presumivelmente devido à falta de desmetilação na chamada região específica desmetilado Treg-(TSDR) no locus do gene FOXP3 13, continua a ser uma preocupação e vários estudos indicam que in vivo induzida Tregs são mais estáveis 14.

Até à data, FOXP3 continua a ser a melhor proteína marker para Tregs mas não é absolutamente específico, porque as células T CD4 + CD25- humanas transientemente convencionais expressar níveis intermediários de FOXP3 após activação 15,16. Embora o progresso significativo foi feito para elucidar a regulação da expressão de FOXP3, ainda há muito a ser descoberto sobre a indução, a estabilidade ea função do FOXP3 particularmente em células humanas. Apesar das diferenças para nTregs, in vitro induzida FOXP3 + células T CD4 + pode ser usado como um sistema modelo para estudar os mecanismos moleculares da indução FOXP3 e como um ponto de partida para desenvolver protocolos no futuro, que permitem a geração de iTregs que são mais semelhantes às de vivo gerado Tregs, que pode ser aplicável para as estratégias de transferência adoptivos no futuro.

Não há `protocolo standard' ouro para induzir iTregs humanos, e Current Protocols foram desenvolvidos com base em condições simulando Treg indutores in vivo: interleucina 2 (IL-2) E sinalização transformando β do factor de crescimento (TGF-β) são cruciais para a indução FOXP3 in vivo 17, e o ácido trans-retinóico (ATRA) - que é produzido in vivo por células dendríticas associados ao intestino - é frequentemente usado para melhorar a indução FOXP3 in vitro 18-21. Nós desenvolvemos protocolos Treg indutores humanos adicionais utilizando butirato de 22, um ácido gordo de cadeia curta da flora intestinal derivado que foi recentemente mostrado para aumentar murino Treg indução 23,24. Nós também estabeleceu recentemente um novo protocolo para a geração de iTregs com função supressora superior em vitro, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina 22, sendo este último um alvo de mamífero clinicamente aprovado de rapamicina (mTOR) inibidor que é conhecido por promover manutenção FOXP3 durante humana Treg expansão 25,26.

Este método descreve o reprodutível emgeração in vitro de células T CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando um conjunto de condições diferentes, e a sua fenotipagem subsequente por citometria de fluxo e a reacção inversa em cadeia da polimerase de transcrição quantitativo (qRT-PCR) para revelar os padrões específicos do protocolo de expressão de FOXP3 e outros assinatura moléculas Treg tais como CD25, CTLA-4, EOS, bem como a repressão do IFN-γ e expressão SATB1 22. As populações celulares geradas podem ser utilizadas para ensaios funcionais quanto à actividade supressora ou para estudos moleculares, quer se trate de reguladores gerais FOXP3 ou para estudar os efeitos específicos para determinados compostos, tais como o butirato ou rapamicina. Uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de condução diferenciação Treg é altamente relevante para abordagens terapêuticas futuras em auto-imunidade ou câncer visarem especificamente moléculas envolvidas na geração e função Treg.

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Protocol

As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas de fresco a partir de doadores saudáveis ​​anónimos de crostas inflamatórias comprados a partir do University Hospital Karolinska, Suécia. autorização de ética para os experimentos foi obtido a partir do Conselho Regional ética revisão em Estocolmo (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Suécia (número de aprovação: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. t isolamento de células a partir de sangue periférico

