Summary
Detta protokoll beskriver reproducerbar generering och fenotypning av mänskliga inducerade regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + T-celler in vitro. Olika protokoll för foxp3 induktion möjliggöra studier av specifika iTreg fenotyper som erhållits med respektive protokoll.
Introduction
CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatoriska T-celler (tregs) undertrycka andra immunceller och är kritiska förmedlare av perifer tolerans, förebygga autoimmunitet och överdriven inflammation en. Vikten av tregs exemplifieras av den mänskliga sjukdomen immunodysregulation polyendocrinopathy enteropati X-bunden syndrom (IPEX), i vilken förlusten av tregs på grund av mutationer i det så kallade master' Treg transkriptionsfaktor forkhead rutan P3 (FOXP3) leder till allvarliga systemiska autoimmuna sjukdomar, dödlig vid en tidig ålder. Men tregs fungerar som ett tveeggat svärd i immunsystemet, eftersom de också kan hämma anti-tumörimmunitet i vissa inställningar 2. Terapeutisk manipulation av Treg antal och funktion är därför föremål för ett stort antal kliniska undersökningar. I cancer, kan utarmning av tregs vara önskvärt och viss framgång av kliniska metoder uppmuntrar till ytterligare forskning 3. Vid autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar, förutom terapeutiska effekterna av tregs i several musmodeller sjukdom, senaste först in-man försök med adoptiv Treg överföring för att förhindra graft- kontra -host sjukdom (GvHD) 4-7 och för att bedöma säkerheten vid behandling av typ 1-diabetes 8 visade mycket lovande resultat.
Naturligt förekommande tregs (nTregs) innefattar tymus-härledda tTregs och perifert inducerade pTregs, med icke-redundanta viktiga funktioner för att bibehålla hälsa 9-11. Men nTreg nummer är begränsade, uppmuntra komplement inducera tregs (iTregs) in vitro från naiva T-cellsföregångare 12. Fortfarande stabilitet iTregs, förmodligen på grund av brist av demetylering i den så kallade Treg specifika demetylerade region (TSDR) i foxp3 genlocus 13, är fortfarande ett problem och flera studier tyder på att in vivo inducerad tregs är mer stabila 14.
Hittills förblir foxp3 bästa protein mArker för tregs men det är inte helt specifik eftersom mänskliga konventionella CD4 + CD25- T-celler uttrycker övergående mellanliggande nivåer av foxp3 vid aktivering 15,16. Även om betydande framsteg har gjorts när det gäller att belysa regleringen av foxp3 uttryck, återstår mycket att upptäcka om induktion, stabilitet och funktion foxp3 särskilt i humana celler. Trots skillnader i nTregs, in vitro inducerad FOXP3 + CD4 + T-celler kan användas som ett modellsystem för att studera molekylära mekanismer foxp3 induktion och som en utgångspunkt för att utveckla protokoll i framtiden som möjliggör generering av iTregs som är mer lik i vivo genereras tregs, som kan tillämpas för adoptiv överförings strategier i framtiden.
Det finns ingen 'guld standard' protokoll för att framkalla mänskliga iTregs, och nuvarande protokoll har utvecklats baserat på härma Treg-inducerande betingelser in vivo: interleukin 2 (IL-2) Och transformerande tillväxtfaktor β (TGF-β) signalering är avgörande för foxp3 induktion in vivo 17, och all-trans-retinoinsyra (ATRA) - vilken produceras in vivo genom tarmassocierade dendritiska celler - används ofta för att förbättra foxp3 induktion in vitro 18-21. Vi har utvecklat ytterligare personal Treg-inducerande protokoll använder butyrat 22, en tarmfloran härrörande kortkedjig fettsyra som nyligen visades öka murin Treg induktion 23,24. Vi har nyligen etablerat också ett nytt protokoll för generering av iTregs med överlägsen undertryckande funktion in vitro genom att använda en kombination av TGF-β, ATRA och rapamycin 22, den sistnämnda är en kliniskt godkända mammalian target of rapamycin (mTOR) hämmare som är känt för att främja foxp3 underhåll under human Treg expansionen 25,26.
Denna metod beskriver reproducerbar ivitro generering av humana CD4 + FOXP3 + iTregs med användning av en uppsättning av olika förhållanden, och deras efterföljande fenotypning genom flödescytometri och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) för att avslöja protokollspecifika uttrycksmönster av foxp3 och andra Treg signaturmolekyler sådana som CD25, CTLA-4, EOS, liksom förtrycket av IFN-γ och SATB1 uttryck 22. Den genererade cellpopulationer kan användas för funktionella analyser avseende undertryckande aktivitet eller för molekylära studier, antingen om allmänna foxp3 tillsynsmyndigheter eller studera effekter som är specifika för vissa föreningar såsom butyrat eller rapamycin. Ytterligare förståelse av molekylära mekanismer som driver Treg differentiering är av stor betydelse för framtida terapeutiska metoder i autoimmunitet eller cancer att specifikt målmolekyler är involverade i Treg generation och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) var nyligen isolerades från anonymiserad frisk donator gula hinnor som köpts från Karolinska Universitetssjukhuset, Sverige. Etiskt tillstånd för experimenten erhölls från den regionala etikprövningsnämnden i Stockholm (humanetisk i Stockholm), Sverige (godkännandenummer: 2013 / 1458-1431 / 1).
1. T Cell Isolering från perifert blod
- PBMC Isolering
- Pre-låg 15 ml densitetscentrifugering medium (såsom Ficoll) lösning i 50 ml rör (5 rör per buffy coat). Pre-varm till rumstemperatur.
