Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/55015
Automatic Translation
1, *1, *1, 1
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Introduction

CD4 + CD25 + FoxP3 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) diğer bağışıklık hücrelerini bastırmak ve periferik tolerans kritik arabulucular, önlenmesi otoimmünite ve aşırı enflamasyon 1 bulunmaktadır. Tregs önemi, ciddi sistemik otoimmün hastalık yol açar Tregs kaybı nedeniyle `master' Treg transkripsiyon faktör forkhead kutusu P3 mutasyonlar insan hastalık immunodysregulation poliendokrinopati enteropatisi X'e bağlı sendromu (IPEX), (FoxP3) tarafından örneklenmiştir erken yaşta ölümcül. Ancak, Treg'ler onlar da bazı ayarlarda 2 anti-tümör bağışıklığını engel gibi bağışıklık sisteminde bir iki ucu keskin kılıç olarak hareket ederler. Treg sayısı ve fonksiyonu Terapötik manipülasyon birçok klinik araştırmalarda bu nedenle tabidir. Kanserinde Tregs tükenmesi arzu edilebilir ve klinik yaklaşımlar bazı başarı daha fazla araştırma 3 teşvik eder. Pek çok dil içinde Tregs terapötik etkilerine ek olarak, otoimmün ve enflamatuar hastalıkların, bölgesindekiral fare hastalık modelleri, evlatlık Treg transferi son ilk-man denemeleri greftleme karşı -host hastalığı (GVHH) 4 önlemek için - 7 ve çok umut verici sonuçlar vermiştir tip 1 diyabet 8 tedavisinde güvenliğini değerlendirmek için.

11 - Doğal Tregs (nTregs üretme) SAĞLIK 9 korunmasında yedeksiz temel fonksiyonları ile timik türevli tTregs ve periferik kaynaklı pTregs içermektedir meydana. Bununla birlikte, nTreg numaraları naif T hücresi öncüleri 12 in vitro olarak uyarılması Tregs (iTregs) tamamlayıcı bir yaklaşım teşvik sınırlıdır. Bunun nedeni, muhtemelen FoxP3 gen lokusu 13 olarak adlandırılan regülatör özgü demetile bölge (TSDR) 'de demetilasyon eksikliği iTregs Hala stabilite, bir sorun olmaya devam etmektedir ve birçok çalışma, Tregs bağlı in vivo 14 daha kararlı olduğunu göstermektedir.

Bugüne kadar, FoxP3 en iyi protein m kalırinsan geleneksel CD4 + CD25 T hücreleri geçici aktivasyon 15,16 üzerine FOXP3 orta düzeyde ifade çünkü Tregs için arker ama kesinlikle özel değildir. önemli bir ilerleme FoxP3 ekspresyonunun düzenlenmesi açıklık yapılmış olmasına rağmen, daha özel olarak, insan hücrelerinde FOXP3 indüklenmesi, kararlılık ve işlevi ile ilgili tespit edilmesi gerekmektedir. NTregs için farklılıklara rağmen, in vitro FoxP3 neden + CD4 + T hücreleri FoxP3 indüksiyon moleküler mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak da kullanılabilir ve daha benzer iTregs üretilmesine izin gelecek protokolleri geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak gelecekte adaptif transfer stratejileri için geçerli olabilir oluşturulan Tregs, vivo.