  1. PBMC Isolamento
    1. Pré-lay 15 ml de meio de centrifugação de densidade de solução (tais como Ficoll) em tubos de 50 ml (5 tubos por buffy coat). Pré-aquecer à temperatura ambiente.
    2. Encha-se buffy coat com tampão fosfato salino (PBS) (temperatura ambiente) para 180 ml. Se o sangue fresco é usado, diluir o sangue com um volume igual de PBS.
    3. tubo de inclinação para o lado e meio de centrifugação de densidade lentamente sobreposição com ~ 35 ml diluídos no sangue por tubo. Adicionar o sangue com muito cuidado, sem qualquer mistura da centrifugação de densidade medfase ium e camada de sangue.
    4. Centrifugar 20 min a 1150 xg à temperatura ambiente sem travão. Operar a centrífuga sem travão e, se possível com baixa a aceleração forma a evitar a mistura das camadas.
    5. Retire o anel branco contendo PBMC entre o meio de centrifugação de densidade e a fase de plasma. Transferir para um novo tubo de 50 ml (1 vez com 5 ml de pipeta e 2 vezes com 2 ml em plástico-pipeta de Pasteur). Leve o mínimo possível de plasma e meio de centrifugação de densidade. Não toque no sedimento de eritrócitos vermelho.
    6. Wash PBMC. Dividir as PBMC em tubos de 50 ml (4 tubos por buffy coat). Encher cada para 50 ml com PBS.
    7. Centrifugar 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    8. Remover e descartar o sobrenadante, reunir as células em um tubo com 10 ml de meio / 10% de soro de vitelo fetal RPMI (FCS) e ressuspender bem. Se aglomerados de células estão presentes, as células de tensão através de um filtro de células 40 ^ m.
    9. Transferir as células em frascos de cultura de células T175 para o anúnciocélulas Herent. Lavar os tubos com 40 ml de meio e combinam com células (50 ml total). Se necessário, retire uma alíquota de citometria de fluxo (ver passo 1.4). Normalmente, células T CD4 + compreendem cerca de 30-40% das células na barreira linfocitária, e células T naive compreendem cerca de 30 a 60% de células T CD4 +, dependendo do dador.
    10. Incubar as células em que coloca balão durante 45 a 90 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Esta etapa irá esgotar monócitos por aderência ao plástico. Não é obrigatório, mas irá aumentar o rendimento percentual de células T por quantidade de PBMC nos seguintes passos.
    11. Ressuspender as células (em 50 ml de meio contido no balão) e lavar a camada de células no fundo do frasco bem. Distribuir células igualmente em dois tubos de 50 ml (os tubos anteriores podem ser re-utilizados para o mesmo doador). Enxaguar o balão com 50 ml de meio fresco RPMI / FCS a 10%, e transferir os mesmos igualmente em 2 tubos.
      NOTA: As PBMC pode ser armazenado durante a noite a 4 ° C com os tubos, que nao lado, ou de preferência, utilizado directamente para o isolamento de células T.
  2. nTreg Isolamento classificando celular Magnetic-activado
    1. Preparar tampão de isolamento: 0,5% (w / v) de albumina de soro humano e EDTA 2 mM em PBS. Manter sempre tampão a 4 ° C. Como alternativa à albumina humana, albumina bovina usar.
    2. Ressuspender e contar PBMC com um contador de células automático ou manual na presença de azul de tripano (não contam pequenas plaquetas). Se aglomerados de células são observados, as células de tensão através de um filtro de células 40 ^ m.
    3. PBMC centrifugar a 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    4. Ressuspender as células (com uma pipeta ml) em tampão de isolamento de 90 ul por 10 7 PBMC para se obter uma suspensão de célula única. Manter as células no original tubos de 50 ml (2 tubos por buffy coat).
    5. Adicionar 2 mL CD25 grânulos por 10 7 células, mistura, e incubar durante 15 min a 4 ° C.
    6. Encha com PBS a 30 ml. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 46; C.
    7. Prepare colunas LS (2 por buffy coat): equilibrar com 3 ml de tampão de isolamento, e descartar fluir. Os tubos podem ser re-utilizados para enxaguar mais colunas.
    8. Ressuspender as células em 3 ml de tampão de isolamento (por tubo com uma pipeta ml). Transferência de células para LS coluna e recolher fluxo através de frescos tubos de 15 ml.
    9. Lavar os tubos de 50 ml com 2 ml de tampão de isolamento cada. Transferência de tampão de lavagem para as colunas.
    10. Lavar 2x coluna com 3 ml de tampão de isolamento cada. Sempre espere até que a coluna parou de pingar, antes de adicionar qualquer novo líquido. Loja fluir através a 4 ° C durante as etapas posteriores.
    11. Remover coluna de ímã. Eluir com 2 x 3 ml de tampão de isolamento por coluna em tubo de 15 ml.
      NOTA: O eluato a partir de 2 colunas por doador podem ser combinados. Não mergulhar a coluna para dentro do líquido.
    12. Preparar e equilibrar novas colunas LS (1 coluna por buffy coat). Transferir o eluato de 1.2.11 à coluna. O fluxo através podem ser descartados. Depois de fluido tem passed através da coluna, enxaguar e lavar 3x tubo coluna com 3 ml de tampão de isolamento.
      NOTA: A segunda coluna é crucialmente necessário para aumentar a pureza.
    13. Remover coluna de ímã. Eluir CD25 ++ "nTregs" 2x com 3 ml de tampão de isolamento.
    14. Centrifuga-se a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante completamente.