- Fyll upp buffy coat med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (rumstemperatur) till 180 ml. Om färskt blod används, späd blodet med lika stor volym PBS.
- Tiltrör åt sidan och sakta overlay densitetscentrifugering medium med ~ 35 ml utspätt blod per rör. Tillsätt blod mycket noga, utan någon blandning av densitetscentrifugering Medium fas och blodskikt.
- Centrifugera 20 min vid 1150 xg vid rumstemperatur utan broms. Driva centrifugen utan broms och om möjligt med låg till medelhög acceleration för att förhindra blandning av skikten.
- Ta ut den vita ringen som innehåller PBMC mellan densitetscentrifugering mediet och plasmafasen. Överföring till en ny 50 ml tub (en gång med 5 ml pipett och 2 gånger med 2 ml plast Pasteur pipett). Ta så lite som möjligt plasma och densitetscentrifugering medium. Rör inte den röda erytrocyter pelleten.
- Tvätt PBMC. Dela PBMCs i 50 ml rör (4 rör per buffy coat). Fyll varje till 50 ml med PBS.
- Centrifugera 450 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna och kassera supernatanten, pool cellerna in i ett rör med 10 ml RPMI / 10% fetalt kalvserum (FCS) medium och återsuspendera väl. Om cellklumpar är närvarande, stam celler genom en 40 ìm cell sil.
- Överför celler i T175 cellodlingskolv för annonsHerent celler. Skölj rör med 40 ml medium och kombinera med celler (totalt 50 ml). Om det behövs, ta bort en delmängd för flödescytometrianalys (se steg 1,4). Vanligtvis, CD4 + T-celler utgör cirka 30-40% av cellerna i lymfocytgrinden, och naiva T-celler utgör cirka 30 till 60% av CD4 + T-celler beroende på givaren.
- Inkubera cellerna i att lägga kolv i 45 till 90 minuter vid 37 ° C / 5% CO2. Detta steg kommer att utarma monocyter genom plastisk vidhäftning. Det är inte obligatoriskt, men kommer att öka andelen T-cell avkastning per mängd PBMC i följande steg.
- Återsuspendera cellerna (i de 50 ml medium i kolven) och skölj cellskiktet på kolvens botten väl. Fördela celler lika i två 50 ml rör (tidigare rören kan återanvändas för samma donator). Skölj kolven med 50 ml färsk RPMI / 10% FCS-medium, och överföra lika i samma 2 rör.
OBS: PBMC kan lagras över natten vid 4 ° C med rör om påden sida, eller helst, direkt användas för T-cellisolering.
- nTreg Isolering av magnetaktiverad cellsortering
- Förbereda isoleringsbuffert: 0,5% (vikt / volym) humant serumalbumin och 2 mM EDTA i PBS. alltid hålla buffert vid 4 ° C. Som alternativ till humant albumin, använder bovint albumin.
- Resuspendera och räkna PBMC med en automatisk eller manuell celltalsräknare i närvaro av trypanblått (inte räkna små blodplättar). Om cellklumpar observeras, stam celler genom en 40 ìm cell sil.
- Centrifugera PBMC vid 450 xg under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna (med 1 ml pipett) i 90 | il isoleringsbuffert per 10 7 PBMC för att erhålla en enkelcellsuspension. Håll celler i den ursprungliga 50 ml rör (2 rör per buffy coat).
- Tillsätt 2 | j, l CD25 pärlor per 10 7-celler, blanda och inkubera i 15 min vid 4 ° C.
- Fyll med PBS till 30 ml. Centrifugera vid 450 xg under 10 min vid 46; C.
- Förbered LS kolumner (2 per buffycoat): jämvikt med 3 ml isoleringsbuffert och kasta passera. Rören kan återanvändas för att skölja ytterligare kolumner.
- Resuspendera cellerna i 3 ml isoleringsbuffert per rör (med en ml pipett). Överför celler till LS kolumn, och samla flödet genom i färska 15 ml rör.
- Skölj 50 ml rör med 2 ml isoleringsbuffert vardera. Överföring sköljbuffert till kolumnerna.
- Tvättkolonn 2x med 3 ml isoleringsbuffert vardera. Vänta alltid tills kolonnen slutade droppa, innan du lägger någon ny vätska. Store strömma igenom vid 4 ° C för senare steg.
- Ta bort kolumn från magneten. Eluera 2x med 3 ml isoleringsbuffert per kolumn i 15 ml rör.
OBS: Eluatet från 2 kolumner per donator kan kombineras. Inte doppa kolumnen i vätskan. - Förbered och jämvikt nya LS kolumner (en kolumn per buffy coat). Överföra eluatet från 1.2.11 till kolonnen. Flöde genom kan kasseras. Efter eluat har passed genom kolonnen, skölj röret och tvätta kolonnen 3x med 3 ml isoleringsbuffert.
OBS: Den andra kolumnen är avgörande behövs för att öka renheten. - Ta bort kolumn från magneten. Eluera CD25 ++ "nTregs" 2x med 3 ml isoleringsbuffert.
- Centrifugera vid 450 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten fullständigt.
- Tvätta celler med 15 ml T-cellkulturmedium, centrifugera vid 450 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten fullständigt.
- Resuspendera cellerna i 0,5 ml T-cellkulturmedium, som kompletterats med 100 lU / ml IL-2, var och en. Överför celler till 24-brunnar. Skölj rör med 0,5 ml medium (+ 100 lU / ml IL-2) och kombinera till 24-brunnar.
- Räkna nTregs (som i steg 1.2.2). Utbytet är vanligtvis ca 1-4 x 10 6 tregs per buffycoat. Justera densiteten för tregs till 1-2 x 10 6 celler / ml med T-cellkulturmedium + 100 lU / ml IL-2.