Orada insan iTregs ikna etmek için hiçbir `altın standard' protokolü ve mevcut protokoller in vivo regülatör uyaran koşulları taklit dayalı geliştirilen edilmiştir: 2 (IL-2, interlökin) Ve transforme edici büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal vivo 17 FoxP3 indüksiyonu için çok önemli olan, ve all-trans retinoik asit (ATRA) - bağırsak ile ilişkili dendritik hücreler tarafından in vivo üretilen - sıkça FoxP3 arttırılması için kullanılır 21 - 18, in vitro olarak. Bu bütirat 22 en son sıçangil regülatör indüksiyon 23,24 artırdığı gösterilmiştir bağırsak Mikrobiyota türetilen kısa zincirli yağ asit kullanılarak ek insan regülatör T indükleyici protokolleri geliştirmiştir. Ayrıca son zamanlarda bu teşvik ettiği bilinir önleyicisi ikinci rapamisin (mTOR) klinik olarak kabul memeli hedefi olarak, TGF-p, ATRA bir kombinasyonu kullanılarak ve 22 rapamisin ile, in vitro olarak, üstün bastırma fonksiyonu ile iTregs üretimi için yeni bir protokol kurulan insan Treg genişleme 25,26 sırasında FoxP3 bakım.

Bu yöntem tekrarlanabilir açıklarinsan CD4 + FoxP3 + farklı olan bir dizi şartı ile iTregs ve akış sitometrisi ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon ile daha sonra fenotipleme nitro nesil (qRT-PCR) FOXP3 sentezlenmesi ve diğer regülatör imza molekülleri, protokole özel desenler ortaya çıkarmak için CD25, CTLA-4, EOS, hem de IFN-y ve SATB1 ifade 22 baskı olarak. oluşturulan hücre popülasyonları, genel FoxP3 düzenleyicileri ile ilgili ya da bu tür butirat veya rapamisin gibi bazı bileşiklerin özel etkilerini incelemek için, ya baskılayıcı aktivitesi ile ilgili olarak, işlevsel tayinler için veya moleküler çalışmalar için de kullanılabilir. Treg farklılaşma sürüş moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, özellikle Treg nesil ve fonksiyonunda yer alan molekülleri hedef otoimmünite veya kanser gelecekteki terapötik yaklaşımlara için büyük önem taşımaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), taze Karolinska Üniversite Hastanesi, İsveç satın anonim sağlıklı donor buffy katlarından izole edilmiştir. deneyler için etik izin Stockholm Bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm) elde edilmiştir, İsveç (onay numarası: 2013 / 1458-1431 / 1).

Periferal kandan, 1'dir, T Hücre İzolasyonu

  1. PBMC İzolasyon
    1. 15 ml yoğunluğu santrifüj ortamı 50 ml tüpler (buffy coat başına 5 tüpler) (örneğin Ficoll gibi) çözümünü ön yatıyordu. Oda sıcaklığına Pre-sıcak.
    2. 180 ml fosfat tamponlu salin (PBS) (oda sıcaklığı) ile buffy coat doldurun. Taze kan kullanılırsa, PBS eşit hacimde kan seyreltin.
    3. yan ve yavaş yavaş bindirme yoğunluk santrifüj ortamı ~ tüp başına kan seyreltilmiş 35 ml Tilt tüp. med yoğunluk santrifüj herhangi bir karıştırma olmadan, çok dikkatli kan ekleyum faz ve kan tabakası.
    4. Frensiz oda sıcaklığında 1150 xg'de Santrifüj 20 dk. Frensiz santrifüj işletmek ve orta ivme düşük mümkünse tabakaların karışmasını önlemek için.
    5. yoğunluk santrifüj orta ve plazma fazı arasında PBMC'ler içeren beyaz halka çıkartın. (2 ml plastik Pasteur pipeti ile 1 kez 5 ml pipet ve 2 kez), yeni bir 50 ml tüp aktarın. Mümkün plazma ve yoğunluk santrifüj ortamı olduğunca az alın. Kırmızı eritrosit pelet dokunmayın.
    6. Yıkama PBMC'ler. 50 ml tüpler (buffy coat başına 4 tüp) içine PBMC bölün. PBS ile 50 ml her doldurun.
    7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüj 450 x g.
    8. Çıkarın ve supernatant atmak 10 1 tüpüne ml RPMI /% 10 cenin dana serumu (FCS) orta hücreleri havuz ve de yeniden süspanse edin. hücre kümeleri 40 mikron hücre süzgecinden mevcut, gerilme hücreleri ise.