    15. Lavar as células com meio de cultura de células T de 15 ml, centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante completamente.
    16. Ressuspender as células em meio de cultura de células T 0,5 ml, suplementado com 100 UI / ml de IL-2, cada um. Transferência de células para placa de 24 poços. tubo de enxaguamento com 0,5 mL de meio (+ 100 UI / ml de IL-2) e combinar em placa de 24 poços.
    17. Contagem nTregs (como no passo 1.2.2). O rendimento é geralmente cerca de 1-4 x 10 6 Tregs por buffy coat. Ajustar a densidade de Tregs a 1-2 x 10 6 culas / ml com meio de cultura de células T + 100 UI / ml de IL-2.
    18. Incubar Tregs a 37 ° C / 5% de CO 2 até à sua utilização.
    Naïve CD4 + T isolamento de células, classificando celular Magnetic-activado
    NOTA: Tome fluir através do passo 1.2.8-1.2.10 para prosseguir com o isolamento de células. Em alternativa, se não nTregs foram isolados, proceder diretamente de PBMCs.
    1. Combinar 2 tubos por doador de PBMC Treg-empobrecido em 50 ml tubo. Encha com PBS a 50 ml à temperatura ambiente.
    2. PBMC centrifugar a 200 xg durante 5-10 min à temperatura ambiente. Retire e elimine o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ml de PBS.
    3. Repita o passo 1.3.2 duas vezes.
      NOTA: As lavagens de PBS são cruciais para remoção das plaquetas, o que não será removida com o kit de isolamento de sequência negativa. As plaquetas permanecem no sobrenadante desta centrifugação a baixa velocidade. depleção de plaquetas pode ser monitorada nas etapas individuais sobre uma lâmina de microscópio. Os passos têm de ser realizados com PBS e centrifugação à temperatura ambiente.
    4. Ressuspender as CMSPs em 50 ml de PBS. Contagem de células como no passo 1.2.2.
    5. PBMC centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 40 ul de tampão de isolamento (4 ° C) por 10 7 células.
    6. Adicionar 10 ml de Naïve CD4 + T celular Biotina-Antibody Cocktail II por 10 7 células.
    7. Mistura, e incubar durante 10 min a 4 ° C.
    8. Lave as células por adição de 40 ml de PBS (4 ° C), e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover as células e ressuspender em sobrenadante de tampão de isolamento de 80 ul por 10 7 células.
    9. Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células. Misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C.
    10. Encha até 50 ml com PBS frio, e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
    11. Prepare colunas LS (equilibrar com 3 ml de tampão de isolamento). Para evitar a sobrecarga da coluna, utilizar uma coluna para maximamente 250 x 10 6 PBMC, ou menos, se as CMSPs conter muitas células vermelhas do sangue.
    12. Remover o sobrenadante e ressuspender cells em tampão 3 ml de isolamento. Transferência de células para a coluna LS. Recolhe fluxo através, que contém as células T CD4 + naive, em tubos de 15 ml.
    13. Lave com tampão de isolamento tubo 2 ml. Transferir para a coluna.
    14. 3x Lavar a coluna com 3 ml de tampão de isolamento. Sempre espere até que a coluna pára gotejamento, antes de adicionar qualquer novo líquido.
    15. Aqui o fluxo através da CD4 + (células T naive) e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. As colunas podem ser descartados.
    16. Remover o sobrenadante completamente. Lavar as células com 15 ml de meio, centrífuga de 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante completamente.
      NOTA: tampão de isolamento contém EDTA, que quela os iões de cálcio e assim prejudica a activação das células T. Antes de quaisquer ensaios de estimulação, remova o tampão de isolamento completamente e lavar as células duas vezes com 15 ml de meio.
    17. Ressuspender as células em meio de cultura de células T a 2-3 x 10 6 culas por ml. células de descanso em frasco adequado oR assim durante a noite na incubadora. Se as células são usados ​​diretamente para ensaios de estimulação, lavá-los mais uma vez com meio.
  3. Pureza Controle Coloração
    1. Take ~ 50.000 células (Tnaïve; nTreg; PBMC) cada, em 20 ul.
      NOTA: Se ambos Tnaïve e painel de nTreg devem ser manchado, tomar 2 amostras de cada um.
    2. Prepare 2x pré-mistura concentrada de anticorpo (em PBS) como apropriado para o instrumento, por exemplo: o painel Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Para o painel Treg, substitua CD45RO-PE com CD25-PE, 1:10.
      NOTA: Somente determinados anticorpos CD25, que reconhecem epitopos diferentes do que as CD25-microesferas, podem ser usados ​​para corar nTregs isolados com micropérolas CD25.
    3. Adicionar 20 ul de pré-mistura de anticorpos para células 20 ul. Também preparar colorações individuais para cada fluorocromo (utilizando uma amostra contendo células positivas, por exemplo, PBMCs) e uma amostra não corado, por citometria de fluxo Definiçõesgs e compensação.
    4. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    5. Encher cada amostra com 200 ul de PBS, e centrifugar a 450 xg durante 5-10 min.
    6. Tome-se células em células activadas por fluorescência (FACS) tampão (= tampão de isolamento, sem EDTA) e analisar por citometria de fluxo. A pureza das células CD4 + T naive é normalmente> 95% (ver Figura 2).