- Inkubera tregs vid 37 ° C / 5% CO2 tills de användes.
OBS: Ta flöda genom från steg 1.2.8-1.2.10 att fortsätta med cellisolering. Alternativt, om ingen nTregs isolerades, gå direkt från PBMC.- Kombinera 2 rör per givare av Treg-utarmade PBMC i 50 ml rör. Fyll med PBS till 50 ml vid rumstemperatur.
- Centrifugera PBMC vid 200 xg under 5 till 10 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna och kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 50 ml PBS.
- Upprepa steg 1.3.2 två gånger.
OBS: PBS tvättar är avgörande för borttagning av blodplättar, som inte kommer att tas bort med följande negativa isoleringskit. Trombocyter kvar i supernatanten vid denna låghastighetscentrifugering. Förlust av blodplättar kan övervakas i de enskilda stegen på ett objektglas. Stegen måste utföras med PBS och centrifugeringar vid rumstemperatur. - Resuspendera PBMC i 50 ml PBS. Räkna celler som i steg 1.2.2.
- Centrifugera PBMC vid 450 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera celler i 40 | il Isolering buffert (4 ° C) per 10 7-celler.
- Tillsätt 10 | il av naiva CD4 + T-cell Biotin-Antibody Cocktail II per 10 7-celler.
- Blanda och inkubera i 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 40 ml PBS (4 ° C), och centrifugera vid 450 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 80 l isoleringsbuffert per 10 7 celler.
- Tillsätt 20 pl anti-biotin mikrokulor per 10 7 celler. Blanda väl, och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C.
- Fyll till 50 ml med kall PBS och centrifugera 450 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Förbered LS kolonner (jämvikt med 3 ml isoleringsbuffert). För att undvika överbelastning på kolonnen, använda en kolumn för maximalt 250 x 10 6 PBMC eller mindre om PBMC innehåller många röda blodkroppar.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera calnar i 3 ml isoleringsbuffert. Överför celler till LS kolumn. Samla flöde genom, som innehåller de naiva CD4 + T-celler, i 15 ml rör.
- Skölj röret med 2 ml isoleringsbuffert. Överföra till kolonnen.
- Tvättkolonn 3x med 3 ml isoleringsbuffert. Vänta alltid tills kolonnen stannar droppande, innan du lägger någon ny vätska.
- Ta flödet genom (naiva CD4 + T-celler) och centrifugera 450 xg under 10 min vid 4 ° C. Kolumner kan kasseras.
- Avlägsna supernatanten fullständigt. Tvätta cellerna med 15 ml medium, centrifugera 450 xg under 10 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten fullständigt.
OBS: Isolering buffert innehåller EDTA, som kelaterar kalciumjoner och därmed försämrar T-cellaktivering. Innan några stimuleringsanalyser, ta bort isoleringsbuffert fullständigt och tvätta cellerna två gånger med 15 ml medium. - Resuspendera celler i T-cellkulturmedium till 2-3 x 10 6 celler per ml. Rest celler i lämplig kolv or väl över natten i inkubatorn. Om celler används direkt för stimuleringsanalyser, tvätta dem en gång med medium.
- Renhet kontrollfärgning
- Ta ~ 50000 celler (Tnaïve, nTreg, PBMC) var, i 20 pl.
OBS: Om både Tnaïve och nTreg panel ska färgas, ta 2 prover vardera. - Förbered 2x koncentrerad antikropp förblandning (i PBS) som är lämpligt för instrumentet, till exempel: Tnaïve panel: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. För Treg panelen byter CD45RO-PE med CD25-PE, 01:10.
OBS: Endast vissa CD25 antikroppar, som känner igen olika epitoper än de CD25-mikropärlor, kan användas för att färga nTregs isolerats med CD25 mikropärlor. - Tillsätt 20 l antikropp förblandning till 20 mikroliter celler. Också förbereda enstaka färgningar för varje fluorokrom (med ett prov som innehåller positiva celler, t.ex., PBMC) och en ofärgade prov, för flödescytometri settings och ersättning.
- Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Fyll varje prov med 200 | il PBS och centrifugera 450 xg under 5 till 10 min.
- Ta upp cellerna i fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) buffert (= isoleringsbuffert utan EDTA) och analysera genom flödescytometri. Renheten hos naiva CD4 + T-celler är vanligen> 95% (se figur 2).
- Ta ~ 50000 celler (Tnaïve, nTreg, PBMC) var, i 20 pl.
2. Treg Induktion Kultur
- Framställning av Stimulering Media och Plates
- Förbereda och pre-warm T-cellkulturmedium: serumfritt hematopoietisk medium kompletterat med 2 mM L-alanyl-L-glutamin.
- Förbered cytokin stimulering antikropp och sammansatta lagerkoncentrationer.
- Förbereda IL-2 förrådslösning: 400.000 lU / ml i steril-filtrerades (med syrabeständigt filter) 100 mM ättiksyra (167 | ag / ml, om aktiviteten hos den använda parti är 2400 lU per 1 | j, g; bekräfta med leverantören). Alikvot till steriliserat lågproteinbindande 0,5 ml rör, täta med Parafilm, frysa på torris och förvara vid -80 ° C för långtidsförvaring eller -20 ° C i upp till 3 månader.
- Framställa TGF-β1 stamlösning (för 10 ^ g ampull, bärare-fri): Centrifugera TGF-β1 pulver (1000 xg 3 min), tillsätt 100 | il av 4 mM HCl (sterilfiltrerad med syrabeständigt filter) för att bereda stamlösningen med 100 pg / ml, låt upplösas helt; virvel. Alikvotera 5 pl vardera till steriliserad lågproteinbindande 0,5 ml rör, täta med Parafilm, frysa på torris och förvara vid -80 ° C i upp till 6 månader.