    9. reklam için T175 hücre kültürü şişesi hücreleri aktarınHerent hücreleri. (50 ml toplam) 40 ml ortam ile tüpler durulayın ve hücreler ile birleştirir. Gerekirse, (1.4 adım bakınız) akış sitometri analizi için bir numuneyi çıkarın. Genellikle, CD4 + T hücreleri lemfosit kapısı hücrelerin yaklaşık% 30-40 ihtiva eder ve naif T hücreleri donöre bağlı olarak, CD4 + T hücreleri, yaklaşık 30 ila 60% 'si arasında.
    10. 37 ° C /% 5 CO2 seviyesinde 45 ila 90 dakika için balon döşeme hücreleri inkübe edin. Bu adım plastik bağlılık ile monositler tüketmek olacaktır. Bu zorunlu değildir, fakat, aşağıdaki adımları PBMC'ler miktarı yüzde oranı, T hücre verimi artar.
    11. Süspanse hücreleri (50 ml ortam şişe içinde yer alan) ve de şişenin altındaki hücre tabakasını yıkayın. eşit iki adet 50 ml tüpler içine hücreleri dağıtmak (önceki tüpler aynı donörden yeniden kullanılabilir). 50 mi taze RPMI /% 10 FCS ortamı ile balon durulayın ve aynı 2 tüplere eşit aktarın.
      Not: PBMC borular döşeme 4 ° C'de gece boyunca saklanabilirYan ya da ideal olarak, doğrudan T hücresi izolasyonu için kullanılan.
  2. Manyetik aktive hücre sıralama tarafından nTreg İzolasyon
    1. yalıtım tamponu hazırlayın:% 0.5 (w / v) insan serumu albümini ile PBS içinde 2 mM EDTA. Her zaman 4 ° C'de tampon tutun. Alternatif insan albümine, sığır albümin kullanın.
    2. Süspanse ve tripan mavisi varlığında bir otomatik veya manuel hücre sayacı ile PBMC'ler saymak (küçük trombositler sayılmaz). hücre kümeleri gözlenmesi halinde, 40 mikron hücre süzgecinden gerilme hücreleri.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje PBMC.
    4. Hücreleri tekrar 10 7 PBMC başına 90 ul yalıtım tamponu (1 mi pipetiyle) tek bir hücre süspansiyonu elde edildi. Orijinal 50 ml tüpler (buffy coat başına 2 tüp) hücreleri tutun.
    5. 10 7 hücre başına 2 ul CD25 boncukları ekleme karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
    6. 30 ml PBS ile doldurun. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj6 ° C.
    7. 3 ml izolasyon tamponu ile dengelenmesi ve akmasına atmak: LS sütunları (buffy coat başına 2) hazırlayın. Tüpler daha sütunları durulama için yeniden kullanılabilir.
    8. tüp başına 3 ml izolasyon tamponunda yeniden süspanse hücreleri (1 ml pipet ile). Aktarım hücreleri sütunu LS ve taze 15 ml tüpler aracılığıyla akışını toplamak için.
    9. 2 ml İzolasyon ile 50 ml'lik tüpler her tampon durulayın. sütunlara tampon durulama transfer.
    10. 3 ml İzolasyon ile yıkayın kolon 2x her tampon. Sütun herhangi bir yeni sıvı eklemeden önce, damlama durdurulana kadar hep bekleyin. Mağaza sonraki adımlar 4 ° C'de akışı.
    11. mıknatıstan sütun çıkarın. 15 ml tüp içine kolon başına 3 mi yalıtım tamponu ile elüte 2x.
      Not: donör başına 2 sütun gelen elüat birleştirilebilir. sıvı içine sütun daldırma yok.
    12. Hazırlayın ve yeni LS sütun (buffy coat başına 1 sütun) dengelenmesi. sütun 1.2.11 gelen elüat aktarın. atılabilir akışı. Eluat passe sahip sonrasütun aracılığıyla d tüp durulayın ve 3 ml izolasyon tamponu ile kolon 3x yıkayın.