2. Treg de cultura de indução

  1. Preparação de Estimulação Mídia e Placas
    1. Preparar e meio de cultura de células T pré-aquecido: hematopoiético médio livre de soro suplementado com 2 mM de L-alanil-L-glutamina.
    2. Prepare citocinas, anticorpos e a estimulação concentrações banco de compostos.
      1. Preparar a solução de estoque de IL-2: 400.000 Ul / ml em ácido acético esterilizada por filtração (com filtro resistente ao ácido) de 100 mm (167 ug / ml, se a actividade do lote utilizado é de 2.400 UI por 1 ug; confirmar com fornecedor). Alíquota para esterilizado vinculativo 0,5 ml tubos de baixa proteína, selar com Parafilm, congelar em gelo seco e armazenar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo ou a -20 ° C por até 3 meses.
      2. Preparar a solução de estoque de TGF-β1 (para 10 ug frasco, isento de transportador): Centrífuga TGF-β1 pó (1.000 xg, 3 minutos), adicionar 100 mL de HCl 4 mM (esterilizado por filtração com um filtro resistente ao ácido) para preparar a solução estoque com 100 ug / ml, permitir que se dissolva completamente; vórtice. Alíquota de 5 ul cada para esterilizado vinculativo 0,5 ml tubos de baixa proteína, selar com Parafilm, congelar em gelo seco e armazenar a -80 ° C por até 6 meses.
      3. Preparar a solução de estoque de ATRA: Dissolve-se o pó em 20 mg / ml (66,6 mM) em DMSO. Preparar a solução de estoque de 10 mM, por diluição adicional em aliquotas de DMSO e armazenam, protegida da luz, à temperatura de -80 ° C durante até 1 ano. ATRA é sensível à luz, calor e ar.
      4. Preparar a solução da rapamicina: 1 mg / ml (1,11 mM) em DMSO, armazenam-se em aliquotas a -80 ° C duranteaté 1 ano.
      5. Preparar a solução estoque butirato de sódio: H (ml 0,1 mg /) 0,908 estoque em ultra-pura esterilizada H2O e filtro estéril. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    3. Preparar 4x pré-misturas concentradas (50 uL por poço) em meio de cultura de células T como na Tabela 1.
    4. No dia anterior, as placas de revestimento com anticorpo anti-CD3. Revestimento desejado número de poços de placa de 96 poços L com 5 ug / ml de anticorpo anti-CD3, em PBS, 65 ul / poço. Enrole placa com papel alumínio e incubar durante a noite a 4 ° C.
      NOTA: Não use os poços de margem de placas de 96 poços. podem ser utilizados poços maiores, mas poços em forma de U facilitar o uso dos mesmos números de celulares por área através experimentos. Se forem necessários mais células, piscina a quantidade necessária de poços após o cultivo. Geralmente, após 4-6 dias de expansão, 2 poços de cada amostra são suficientes para análise de citometria de fluxo e análise de ARN.
      1. No dia do plaqueamento, pouco antes do plaqueamento, remover anti-CD3 solução de poços. Encher os poços com 200 ul / cavidade de PBS. Remover PBS. Repetir a lavagem com 200 ul / cavidade de PBS. Remover completamente PBS e utilizar placas imediatamente.
    5. Prepare placas (não use poços de margem):
      1. Para cada cavidade, adicionar 50 ul de 4x anti-CD28 / IL-2 de pré-mistura (excepto para as células "não estimuladas", adicionar meio de T de cultura de células), 50 ul 4x TGF-β1 pré-mistura (para todos os iTregs) ou cultura de células T 50 ul meio para "a estimulação apenas" controle simulada, 50 ul 4x ATRA, ATRA / rapamicina ou premix butirato (quando aplicável) ou médio
      2. Encher todos os poços vazios, incluindo os poços de margem, com 200 mL PBS. Placas pré-aquecer a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Prepare células naive T para Galvanização
    1. Depois de células em repouso, transferir para tubo de 15 ml, lavar frascos / poços com meio de cultura de células pré-aquecido T e piscina para tubo. Encha tubo para 15 ml com meio de cultura de células T. </ Li>
    2. células centrifugar a 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    3. Remover o meio e tomar-se as células em meio fresco, pré-aquecido de cultura de células T a uma densidade de 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Contagem de células como no passo 1.2.2 e ajustar a densidade, se necessário.
    4. Adicionar células a placas de estimulação preparadas (ver 2.1), células 50 ^ l / cavidade (110,000-130,000 células / poço). Cada poço deverá conter um volume total de 200 ul.
    5. Enrole placas em folha de alumínio para proteger ATRA da luz; incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante períodos de tempo desejados.
  3. Monitorar Treg Cultura Indução
    1. Monitorar Treg culturas por microscopia de luz (40X). De volta do dia 2 a 3, pequenos aglomerados de células em proliferação devem tornar-se visível, que se fundem em aglomerados maiores em momentos posteriores. Culturas cultivadas com rapamicina geralmente crescem menos. Ver também a Figura 3.
    2. Em pontos de tempo desejados, colher amostras para RNA eXtraction ou citometria de fluxo fenotipagem (ver abaixo). Para pontos de tempo posteriores, com a proliferação de células, uma de cada poço é suficiente, de outro modo, de 1 x 10 5 x 10 -1 6 células para cada RNA e 3 x 10 5 x 10 -1 6 células por citometria de fluxo.
  4. Avaliando FOXP3 Estabilidade
    1. Para avaliar a estabilidade do fenótipo iTreg como descrito anteriormente 22,27, lavar iTregs duas vezes com meio de cultura de células T, e outras iTregs cultura em meio de cultura de células T, sem ou com anti-CD3 e anti-CD28 re-estimulação, como descrito em 2.1 e 2.2 . Adicionar citocinas, tal como 50 UI / ml de IL-2, para estudar a sua influência na estabilidade FOXP3.
    2. Em pontos de tempo desejado, para tomar amostras de extracção de ARN, a citometria de fluxo fenotipagem (ver abaixo), e análise de metilação, tal como descrito TSDR 22,28.

3. Análise fenotípica de iTregs por qRT-PCR

  1. Preparação deamostras
    1. Em pontos de tempo desejados, tome 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células por amostra para extração de RNA. Transferir as células para um tubo de 1,5 ml de RNase isenta de, e centrifugar a 500 xg durante 5 min.
    2. Se necessário, remover parte do sobrenadante e congelar para o ensaio ligado a enzima (ELISA) ou análise similar. Remover completamente restante sobrenadante a partir de células. Vá diretamente para a extração de RNA ou congelar pellet celular em gelo seco e armazenar a -20 ° C a -80 ° C por até 2 semanas.
    3. Extrair o RNA e executar qRT-PCR para FOXP3 e um gene de manutenção (como RPL13A) de acordo com protocolos padrão. Além disso, medir a expressão de outros genes assinatura Treg (por exemplo `Treg up' genes IL2RA, CTLA4, IKZF4, e` Treg down' genes IFNg, SATB1).

4. A análise fenotípica por citometria de fluxo

NOTA: Este protocolo é otimizado para manchaing em formato de placa de 96U com 3 x 10 5 x 10 -1 6 células. Se houver menos células por poço, começar com vários poços e piscina, tal como descrito abaixo.