- Förbereda ATRA stamlösning: Lös pulvret vid 20 mg / ml (66,6 mM) i DMSO. Bereda stamlösning av 10 mM genom ytterligare spädning i DMSO och lagra alikvoter, skyddat från ljus, vid -80 ° C i upp till 1 år. ATRA är känslig för ljus, värme och luft.
- Framställa rapamycin stamlösning: 1 mg / ml (1,11 mM) i DMSO, förvara i alikvoter vid -80 ° C underupp till ett år.
- Förbereda natriumbutyrat stamlösning: 0,908 M (0,1 mg / ml) lager i sterilt ultrarent H2O och sterilfilter. Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbered 4x koncentrerade förblandningar (50 pl per brunn) i T-cellkulturmedium som i tabell 1.
- På föregående dag, päls plattor med anti-CD3-antikroppen. Coat önskade antalet brunnar från 96 U-brunnar med 5 | j, g / ml anti-CD3-antikropp i PBS, 65 | j, l / brunn. Linda plattan med folie och inkubera över natten vid 4 ° C.
OBS: Använd inte marginal brunnarna i plattor med 96 brunnar. Större brunnar kan användas, men U-formade brunnar underlätta användning av samma cell nummer per område över experiment. Om flera celler behövs, pool den erforderliga mängden av brunnarna efter odling. Vanligtvis, efter 4-6 dagar av expansion, 2 brunnar varje prov är tillräckliga för flödescytometri analys och RNA-analys.- På dagen för plätering, strax före plätering, ta bort anti-CD3 Lösning från brunnar. Fyll brunnarna med 200 pl / brunn PBS. Ta bort PBS. Upprepa tvättning med 200 pl / brunn PBS. Avlägsna PBS fullständigt och omedelbart använda plattor.
- Förbered plattor (använd inte marginal brunnar):
- För varje brunn, tillsätt 50 pl 4x anti-CD28 / IL-2 förblandning (med undantag för "ostimulerade" celler, lägga till T-cellkulturmedium), 50 pl 4x TGF-β1 förblandning (för alla iTregs) eller 50 ^ T-cellkultur medium för "stimulans bara" mock kontroll, 50 pl 4x ATRA, ATRA / rapamycin eller butyrat förblandning (i förekommande fall) eller medium
- Fyll alla tomma brunnar, inklusive marginal brunnarna med 200 pl PBS. Pre-varma plattor vid 37 ° C / 5% CO2.
- Förbered naiva T-celler för plätering
- Efter vilande celler, transfer till 15 ml rör, skölj kolv / brunnar med förvärmda T-cellkulturmedium och pool till röret. Fyll röret till 15 ml med T-cell-odlingsmedium. </ Li>
- Centrifugera cellerna vid 450 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna mediet och ta upp cellerna i färska, förvärmda T-cellkulturmedium till en densitet av 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Räkna celler som i steg 1.2.2 och justera densitet om det behövs.
- Lägg celler till förberedda stimuleringsplattor (se 2.1), 50 ^ celler / brunn (110,000-130,000 celler / brunn). Varje bör väl nu innehålla en total volym på 200 pl.
- Wrap plattorna i aluminiumfolie för att skydda ATRA från ljus; inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 under önskade tidsperioder.
- Övervaka Treg Induktion Kultur
- Övervaka Treg kulturer genom ljusmikroskop (40X förstoring). Från omkring dag 2-3, bör små kluster av celler som förökar sig bli synlig, som slås samman till större grupper vid senare tidpunkter. Kulturer odlade med rapamycin växa i allmänhet mindre. Se även figur 3.
- Vid önskade tidpunkter, ta prover för RNA extraction eller flödescytometri fenotypning (se nedan). För senare tidpunkter med celltillväxt, en väl varje räcker, annars tar 1 x 10 5 -1 x 10 6 celler vardera för RNA och 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler för flödescytometri.
- Bedöma foxp3 Stabilitet
- För bedömning av stabiliteten av iTreg fenotypen som beskrivits tidigare 22,27, tvätta iTregs två gånger med T-cell-odlingsmedium och odlings iTregs ytterligare i T-cellkulturmedium, antingen utan eller med anti-CD3 och anti-CD28-återstimulering såsom beskrivs i 2,1 och 2,2 . Lägga cytokiner, såsom 50 lU / ml IL-2, för att studera deras inflytande på foxp3 stabilitet.
- Vid önskade tidpunkter, ta prover för RNA-extraktion, flödescytometri fenotypning (se nedan), och TSDR metyleringsanalys såsom beskrivits 22,28.
3. Fenotypisk analys av iTregs av QRT-PCR
- Förberedelse förprover
- Vid önskade tidpunkter, ta 1 x 10 5 till 1 x 10 6 celler per prov för RNA-extraktion. Överför celler till en RNas-fri 1,5 ml rör och centrifugera vid 500 xg under 5 min.
- Om det behövs, avlägsna en del av supernatanten och frysa för enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) eller liknande analys. Avlägsna kvarvarande supernatanten helt från celler. Gå direkt till RNA-extraktion eller frysa cellpelleten på torris och förvara vid -20 ° C till -80 ° C i upp till 2 veckor.
- Extrahera RNA och utför QRT-PCR för foxp3 och en housekeepinggen (såsom RPL13A) enligt standardprotokoll. Dessutom mäta uttryck av andra Treg signatur gener (till exempel `Treg up' gener IL2RA, CTLA4, IKZF4 och` Treg down' gener IFNg, SATB1).