      Not: İkinci sütun önemlisi saflığını arttırmak için gereklidir.
    13. mıknatıstan sütun çıkarın. 3 mi İzolasyon tamponu ile elüte CD25 ++ "nTregs üretme" 2x.
    14. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. tamamen süpernatantı.
    15. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de 15 mi T hücresi kültür ortamı, santrifüj ile hücreler yıkanır. tamamen süpernatantı.
    16. 100 lU / ml IL-2, her biri takviye 0.5 mi T hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. 24 plaka hücreleri aktarın. 0.5 ml ortam ile durulayın boru (+ 100 lU / ml IL-2) ve 24-iyi plaka içine birleştirir.
    17. (Adım 1.2.2 gibi) nTregs sayın. Verim genellikle buffy coat başına yaklaşık 1-4 x 10 6 Treg'ler olduğunu. T hücre kültürü ortamı + 100 lU / IL-2 mi 1-2 x 10 6 hücre / ml Tregs yoğunluğunu ayarlar.
    18. 37 ° C /% 5 CO 2 kullanılıncaya kadar az Tregs inkübe edin.
    Manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile naif CD4 + T hücre Isolation
    NOT: hücre izolasyonu ile devam etmek adım 1.2.8-1.2.10 den akmasına atın. Hiçbir nTregs üretme izole edilmiştir Alternatif olarak, eğer PBMC'ler doğrudan devam edin.
    1. 50 ml tüp regülatör-tükenmiş PBMC'lerin donör başına 2 tüpleri birleştirin. Oda sıcaklığında, 50 ml PBS ile doldurun.
    2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj PBMC'ler. Süpernatantı çıkarın ve atın. 50 ml PBS içinde süspanse edin hücreleri.
    3. Adımı yineleyin 1.3.2 kez.
      NOT: PBS yıkar aşağıdaki negatif izolasyon kiti ile kaldırılır olmayacak trombositlerin, çıkarılması için çok önemlidir. Trombositler, bu düşük hızda santrifüjleme de yüzer kalır. Trombosit tükenmesi mikroskobik slayt adım adım izlenebilir. aşamalar oda sıcaklığında PBS ve santrifüj ile yapılması gerekir.
    4. 50 ml PBS içinde süspanse PBMC'ler. Adım 1.2.2 olarak hücreleri saymak.
    5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje PBMC. 10 7 hücre başına 40 ul İzolasyon tamponu (4 ° C) yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
    6. 10 7 hücre başına Naif CD4 + T hücresi Biotin-antikor kokteylinin II 10 ul ekle.
    7. Karıştır ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
    8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de 40 ml PBS (4 ° C) eklenmesi ve santrifüj ile hücreler yıkanır. 10 7 hücre başına 80 ul izolasyon tampon supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak.
    9. 10 7 hücre başına anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
    10. soğuk PBS ile 50 ml'ye doldurun ve santrifüj 450 xg, 4 ° C'de 10 dakika karıştırıldı.
    11. LS sütunları (3 ml izolasyon tamponu ile dengelenmeye) hazırlayın. Sütun aşırı yüklenmeyi önlemek PBMC'ler çok sayıda kırmızı kan hücreleri içeriyorsa maksimum 250 x 10 6 PBMC'ler, veya daha az bir sütun kullanın.
    12. supernatant ve tekrar süspansiyon c kaldır3 mi yalıtım tamponu arşın. LS sütun hücreleri aktarın. 15 ml tüpler naif CD4 + T hücreleri içeren akışı, toplayın.
    13. 2 mi yalıtım tamponu ile tüp durulayın. sütun aktarın.
    14. 3 mi yalıtım tamponu ile yıkayın kolon 3x. Sütun herhangi bir yeni sıvı eklemeden önce, damlama durana kadar hep bekleyin.