  1. Re-estimulação celular (Opcional)
    1. Se a coloração de citocinas intracelulares for desejado, as células pulsadas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) / Ionomicina na presença de um inibidor de transporte de proteínas.
      NOTA: Este procedimento não influenciar a expressão FOXP3 em culturas iTreg acima descritos, mas outros marcadores podem mudar - por exemplo, CD4 é regulada negativamente.
    2. Prepare 10x Brefeldina A / PMA / ionomicina de pré-mistura (20 ul por cavidade) em meio de cultura de células T: Brefeldina A solução-mãe 1: 100, Ionomicina (stock 5 mg / mL) 1: 1300, PMA (estoque 12,35 mg / mL, pré -dilute 1: 1235) 1: 100 de estoque pré-diluído.
    3. 4 horas antes da coloração, adicionar 20 ul de Brefeldina A / PMA / ionomicina 10x mistura por poço para obter concentrações finais de 1: 1000 Brefeldina A, 0,5 μH (375 ng / ml) Ionomicina, 10 ng / ml de PMA.
    4. Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C / 5% de CO 2
  2. coloração da superfície
    NOTA: O painel sugeriu aqui é uma sugestão; outros painéis podem ser usados ​​dependendo das antígenos de interesse e configuração do instrumento.
    1. Arrefecer PBS em gelo. Prepare tampão FACS (PBS com albumina 0,5% de soro humano, HSA) e fresco no gelo. BSA ou FBS pode ser usado como uma alternativa à ASH.
    2. células re-placa em placa de coloração: Ressuspender as células com uma pipeta e transferir as células em uma nova placa de 96U, deixando um poço livre em torno de cada poço (para evitar transbordamento no processo de coloração mais tarde). Se menos do que o número de células desejadas estão presentes no poço original, remover parte do sobrenadante antes de ressuspensão, e piscina várias cavidades em uma coloração bem.
    3. Centrifugar placa 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    4. Remover o sobrenadante. Derrama o sobrenadante para caixa de resíduos, deixe a placa de cabeçapara baixo e imediatamente (sem olhar para trás a placa) bata a placa uma vez com um papel absorvente. Então, imediatamente voltar o prato. placa Vortex para voltar a suspender as células no líquido restante.
    5. Adicionar 25 ul de pré-mistura a coloração da superfície (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 em tampão de FACS) e ressuspender.
      NOTA: Também incluem colorações individuais para cada um dos fluorocromos utilizados com amostras que contêm células positivas para o antigénio respectivo; e incluir uma amostra imaculada. Estes serão necessários para a configuração de compensação de instrumento. Como alternativa, use esferas de compensação.
    6. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    7. Adicionar 200 ul de PBS, a placa de centrífuga de 400 xg durante 10 min a 4 ° C e remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    8. Repita o passo 4.2.7 duas vezes.
  3. a coloração de viabilidade
    NOTA: coloração de Viabilidade é indispensável, uma vez que após a fixação / permeabilização células mortas não pode ser suficientemente excluída porFSC / SSC e pode dar origem a sinais inespecíficos. Um corante de viabilidade fixável tem de ser usado.
    1. Ressuspender as células em 130 ul mancha viabilidade premix (viabilidade solucionáveis ​​dye-eFlour780 1: 1.400 em PBS) e as células imediatamente ressuspender com a pipeta multicanal.
      NOTA: incluem também uma única coloração para o corante de viabilidade contendo células mortas, por exemplo, células T não estimuladas cultivadas durante vários dias ou matar as células por aplicação de calor como por instruções dos fabricantes. Estes serão necessários para a compensação.
    2. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    3. placa Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante do passo 4.2.4. placa Vortex.
    4. Encha com 200 ul de tampão FACS. Repita o passo 4.3.3.
    5. Encha com 200 mL PBS. Repita o passo 4.3.3.
  4. A coloração intracelular com FOXP3 Coloração do Buffer Set
    1. Para cada bem, preparar: 150 ul Fix tampão / Perm (diluir Fix / Perm concentrate 1: 4 com diluente); 850 ul de tampão de permeabilização 1x (10x tampão de permeabilização diluir 1:10 com ultra-pura H2O).
    2. Depois de vórtex, Ressuspender as células em 150 ul Fix tampão / Perm e imediatamente ressuspender com pipeta. É importante para ressuspender imediatamente para evitar a fixação de aglomerados de células.
      Cuidado: tampão Fixation contém paraformaldeído e deve ser manuseado e descartado de forma adequada.
    3. Incubar 30 min a 4 ° C no escuro.
    4. Adicionar 100 ul de PBS frio. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C.
      NOTA: A partir deste passo em diante, a velocidade de centrifugação é aumentada para evitar a perda de células. Após a fixação, as células tornam-se invisível e deve ser tomado cuidado para remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4 e imediatamente após a centrifugação é acabado para minimizar a perda de células.
    5. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
      NOTA: A coloração pode ser interrompido a esta etapa; dentroNeste caso, lavar as células duas vezes com 200 ul de PBS; em seguida, tomar-se em 250 ul de PBS e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. As células podem ser armazenadas durante alguns dias, em seguida, efectuar a permeabilização. No entanto, os melhores resultados são alcançados quando prosseguiu directamente para a permeabilização.
    6. Após agitação em vórtex, adicionar 200 ul de tampão de permeabilização. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    7. Adicionar 200 tampão permeabilização ul para voltar a suspender.
      NOTA: Aqui, as amostras podem ser divididas em coloração intracelular e amostra de controlo de isotipo (tirar metade de cada amostra). Se o número de células são limitantes, uma amostra isótipo agrupada pode ser preparado (tirar 10-20 ul de cada amostra e piscina). Além disso, as amostras podem ser tomadas para fluorescência-menos-um controles (FMO).
    8. Centrifuga-se a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante tal como descrito no passo 4.2.4. placa Vortex.
    9. Ressuspender em pelete44 ul de tampão de permeabilização mais 1 ul de soro normal de ratinho (pré-misturado) para bloquear a ligação inespecífica.
      NOTA: Isto aplica-se se os anticorpos usados ​​no passo seguinte são de isótipo murino. Se forem utilizados outros anticorpos, tais como derivados de rato,, incluem o soro apropriado para o bloqueio (por exemplo, soro de rato).
    10. Incubar a 4 ° C durante 15 min no escuro.
    11. Adicionar anticorpos:
      NOTA: Informe-se as concentrações de anticorpos para os lotes específicos. Se não for feito no passo 4.2 com anticorpos contra antigénios de superfície (por exemplo, CD4) com as respectivas fluorocromos, também incluem colorações individuais para cada um dos fluorocromos utilizados com amostras que contêm células positivas para compensação.
      1. Adicionar 15 ul de pré-mistura de anticorpo para as amostras (excepto para colorações individuais, as amostras não coradas, as amostras de controlo de isotipo e os controlos FMO): pré-mistura por amostra: 0,7 ul (0,35 ug) anti-interferão gama (IFN-γ) -FITC (se for o caso, após a re-estimulação ),2,3 ul (0,115 mg) de CTLA-4 Brilhante Violeta 421, 2 ul (0,05 ug) Anti-FOXP3-APC, 10 ul de PBS.
      2. Para isotipo amostras de controlo, adicionar 15 ul de pré-mistura de anticorpo de isotipo, usando as mesmas quantidades de anticorpos como para os anticorpos utilizados em 4.4.11.1: pré-mistura por amostra: 0,7 ul (0,35 ug) com FITC de rato de controlo de isotipo de IgG1 K (se aplicável), 0,58 ul (0,115 g) de IgG2a de ratinho de isotipo-BV421, 0,5 ul (0,05 ug) APC IgG1 de ratinho de controlo de isotipo K, 13,2 ul de PBS.
      3. No controlo da FMO, adicione anticorpos como no 4.4.11.1, substituindo um anticorpo cada um com PBS.
    12. Incubar a 4 ° C durante 30 min no escuro.
    13. Adicionar 200 ul de tampão de permeabilização. Centrífuga, remover o sobrenadante e vortex como no passo 4.4.8. Repetir uma vez.
    14. Ressuspender as células em tampão FACS frio (volume de acordo com o instrumento usado) e adquirem, de preferência imediatamente, no citómetro de fluxo.