4. Fenotypisk analys med flödescytometri
OBS: Detta protokoll är optimerad för fläcking i 96U brunnar format med 3 x 10 5 -1 x 10 6 celler. Om det finns mindre celler per brunn, börja med flera brunnar och pool som beskrivs nedan.
- Cellåterstimulering (tillval)
- Om färgning för intracellulära cytokiner önskas, puls celler med forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) / Ionomycin i närvaro av en proteintransport-hämmare.
OBS: Detta förfarande påverkar inte foxp3 uttryck i ovan beskrivna iTreg kulturer, men andra markörer kan förändras - till exempel CD4 nedregleras. - Förbereda 10x Brefeldin A / PMA / Ionomycin förblandning (20 | il per brunn) i T-cellkulturmedium: brefeldin En stamlösning 1: 100, Ionomycin (lager 5 mikrogram / l) 1: 1300, PMA (lager 12,35 | ig / | il, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 av spätts lager.
- 4 timmar före färgning, tillsätt 20 l Brefeldin A / PMA / Ionomycin 10x mix per brunn för att få slutkoncentrationer av 1: 1000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomycin, 10 ng / ml PMA.
- Inkubera under 4 h vid 37 ° C / 5% CO2
- Om färgning för intracellulära cytokiner önskas, puls celler med forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) / Ionomycin i närvaro av en proteintransport-hämmare.
- ytfärgning
OBS: Panelen föreslås här är ett förslag; andra paneler kan användas beroende på antigenerna av intresse och Instrumentinställningar.- Cool PBS på is. Förbereda FACS-buffert (PBS med 0,5% humant serumalbumin, HSA) och kyl på is. BSA eller FBS kan användas som ett alternativ till HSA.
- Re-platta celler i färgnings platta: Resuspendera celler med en pipett och överföra celler till en ny 96U brunnar, lämnar en väl fri runt varje brunn (för att förhindra spridningseffekter senare färgningsproceduren). Om mindre än önskade cellantal är närvarande i den ursprungliga brunn, avlägsna en del av den överstående lösningen före återsuspension, och poolen flera brunnar i en färgnings väl.
- Centrifugera plattan 400 xg under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten. Häll ut supernatanten i avfalls rutan lämna plattan uppner och omedelbart (utan återvändo plattan) knacka plattan en gång på absorberande papper. Sedan omedelbart vända plattan. Vortex plattan resuspendera cellerna i kvarvarande vätska.
- Tillsätt 25 | il ytfärgning förblandning (CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1: 5 i FACS-buffert) och återsuspendera.
OBS: omfattar även enstaka färgningar för vart och ett av de använda fluorokromer med prover som innehåller positiva celler för respektive antigen; och inkluderar ofärgade prov. Dessa kommer att behövas för instrument ersättning inställning. Alternativt kan du använda ersättnings pärlor. - Inkubera 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tillsätt 200 pl PBS, centrifugera plattan 400 xg under 10 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten som beskrivs i steg 4.2.4. Virvelplatta.
- Upprepa steg 4.2.7 två gånger.
- viabilitetsfärgning
OBS: viabilitetsfärgning är nödvändig, eftersom efter fixering / permeabilization döda celler kan inte i tillräcklig utsträckning kan uteslutas genomFSC / SSC och kan ge upphov till ospecifika signaler. En fixerbar livskraft färgämne måste användas.- Resuspendera cellerna i 130 pl livskraft fläck förblandning (fastställbara livskraft dye-eFlour780 1: 1400 i PBS) och omedelbart Resuspendera cellerna med flerkanals pipett.
OBS: omfattar även en enda färgning för livskraft färgämne som innehåller döda celler, t.ex. ostimulerade T-celler odlas i flera dagar eller döda celler genom att applicera värme av tillverkarens instruktioner. Dessa kommer att behövas för ersättning. - Inkubera 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Centrifugera plattan vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten som i steg 4.2.4. Virvelplatta.
- Fyll med 200 | il FACS-buffert. Upprepa steg 4.3.3.
- Fyll med 200 pl PBS. Upprepa steg 4.3.3.
- Resuspendera cellerna i 130 pl livskraft fläck förblandning (fastställbara livskraft dye-eFlour780 1: 1400 i PBS) och omedelbart Resuspendera cellerna med flerkanals pipett.
- Intracellulär färgning med foxp3 färgningsbuffert Set
- För varje brunn, förbereda: 150 l Fix / Perm buffert (utspädd Fix / Perm koncentrate 1: 4 med utspädningsmedel); 850 l 1x permeabilization buffert (utspädd 10x permeabilization buffert 01:10 med ultrarent H2O).
- Efter virvling Resuspendera cellerna i 150 pl Fix / Perm buffert och omedelbart suspendera med pipett. Det är viktigt att omedelbart resuspendera att undvika fixering av cellklumpar.
Varning: Fixering buffert innehåller paraformaldehyd och bör hanteras och kasseras på lämpligt sätt. - Inkubera 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tillsätt 100 | il kall PBS. Centrifugera vid 850 xg under 10 min vid 4 ° C.
OBS: Från detta steg framåt centrifugerhastigheten ökas för att undvika förlust av celler. Efter fixering, celler blir osynlig och försiktighet bör vidtas för att avlägsna supernatanter som beskrivs i steg 4.2.4 och omedelbart efter centrifugeringen är klar för att minimera förlusten av celler. - Avlägsna supernatanten som beskrivs i steg 4.2.4. Virvelplatta.