    15. 4 ° C'de (naif CD4 + T hücreleri) akışı ve santrifüj 450 xg 10 dakika sürer. Sütunlar iptal edilebilir.
    16. tamamen süpernatantı. Oda sıcaklığında 15 ml ortam santrifüj 450 xg, 10 dakika hücreleri yıkayın tamamen supernatant çıkarın.
      NOT: İzolasyon tampon kalsiyum iyonlarını şelatlayarak EDTA içerir ve bu nedenle T hücresi aktivasyonunu bozar. Herhangi bir stimülasyon deneylerinden önce tamamen yalıtım tamponunu çıkarın ve 15 ml ortam ile iki kere yıkama hücreleri.
    17. Ml başına 2-3 x 10 6 hücre T hücre kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Uygun bir şişeye o Rest in hücrelerr de inkübatör gece boyunca. Hücreler Simülasyon deneyleri için doğrudan kullanılan, bunları ortam ile bir kez daha yıkanır.
  3. Saflığı Kontrolü Boyama
    1. 20 ul, her bir yaklaşık 50,000 hücre (PBMC,; nTreg Tnaïve) atın.
      NOT: Tnaïve ve nTreg paneli hem lekeli isteniyorsa, 2 numune her alacak.
    2. örneğin, cihaz için uygun olarak 2 kere konsantre antikor ön-karışımı (PBS içinde) hazırlayın: Tnaïve paneli: CD4-PerCP 1: 5'tir; CD45RA-FITC ile 1:10 CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8 arasındadır. Treg paneli için, CD25-PE, 1:10 ile CD45RO-PE değiştirin.
      Not: CD25-mikro farklı epitopları tanıyan Yalnızca belirli CD25 antikorları, CD25 mikro boncuklar izole nTregs leke kullanılabilir.
    3. 20 ul hücre 20 ul antikor ön karışımı ekleyin. Ayrıca Batan akış sitometrisi için, her bir florokrom (örneğin, pozitif hücreler içeren PBMC'ler bir örnek kullanarak) ve boyanmamış örnek için, tek lekelenmelerinin hazırlanmasıgs ve tazminat.
    4. karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. 200 ul PBS ile her bir örnek doldurun ve 5-10 dakika santrifüj 450 xg.
    6. flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması (FACS) tamponu (= yalıtım tamponu EDTA olmadan) hücreleri alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Naif CD4 + T hücrelerinin saflığı genellikle>% 95 (bakınız Şekil 2).

2. Treg İndüksiyon Kültür

  1. Uyarım Medya ve Plates hazırlanması
    1. Hazırlanması ve ön-sıcak T hücre kültürü ortamı: serumsuz hematopoietik ortamı, 2 mM L-alanil-L-glutamin ile takviye edilmiştir.
    2. sitokin, stimülasyon antikor ve bileşik stok konsantrasyonları hazırlayın.
      1. IL-2, bir stok çözelti hazırlayın: 400.000 lU / ml steril süzme gerçekleştirilmiştir (aside dayanıklı filtre ile), 100 mM asetik asit (167 ug / ml kullanılan çok aktivitesi 1 ug 2,400 IU ise, sağlayıcı ile teyit). 0.5 ml tüpler bağlayıcı sterilize düşük protein Kısım, Parafilm ile mühür uzun süreli depolama için -80 ° C'de kuru buz ve mağaza dondurmak veya -20 kadar 3 ay süreyle ° C.
      2. (10 ug şişeye, taşıyıcı serbest), TGF-β1 stok çözelti hazırlayın: Santrifüj TGF-β1 tozu (1000 xg'de 3 dakika), 4 mM HCl'nin 100 ul stok solüsyonu hazırlamak için (ve aside dayanıklı filtre ile steril filtre edildi) 100 ug / ml, tamamen çözünmesine izin verirler; girdap. 0.5 ml tüpler bağlayıcı sterilize düşük protein her Kısım 5 ul, Parafilm ile mühür 6 aya kadar -80 ° C'de kuru buz ve mağaza dondurmak.