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Representative Results

A Figura 1 mostra um esquema da montagem experimental. A Figura 2 mostra uma coloração controle de pureza representante para as células T CD4 + naïve magneticamente isoladas e nTregs.

F igura 3A mostra a citometria de fluxo estratégia de propagação e Figura 3B mostra FOXP3 representativa e CD25 citometria de fluxo colorações no dia 6 da cultura nas condições iTreg ou de controlo indicados. Após estimulação in vitro, a maioria das células supra-regular a CD25, que é reduzido na presença de rapamicina. Apenas sob adição de factores indutores de iTreg, uma população de células claras FOXP3 + torna-se aparente, o qual é também enriquecida dentro de células CD25 + em condições iTreg. Figura 3C mostra a aparência fenotípica das culturas iTreg no microscópio com células vistas como aglomerados escuros proliferando. cada i condição Treg mostra um padrão específico e reprodutível de proliferação de células: Sob estas condições de cultura, o TGF-β aumenta ligeiramente a proliferação, e aumenta ainda mais a proliferação de ATRA. Ao mesmo tempo, a inibição da proliferação por rapamicina é aparente pelo tamanho aglomerado fortemente reduzida. O aspecto microscópico de força proliferação também corresponde a contagem total de células (dados não incluídos).

A Figura 4 mostra resultados representativos de qRT-PCR, análises de indução de ARNm FOXP3 em iTreg (e controlo) culturas em diferentes pontos de tempo. Tal como para a proteína FOXP3, a expressão de ARNm FOXP3 é maior em todos os iTregs em comparação com células de controlo estimuladas, com iTregs tratados com rapamicina possuindo níveis relativamente baixos em comparação com outros iTregs. MRNA FOXP3 em nTregs é maior do que em iTregs.