OBS! Färgning kan pausas i detta steg; idetta fall, tvätta cellerna två gånger med 200 ^ il PBS; sedan ta upp i 250 pl PBS och lagra vid 4 ° C, skyddad från ljus. Cellerna kan lagras i några dagar, sedan vidare med permeabilisering. Men optimala resultat uppnås när direkt vidare till permeabilization. - Efter virvling tillsätt 200 | il Permeabilization buffert. Centrifugera vid 850 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten som beskrivs i steg 4.2.4. Virvelplatta.
- Tillsätt 200 | il Permeabilization buffert för att återsuspendera.
OBS: Här kan prover delas upp i intracellulär färgning och prov isotypkontroll (ta bort hälften av varje prov). Om cellantalet är begränsande, kan en sammanslagen isotyp prov beredas (ta bort 10-20 pl av varje prov och pool). Dessutom kan prover tas för fluorescens-minus-on (FMO) kontroller. - Centrifugera vid 850 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten som beskrivs i steg 4.2.4. Virvelplatta.
- Återsuspendera pelleten i44 pl Permeabilization buffert plus 1 pl normalt musserum (förblandas) för att blockera ospecifik bindning.
OBS: Detta gäller om antikroppar som används i det följande steget är av murin isotyp. Om andra antikroppar, såsom härledda från råtta, används, innefattar den lämpliga serum för blockering (t.ex. råttserum). - Inkubera vid 4 ° C under 15 minuter i mörker.
- Lägg antikroppar:
OBS: Fråga antikroppskoncentrationer för specifika partier. Om inte gjort i steg 4,2 med antikroppar mot ytantigener (t.ex. CD4) med respektive fluorokromer, inkluderar även enstaka färgningar för vart och ett av de använda fluorokromer med prover som innehåller positiva celler för ersättning.- Tillsätt 15 l antikropp förblandning till prover (utom för enstaka färgningar, ofärgade prov, isotyp kontrollprover och FMO kontroller): Foder per prov: 0,7 l (0,35 mikrogram) anti-interferon-gamma (IFN-γ) -FITC (i förekommande fall efter återstimulering ),2,3 pl (0,115 mikrogram) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 pl (0,05 mikrogram) Anti-FOXP3-APC, 10 pl PBS.
- Att isotyp kontrollprover, tillsätt 15 l isotyp antikropp förblandning, med samma mängder av antikropp som för de antikroppar som används i 4.4.11.1: Foder per prov: 0,7 l (0,35 mikrogram) mus IgG1 K isotypkontroll FITC (i förekommande fall), 0,58 il (0,115 ^ g) mus-IgG2a-BV421 isotyp, 0,5 | il (0,05 | ig) mus IgG1 K isotypkontroll APC, 13,2 | j, l PBS.
- För FMO kontroller lägga antikroppar som i 4.4.11.1, ersätta en antikropp vardera med PBS.
- Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter i mörker.
- Tillsätt 200 | il Permeabilization buffert. Centrifug, avlägsna supernatanten och virvel som i steg 4.4.8. Upprepa en gång.
- Resuspendera cellerna i kall FACS buffert (volym enligt instrument som används) och förvärva, helst omedelbart, på flödescytometern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett schema av experimentuppställningen. Figur 2 visar en representativ renhetskontrollfärgning för att magnetiskt isolerade naiva CD4 + T-celler och nTregs.
F igure 3A visar flödescytometri gating strategi och Figur 3B visar representativt foxp3 och CD25 flödescytometri färgningar på dag 6 av odling under de angivna iTreg eller kontrollbetingelser. Vid stimulering in vitro, de flesta celler uppreglerar CD25, som reduceras i närvaro av rapamycin. Endast under tillsats av iTreg-inducerande faktorer, blir en tydlig population av foxp3 + celler uppenbara, som också berikas inom CD25 + celler under iTreg förhållanden. Figur 3C visar fenotypiska utseende iTreg kulturer i mikroskop med celler som förökar ses som mörka kluster. varje i Treg tillstånd visar en specifik och reproducerbar mönster av celltillväxt: Under dessa odlingsbetingelser ökar TGF-β spridning något och ATRA ökar spridningen ytterligare. Samtidigt, är påtaglig hämning av proliferation genom rapamycin med starkt reducerad klusterstorlek. Mikroskopiska utseende spridningsstyrka motsvarar också den totala celltal (data ingår ej).
Figur 4 visar representativa resultat av QRT-PCR-analyser av foxp3 mRNA-induktion i iTreg (och kontroll) kulturer vid olika tidpunkter. Som för foxp3 protein, är foxp3 mRNA-uttryck högre i alla iTregs jämfört med kontroll stimulerade celler, med rapamycin-behandlade iTregs som har relativt låga nivåer jämfört med andra iTregs. Foxp3 mRNA i nTregs är högre än i iTregs.