      3. ATRA stok çözelti hazırlayın: DMSO içinde 20 mg / ml (66.6 mM) bir toz içinde çözülür. 1 yıla kadar -80 ° C 'de, ışıktan koruyarak DMSO ve mağaza alikotları dilüsyondan, 10 mM'lik stok çözelti hazırlayın. ATRA ışık, ısı ve havaya duyarlıdır.
      4. rapamisin stok çözelti hazırlayın: alikotları 1 mg / ml (1.11 mM), DMSO, deposu için -80 ° C1 yıla kadar.
      5. Sodyum butirat stok çözelti hazırlayın: 0.908 M (0.1 mg / ml) stok, steril ultra saf H2O ve steril filtre. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    3. Tablo 1 'de T hücre kültür ortamı içinde 4x konsantre ön-kanşımlar (oyuk başına 50 ul) hazırlayın.
    4. önceki gün, anti-CD3 antikoru ile kaplayın plakalar. Film arzu PBS / ml anti-CD3 antikoru 5 ug, 65 ul 96 U-bölmeli plaka kuyu sayısı / oyuk. folyo ile plaka sarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe.
      NOT: 96 kuyu plakaların kenar kuyuları kullanmayın. Daha büyük kuyu kullanılabilir, ancak U şeklinde kuyuları deneyde alan başına, aynı hücre sayıları kullanımını kolaylaştırır. daha fazla hücre gerekirse, kültürden sonra kuyuların gerekli miktarda havuz. Genellikle, genişleme 4-6 gün sonra, 2 havuzların her örnek bir akış sitometri analizi ve RNA analizi için yeterlidir.
      1. kaplama gününde, kısa bir süre kaplama önce, anti-kaldırmakkuyu -CD3 çözeltisi. , 200 ul / PBS ile doldurun. PBS çıkarın. 200 ul / göz PBS ile yıkama tekrarlayın. tamamen PBS kaldırmak ve hemen tabak kullanın.
    5. plakaları (marj kuyuları kullanmayın) hazırlayın:
      1. Her iyi 4x anti-CD28 / IL-2 ön karışım 50 ul ekleyin (tüm iTregs için), 50 ul 4x TGF-β1 premix veya 50 ul T hücre kültürü ( "uyarılmamış" hücreleri hariç, T hücre kültür ortamı ekleyin) "stimülasyon sadece" yalancı kontrol için orta, 50 ul ATRA, ATRA / rapamisin veya bütirat premix (varsa) veya orta 4x
      2. 200 ul PBS ile, marj kuyular da dahil olmak üzere, tüm boş kuyu doldurun. 37 ° C /% 5 CO 2 öncesi sıcak plakaları.
  2. Kaplama için naif T Hücreleri hazırlayın
    1. Hücreleri dinlendikten sonra, 15 ml tüp transfer tüp önceden ısıtılmış T hücre kültür ortamı ve havuzlu şişesi / kuyu durulayın. T hücre kültür ortamı ile, 15 ml tüp doldurun. </ Li>
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje hücreleri.
    3. Ortamı çıkarın ve 2.2-2.6 x 10 6 / ml'lik bir yoğunluğa, taze, önceden ısıtılmış T hücre kültür ortamı içinde hücrelerini alır. Adım 1.2.2 olarak hücre sayımı ve gerekirse yoğunluğunu ayarlayın.
    4. (2.1), 50 ul hücre / oyuk (110,000-130,000 hücre / çukur) hazırlanmış stimülasyon plakaları hücreleri ekleyin. Her iyi hemen 200 ul toplam hacim içermelidir.
    5. ışıktan ATRA korumak için alüminyum folyo ile plakalar paketleme; istenen zaman dönemleri için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edilir.