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Figura 1: Esquema Experimental para a indução iTreg, isolamento nTreg e análise de Treg. As células T CD4 + naive humanas foram isoladas a partir de crostas inflamatórias e estimulada em meio isento de soro com 100 U / `células de controlo simuladas ml de IL-2 até 6 dias, quer na ausência (anti-CD3 e anti-CD28 mais ') ou a presença de diferentes factores indutores de Treg ( `iTreg') como indicado. nTregs são isoladas e testadas em paralelo. A análise fenotípica pode ser feita por citometria de fluxo e de qRT-PCR. Modificado de Schmidt, A. et ai. 2016 22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: pureza celular de começar populações. CD humana Naïve 4 + T células foram isoladas pela Naïve CD4 T Kit cela de isolamento II, humano. Painel superior: pureza Naive célula T CD4 +, com base em CD4, CD45RA e CD45RO, foi de 94 a 98% e a pureza para um dador representativo de mais do que 30 está mostrado ( `Tnaïve'). Ex vivo Tregs ( `nTreg') foram isolados utilizando quantidades limitadas de micropérolas CD25 e usado como um controlo positivo para as experiências iTreg. nTreg pureza de um dador representativo, com base em CD25 e CD4, é mostrada. Painel inferior: coloração FOXP3 intracelular (realizada como na Figura 3 e pré-gated em células vivas CD4 +) é mostrada para as células T CD4 + naive e nTregs respectivamente, utilizando células do mesmo dador como no painel superior. Modificado de Schmidt, A. et ai. 2016 22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ntent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3: aparência fenotípica de iTregs e nTregs. As células T CD4 + naive humanas foram cultivadas em meio isento de soro, sob as condições indicadas. As células T foram estimulados com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3 mais 100 U / ml de IL-2 ( `Stim.'). Quando indicado, foram adicionados TGF-β1 ( `TGF'), rapamicina (` Rapa'), o ácido trans-retinóico ( `ATRA') ou butirato. nTregs (células ex vivo de sangue periférico isolados CD25 ++) foram deixadas sem estímulo ( `unstim.') e utilizado como controlo positivo. células T naive não estimuladas foram utilizados como controle negativo. (A) No dia 6 de cultura, as células foram coradas com anticorpos de superfície, incluindo anti-CD25 e anti-CD4, em seguida, coradas com corante de viabilidade solucionáveis e, posteriormente fixos / permeabilizadas e coradas intracelular com anti-FOXP3 e anti-CTLA-4 ou isótipo cont anticorpos Rol. Aquisição e compensação foi realizada em um fluxo Cyan ADP citômetro e os dados foram analisados ​​com o software FlowJo. A estratégia de propagação é indicado pelas setas vermelhas, e no exemplo mostrado é um exemplo iTreg induzida com TGF + ATRA. (B) As células foram coradas como em (A), e expressão FOXP3 e CD25 nas células T de controlo e iTregs induzidas por diferentes protocolos é mostrado. As parcelas PseudoColor mostram FOXP3 e CD25 colorações representativos de um doador, pré-gated em singuleto, vivo células CD4 + como em (A). O exemplo de isotipo é apresentada para um iTreg (STIM. + TGF + ATRA) amostra. (C) As imagens de microscopia representativas (ampliação de 40X) dos poços 96U de placa individuais de células cultivadas durante 4 dias. cachos escuros de células representam células em proliferação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ntent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: Expressão de ARNm FOXP3 mediante utilização de diferentes protocolos para diferenciação iTreg. iTregs foram criadas tal como na Figura 3, nas condições indicadas, e nos pontos de tempo indicados, as amostras de células foram colhidas e o RNA foi extraído. Células não estimuladas naive T, e nTregs não estimuladas, foram amostrados no dia 0. As amostras foram analisadas por qRT-PCR, e a expressão de ARNm FOXP3 foi normalizado para a expressão RPL13A para cada amostra. A expressão de ARNm FOXP3 em células T naive não estimuladas foi ajustado para 1, e dobrar a mudança de ARNm FOXP3 foi calculada. São mostrados os valores médios e gama de PCR replicar poços por um doador representativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo descrito permite a indução de CD4 humano robusta + FOXP3 + iTregs a partir de células T CD4 + naive humanas. Ele inclui um novo protocolo que descrevemos recentemente, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina, para a indução de iTregs com superiores in vitro a função supressora 22. Em comparação com outros protocolos publicados, outra vantagem é a indução de diferentes populações iTreg em paralelo por diferentes protocolos, o que permite a comparação directa dos efeitos de certos factores iTreg indutores, juntamente com as células de controlo que são activadas na presença de só IL-2 . Os protocolos descritos permitem a indução reprodutível de FOXP3 com baixa variação de doadores. As células T CD4 + naive neste protocolo são isoladas por separação de células magnético-activado, mas separação de células activadas por fluorescência, também é possível. O rendimento esperado de células ingénuas CD4 + T com este protocolo é normalmente entre 5-10%, mas depende fortemente do dador (idade) e parece também inferior quando elevadas fracções de eritrócitos estão presentes. Se uma estimativa for necessário, PBMC pode ser manchado (veja o passo 1.4) durante a etapa de depleção de monócitos. Tipicamente, o rendimento de células T CD4 + naive é cerca de metade dos "percentagem de células T CD4 + naive da porta de linfócitos" na mancha de PBMC. Este protocolo utiliza quantidades limitadas de contas de CD25 para obter células CD25-alta (nTreg) 29. No entanto, estes não são Tregs puros, mas estes são apenas enriquecido em Tregs para ser usado como controlo positivo. Se forem necessários Tregs puros, outros kits devem ser utilizados (tal como combinado com enriquecimento CD4 e CD127-exaustão) ou, em alternativa, CD25 + células pré-enriquecido com 8 ul grânulos CD25 por 10 7 células e coradas e classificados por células activadas por fluorescência classificação com gating rigorosas CD4 + CD25 ++. Também a inclusão de outros marcadores, tais como exclusão CD127, deve ser considerado.

_content "> É importante considerar que FOXP3 é necessária, mas não suficiente para conferir Treg identidade 30. Enquanto iTregs pode ser usado para estudar alguns aspectos, por exemplo, a regulação FOXP3, é importante, no entanto, notar que iTregs diferem de nTregs em vários aspectos. é, portanto, crucial para nTregs cultura (de preferência derivados a partir do mesmo doador) em paralelo para iTregs em todos os ensaios para comparação. a diferença entre nTregs e iTregs é exemplificado por única sobreposição parcial do transcriptoma nTreg e iTreg como medido em iTregs murino 31. Outros genes de assinatura Treg para além FOXP3 deve ser medida por esta razão, e para assegurar a selectividade da expressão FOXP3 induzida por activação em células humanas. por exemplo, iTregs deve exibir maior expressão de CD25, CTLA-4 e EOS comparado para células T activadas, enquanto a expressão de IFN-γ e SATB1 deverá ser baixa e nTregs iTregs induzidas pelos protocolos descritos aqui, tal como publicado anteriormente 13. Também em uma escala de todo o genoma, foi descrito que padrões epigenéticos de metilação do DNA e modificações de histonas em iTregs murino não refletem os padrões encontrados em nTregs 30. Nós anteriormente descrito que iTregs induzidas pela aqui descritos protocolos, em contraste com nTregs, não exibiram TSDR desmetilação. Por conseguinte, perdido iTregs FOXP3 quando re-estimuladas, mas mantida expressão FOXP3 quando ainda cultivadas na presença de IL-2 e sem re-estimulação 22. Curiosamente, iTregs induzida por um protocolo alternativo utilizando sobrenadantes de macrófagos M2 exibido estabilidade melhorada FOXP3, apesar da falta de TSDR desmetilação e TGF-β sendo causador de indução FOXP3 27.