es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Figur 1: Experimentell system för iTreg induktion, nTreg isolering och Treg analys. Humana naiva CD4 + T-celler isolerades från buffy coats och stimulerades i serumfritt medium med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar plus 100 E / ml IL-2 i upp till 6 dagar, antingen i frånvaro ( `mock kontrollceller ") eller närvaro av olika Treg-inducerande faktorer (` iTreg') som anges. nTregs isoleras och analyserades parallellt. Fenotypisk analys kan göras genom flödescytometri och QRT-PCR. Modifierad från Schmidt, A. et al. 2016 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cell renhet av start populationer. Naiva humana CD 4 + T-celler isolerades genom den naiva CD4 T-cell Isolation Kit II människa. Övre panel: Naiv CD4 + T-celler renhet, baserat på CD4, CD45RA och CD45RO, var 94 till 98% och renheten för en representativ givare av mer än 30 visas ( `Tnaïve'). Ex vivo tregs ( 'nTreg') isolerades genom användning av begränsade mängder av CD25 mikropärlor och användes som en positiv kontroll för iTreg experiment. nTreg renhet av en representativ donator, baserat på CD25 och CD4, visas. Undre panel: Intracellulär foxp3 färgning (utförd som i fig 3 och pre-gated på levande CD4 + celler) visas för naiva CD4 + T-celler och nTregs respektive, med användning av celler från samma givare som i den övre panelen. Modifierad från Schmidt, A. et al. 2016 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fenotypisk utseende iTregs och nTregs. Humana naiva CD4 + -T-celler odlades i serumfritt medium under de angivna förhållanden. T-celler stimulerades med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar plus 100 U / ml IL-2 ( 'Stim.'). Där så anges, var TGF-β1 ( 'TGF'), rapamycin (' Rapa'), all-trans-retinsyra ( 'ATRA') eller butyrat tillsattes. nTregs (ex vivo isolerade perifert blod CD25 ++ celler) lämnades ostimulerade ( 'unstim.') och användes som positiv kontroll. Ostimulerade naiva T-celler användes som negativ kontroll. (A) På dag 6 av kultur, cellerna färgades med ytan antikroppar innefattande anti-CD25 och anti-CD4, sedan färgas med fastställbara livskraft färgämne och därefter fasta / permeabiliserade och färgade intracellulärt med anti-FOXP3 och anti-CTLA-4 eller isotyp forts rol-antikroppar. Förvärv och ersättning utfördes på en Cyan ADP flödescytometer och data analyserades med FlowJo programvara. Grindningsstrategin indikeras av de röda pilarna, och det visade exemplet är en iTreg prov inducerades med TGF + ATRA. (B) Celler färgades såsom i (A), och foxp3 och CD25-uttryck i kontroll T-celler och iTregs inducerade av olika protokoll visas. De Pseudo tomter visar representativa Foxp3 och CD25 färgningar för en donator, pre-gated på sing, levande CD4 + celler som i (A). Isotypen exempel visas för en iTreg (stim. + TGF + ATRA) prov. (C) Representativa mikroskopiska bilder (40X förstoring) av individuella 96U-plattbrunnar av celler odlade under 4 dagar. Mörka kluster av celler representerar celler som förökar sig. Klicka här för att se en större version av denna siffra. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 4: foxp3 mRNA-uttryck vid användning av olika protokoll för iTreg differentiering. iTregs genererades som i figur 3 i enlighet med de angivna villkoren, och vid de givna tidpunkter togs cellprover togs och RNA extraherades. Ostimulerade naiva T-celler och ostimulerade nTregs, samplades på dag 0. Proverna analyserades med QRT-PCR och foxp3 mRNA-uttryck normaliserades till RPL13A uttryck för varje prov. Foxp3 mRNA-expression i ostimulerade naiva T-celler var satt till 1, och faldig förändring av foxp3 mRNA beräknades. Visas är medelvärden och utbud av PCR replikera brunnar för en representativ givare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet möjliggör den robusta induktion av humana CD4 + FOXP3 + iTregs från humana naiva CD4 + T-celler. Den innehåller ett nytt protokoll som vi beskrev nyligen, med hjälp av en kombination av TGF-β, ATRA och rapamycin, för induktion av iTregs med överlägsen in vitro undertryckande funktion 22. Jämfört med andra publicerade protokoll, är en annan fördel induktion av olika iTreg populationer parallellt av olika protokoll, som möjliggör att direkt jämförelse av effekterna av vissa iTreg-inducerande faktorer, tillsammans med kontrollceller som aktiveras i närvaro av enbart IL-2 . De beskrivna protokoll möjliggör reproducerbar induktion av foxp3 med lågt givar variation. Naiva CD4 + T-celler i detta protokoll isoleras genom magnetisk aktiverad cellsortering, men fluorescensaktiverad cellsortering är också möjlig. Det förväntade utbytet av naiva CD4 + T-celler med detta protokoll är typiskt mellan 5-10%, men starkt beror på givarens (okänd) och verkar också lägre när höga fraktioner av erytrocyter är närvarande. Om det krävs en uppskattning kan PBMCs färgas (se steg 1,4) under monocytförbrukning steg. Typiskt är utbytet av naiva CD4 + -T-celler omkring hälften av de "procentuella naiva CD4 + T-celler i lymfocyter gate" vid PBMC-fläcken. Detta protokoll använder begränsade mängder av CD25 pärlor att erhålla CD25-hög (nTreg) celler 29. Men dessa är inte rena tregs, men dessa är bara anrikad på tregs att användas som positiv kontroll. Om rena tregs behövs, bör andra kit användas (till exempel i kombination med CD4 anrikning och CD127-utarmning) eller alternativt, CD25 + celler pre-berikad med 8 pl CD25 pärlor per 10 7 celler och färgas och sorteras genom fluorescensaktiverad cell sortering med stränga CD4 + CD25 ++ grind. Även införandet av andra markörer, såsom CD127 utslagning, bör övervägas.