  3. Treg İndüksiyon Kültür Monitör
    1. ışık mikroskobu (40X büyütme) tarafından Treg kültürleri izleyin. günde 2 ila yaklaşık 3'e kadar, çoğalan hücrelerin küçük kümeler daha sonraki zaman noktalarında daha büyük kümeler halinde birleştirmek olan görülebilir olacaktır. rapamisin ile üreyen kültürler, genellikle daha az büyür. Ayrıca bakınız Şekil 3.
    2. İstenilen zaman noktalarında, RNA e numune almakxtraction ya fenotipleme akış sitometrisi (aşağıya bakınız). Iyi hücre proliferasyonu, 1 sonraki zaman noktalarında için, her yeterlidir, başka şekilde akış sitometrisi için 1 x 10 5 -1 x 10 6 RNA hücreler her 3 x 10 5 -1 x 10 6 hücre sunar.
  4. FoxP3 İstikrarı Değerlendirilmesi
    1. Daha önce tarif edildiği gibi 22,27 iTreg fenotipinin stabilitesini değerlendirmek için, T hücre kültür ortamı ile iki kez iTregs yıkayın ve T hücre kültür ortamında kültive iTregs ya olmayan veya 2.1 ve 2.2 de tarif edildiği gibi, anti-CD3 ve anti-CD28 yeniden güdüleme ile . sitokinler ekle gibi 50 IU / ml IL-2, FoxP3 istikrar üzerindeki etkilerini incelemek için.
    2. İstenen zaman noktalarında, 22,28 tarif edildiği gibi (aşağıya bakınız) feno akış sitometrisi ve TSDR metilasyon analizi, RNA ekstraksiyonu için örnek alabilir.

Mah-PCR ile iTregs 3. Fenotipik Analizi

  1. HazırlanmasıÖrnekler
    1. İstenen zaman noktalarında, RNA ekstraksiyonu için örnek başına 1 x 10 5 6 10 x 1 hücreleri alır. 5 dakika boyunca 500 xg'de bir RNaz içermeyen 1.5 ml tüp, ve santrifüj hücreleri aktarın.
    2. Gerekirse, yüzer bir kısmını çıkarmak ve enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ya da benzer bir analiz için dondurma. hücrelerin tamamen süpernatant geri kalan çıkarın. RNA ekstraksiyon doğrudan devam veya en fazla 2 hafta boyunca -80 ° -20 ° C'de kuru buz ve mağaza hücre pelet dondurmak.
    3. Standart protokollere göre RNA ekstrakte edin ve FOXP3 (örneğin, RPL13A gibi) bir ev bakıcısı geni QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Buna ek olarak, diğer regülatör imza genlerin ekspresyonunu ölçer (örneğin 'regülatör up' genler IL2RA CTLA4, IKZF4 ve' regülatör down' genler IFNg, SATB1).

Akış Sitometrisi ile 4. Fenotipik Analizi

NOT: Bu protokol leke için optimize edilmiştir3 x 10 5 -1 x 10 6 hücre ile 96U kuyucuklu bir plaka biçiminde ing. oyuk başına daha az hücre varsa, aşağıda tarif edildiği gibi, çok sayıda kuyu ve havuz ile başlar.

  1. Hücre yeniden güdüleme (İsteğe bağlı)
    1. Hücre içi sitokin boyaması için isteniyorsa, Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile darbe hücre / protein taşınma inhibitörünün mevcudiyetinde İyonomisin.
      NOT: Bu prosedür yukarıda tarif iTreg kültürlerinde FoxP3 ekspresyonunu etkilememektedir, ancak diğer belirteçler değişebilir - örneğin, CD4 aşağı regüle edilir.
    2. Bir stok çözeltisi Brefeldin 1: T hücre kültür ortamı içinde 10 x Brefeldin A / PMA / İyonomisin ön-karışımı (oyuk başına 20 ul) hazırlayın 100, İyonomisin (stok 5 mg / ml) 1: 1300, PMA (stok 12.35 mg / ml, önceden -dilute 1: 1235) 1: önceden seyreltilmiş hisse 100.