Modificação do iTreg-inducing protocolos por adição de compostos (tais como a vitamina C ou sulfureto de hidrogénio) que influenciam a dez onze Translocação (TET) enzimas metilcitosina dioxigenase, como descrita muito recentemente 32-34, pode adicionar na estabilização FOXP3 por afectar a metilação do DNA. Além disso, a força e o momento estimulação tem uma influência sobre a expressão e estabilidade FOXP3 35. Ao longo destas linhas, foi demonstrado o uso de anticorpos CD3 / CD28 acoplado-grânulo em vez de anticorpos ligados à placa para aumentar iTreg murino in vivo função supressora e estabilidade embora independente de TSDR desmetilação 36. Um outro factor que deve ser considerado como uma fonte potencial de variação é a utilização de soro, que contém factores indefinidos incluindo TGF-β que mesmo a partir de fonte bovina é 100% de reacção cruzada com células humanas. Além disso, a fonte e a actividade de IL-2 pode influenciar drasticamente os resultados da indução de FOXP3.

Um f importanteeature de Tregs é a sua capacidade supressiva, que precisa ser testado posteriormente com iTregs gerados neste protocolo. Deve notar-se que os ensaios de supressão com iTregs não são triviais e a literatura sobre a capacidade supressiva de iTregs é controversa. Vários métodos e protocolos para avaliar a função supressora de Tregs humanos já foram publicados 22,37 - 41, com ensaios in vitro de proliferação baseado em citometria de fluxo leituras como a diluição de éster de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) sendo o mais comumente usado. É importante para lavar e descansar iTregs antes da utilização em ensaios de supressão, e precisa de ser considerado que iTregs, em contraste com nTregs, pode não ser anérgicas mas proliferar-se durante os ensaios de supressão. Consideramos que é extremamente importante para usar `mock' células T estimuladas como células supressoras controlo para identificar o grau de supressão não específica (por exemplo, através de expressão de CTLA-4, IL-2 consumption e supercrescimento cultura por células T ativadas) que não está relacionado com FOXP3 + efeitos específicos-Treg, ea frequente falta desse controle pode contribuir para algumas controvérsias na literatura. Usando esse controle, nós definimos que apenas TGF-beta / iTregs induzidas Rapa ATRA / apresentaram atividade supressora in vitro 22. Assim, concluímos que quanto à atividade supressiva (embora não mais alta fração de FOXP3 + células), TGF-β / ATRA / Rapa é a melhor combinação de fatores de os protocolos descritos para induzir iTregs. No entanto, a actividade supressora in vitro não reflecte necessariamente a atividade supressora in vivo, e na verdade nós determinamos que iTregs humanos gerados por estes protocolos não suprimiu em uma enxertia contra -host modelo de doença xenogénica, pelo menos nas condições testadas 22. Isto pode estar relacionado com a expressão FOXP3 instável que foi perdido em iTregs sobre a re-estimulação, de acordo com uma falta de TSDR desmetilação 22

Dependendo de qual aspecto de recursos iTreg (alta fração de FOXP3 + células, atividade supressiva superior, estabilidade FOXP3) é mais importante para uma questão de pesquisa particular, diferentes protocolos pode ser mais adequado para estudar estas questões, tornando-o difícil definir a geralmente 'melhor 'protocolo de indução Treg. Além disso, várias diferenças subtis experimentais acima descritas podem influenciar os resultados e pode contribuir para a controvérsias no que diz respeito à função e fenótipo supressor de TGF-ß induzida pelo iTregs que aparecem entre os relatórios mesmo com protocolos aparentemente semelhantes para geração iTreg 42. Por exemplo, mesmo dentro de um laboratório, observou-se que iTregs induzidas com TGF-β e IL-2 em meio RPMI contendo soro apresentado alguma actividade supressora em comparação com células de controlo 27, enquanto iTregs induzida por IL-2 de TGF-β / gerado em meio de cultura definido, sem soro de células T não fez 22, despite níveis semelhantes de FOXP3.

As aplicações futuras com base nesses protocolos devem se esforçar para otimizar ainda mais as condições de indução Treg para alcançar um fenótipo com expressão FOXP3 estável, TSDR desmetilação, fenótipo estável sem conversão para células T efetoras produtoras de citocinas e atividade supressiva ideal. Além disso o desenvolvimento de protocolos de indução iTreg podem ser úteis para a transferência adoptiva abordagens no futuro, em que a terapia por transferência Treg é altamente promissor para o potencial tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

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Immunology 118 Edição células T reguladoras Treg células T CD4 + o isolamento de células magnético, citocinas FOXP3 TGF-β IL-2 citometria de fluxo intracelular qRT-PCR
<em>Na</em> diferenciação <em>in vitro</em> de células T CD4 <sup>+</sup> humano FOXP3 <sup>+</sup> Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 <sup>+</sup> usando um protocolo de TGF-β contendo
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Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

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