_content "> Det är viktigt att tänka på att foxp3 är nödvändig, men inte tillräcklig för att ge Treg identitet 30. Även iTregs kan användas för att studera vissa aspekter av, till exempel, foxp3 reglering, är det dock viktigt att notera att iTregs skiljer sig från nTregs i flera avseenden. det är därför viktigt att kultur nTregs (idealt härrör från samma donator) parallellt med iTregs i alla analyser för jämförelse. skillnaden mellan nTregs och iTregs exemplifieras av endast delvis överlappning av nTreg och iTreg transkriptom mätt i murina iTregs 31. Andra Treg signatur gener utöver foxp3 bör mätas av detta skäl, och för att säkerställa diskriminering från aktiveringsinducerat foxp3 uttryck i humana celler. till exempel bör iTregs visa högre uttryck av CD25, CTLA-4 och EOS jämfört till aktiverade T-celler medan expression av IFN-γ och SATB1 bör vara låg i nTregs och iTregs inducerade av de protokoll som beskrivs här, som tidigare publiceratsModifiering av iTreg-inducing protokoll genom tillsats av föreningar (såsom vitamin C eller svavelväte) som påverkar Tio elva Trans (TET) metylcytosin dioxygenasenzymer, som beskrivs mycket nyligen 32-34, kan lägga stabilisera FOXP3 genom att påverka DNA-metylering. Dessutom har stimulering styrka och timing ett inflytande på foxp3 uttryck och stabilitet 35. Längs dessa linjer, var användningen av pärla kopplade CD3 / CD28-antikroppar i stället för plattbundna antikropparna visat sig öka murin iTreg in vivo undertryckande funktion och stabilitet än oberoende av TSDR demetylering 36. En annan faktor som måste övervägas som en potentiell källa till variation är användning av serum, som innehåller icke definierade faktorer inkluderande TGF-β som till och från bovin källa är 100% korsreaktiv med humana celler. Också kan källan och aktivitet av IL-2 drastiskt påverka resultaten av foxp3 induktion.
En viktig feature av tregs är deras undertryckande förmåga, som måste testas därefter med iTregs genereras i detta protokoll. Det bör noteras att undertryckning analyser med iTregs inte är triviala och litteraturen om suppressiva förmågor av iTregs är kontroversiell. Flera metoder och protokoll för att bedöma suppressiv funktion av humana tregs har publicerats på annat håll 22,37 - 41, med proliferations in vitro-analyser baserade på flödescytometri utläsningar såsom utspädning av karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) är den mest använda. Det är viktigt att tvätta och vila iTregs före användning i undertryckande analyser, och det måste beaktas att iTregs, i motsats till nTregs, kanske inte är anergiska men föröka sig under undertrycknings analyser. Vi anser att det är oerhört viktigt att använda `mock' stimulerade T-celler som kontroll suppressorceller för att identifiera graden av ospecifik suppression (såsom genom CTLA-4 expression, IL-2 konsumption och kultur överväxt av aktiverade T-celler) som är kopplad till foxp3 + Treg-specifika effekter, och ofta brist på den här kontrollen kan bidra till vissa kontroverser i litteraturen. Med hjälp av denna kontroll, definierade vi att endast TGF-p / ATRA / Rapa-inducerade iTregs visade undertryckande aktivitet in vitro 22. Således kan vi dra slutsatsen att när det gäller undertryckande aktivitet (om än inte högsta bråkdel av foxp3 + celler), är TGF-β / ATRA / Rapa den bästa kombinationen av faktorer som de beskrivna protokollen att inducera iTregs. Inte desto mindre undertryckande aktivitet in vitro inte nödvändigtvis undertryckande aktivitet in vivo, och faktiskt vi fastställt att mänskliga iTregs genereras av dessa protokoll inte undertrycka i en xenogen graft- kontra -host sjukdomsmodell åtminstone under de förhållanden som testades 22. Detta kan bero på instabil foxp3 uttryck som förlorades i iTregs vid återstimulering, i linje med en brist på TSDR demetylering 22
Beroende på vilken aspekt av iTreg egenskaper (hög andel av foxp3 + celler, överlägsen undertryckande aktivitet, foxp3 stabilitet) är viktigast för en viss forskningsfråga, kan olika protokoll vara mest lämpliga för att studera dessa frågor, vilket gör det svårt att definiera allmänt "bästa "protokoll för Treg induktion. Vidare kan flera ovan beskrivna subtila experimentella skillnader påverkar resultaten och kan bidra till kontroverser med avseende på fenotyp och suppressiv funktion av TGF-p-inducerad iTregs som visas mellan rapporter även med till synes liknande protokoll för iTreg generation 42. Till exempel, även inom ett laboratorium, observerade vi att iTregs inducerade med TGF-β och IL-2 i serum-innehållande RPMI-medium visade upp lite suppressiv aktivitet jämfört med kontrollceller 27, medan TGF-β / IL-2-inducerade iTregs genereras i definierad, serumfri T-cellkulturmedium inte 22, drots de liknande nivåer av foxp3.
Framtida tillämpningar baserade på dessa protokoll bör sträva efter att ytterligare optimera Treg induktions förutsättningar för att uppnå en fenotyp med stabil foxp3 uttryck, TSDR demetylering, stabil fenotyp utan omvandling till cytokin-producerande T-celler och optimal undertryckande aktivitet. Vidareutveckling av iTreg induktionsprotokoll kan vara användbara för adoptiv överföring metoder i framtiden, i vilken terapi av Treg överföring är mycket lovande för potentiell behandling av autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |
| anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |
| anti-human CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |
| anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |
| Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99.7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |
| Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |
| Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
| GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |
| human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Human serum albumin 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg | eBioscience | 11-4714-81 | |
| mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |
| Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |
| Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |
| TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution: contains paraformaldehyde |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution: contains paraformaldehyde |
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
References
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
- Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
- Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
- Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
- Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
- Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
- Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
- Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
- Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
- Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
- Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
- Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
- Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
- Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
- Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
- Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
- Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
- Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
- Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
- Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
- Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
- Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
- Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
- Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
- Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
- Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
- Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
- McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
- Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
- Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
- Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
- Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).