    3. 1.000 Brefeldin A, 0.5 μ: 4 saat boyamadan önce, 1 uç konsantrasyonlarını elde etmek için kuyu başına 20 ul Brefeldin A / PMA / Genişleme 10x karışımı ekleyinM (375 ng / ml) İyonomisin, 10 ng / ml PMA.
    4. 37 ° C /% 5 CO2 de 4 saat inkübe
  2. yüzey Boyama
    NOT: Burada önerilen panel öneri; diğer paneller ilgi ve enstrüman kurulum antijenler bağlı kullanılabilir.
    1. Buz üzerinde PBS soğutun. ve buz üzerinde soğuk (% 0.5 insan serum albümini, HSA ile PBS) FACS tamponu hazırlayın. BSA veya HSA FBS alternatif olarak kullanılabilir.
    2. boyama plaka Re-plaka hücreleri: süspanse bir pipet ile hücreleri ve iyi (daha sonra boyama işlemi taşkınlığın önlemek için) her biri yaklaşık iyi bir özgür bırakarak, yeni bir 96U plaka içine hücreleri aktarın. İstenilen hücre sayıları daha az orijinal kuyuda varsa, iyi bir boyanma içine birkaç kuyu tabanda önce süpernatant kısmını çıkarın ve havuz.
    3. Santrifüj plaka, oda sıcaklığında, 10 dakika boyunca 400 x g.
    4. süpernatantı. Atık kutusu içine süpernatant dökmek baş plaka bırakınaşağı ve hemen (plaka geri dönüş olmadan) emici kağıt üzerinde bir kez plaka dokunun. Sonra hemen plaka geri çevirmek. Vortex plaka Kalan sıvıyı hücreleri tekrar süspansiyon.
    5. ve tekrar süspansiyon: 25 ul yüzey boyama premix (FACS tampon 5 CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1) ekleyin.
      Not: Ayrıca, ilgili antijen pozitif hücreler içeren örnekleri ile kullanılan fluorochromes her biri için tek lekelenmelerinin şunlardır; ve lekesiz bir örnek bulunur. Bu cihaz tazminat kurulum için gerekli olacaktır. Alternatif olarak, tazminat boncuk kullanmayın.
    6. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 ul PBS, santrifüj plakası 400 xg ekleyin ve adım 4.2.4 tarif edildiği gibi supernatant çıkarın. Girdap plakası.
    8. Adımı yineleyin 4.2.7 kez.
  3. geçerlilik boyaması
    NOT: sabitleme / permeabilization sonra ölü hücreler yeterince tarafından göz ardı edilemez çünkü Canlılık boyama, vazgeçilmezdirfsc / ssc ve belirsiz sinyallere yol açabilir. Bir tamir edilebilir canlılığı boya kullanılması gerekir.
    1. Süspanse 130 ul canlılığı leke ön karışım hücreler (sabitlenebilir canlılık boya eFlour780 PBS içerisinde 1: 1400) ve çok kanallı pipet ile hemen tekrar süspansiyon hücreleri.
      Not: Ayrıca birkaç gün süre ile kültüre örneğin ölü hücreleri, stimüle edilmemiş T hücreleri ihtiva eden ve üreticinin talimatlarına ile olduğu gibi ısı uygulanarak hücrelerini öldürmek canlılık boya için tek bir boyama bulunmaktadır. Bu dengelemesi için gerekli olan olacaktır.
    2. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje plaka. Adım 4.2.4 olarak süpernatantı. Girdap plakası.
    4. 200 ul FACS tamponu ile doldurun. Adımı tekrarlayın 4.3.3.
    5. 200 ul PBS ile doldurun. Adımı tekrarlayın 4.3.3.
  4. FoxP3 Boyama Tampon Seti ile Hücre içi boyama
    1. Her bir kuyu için hazırlamak: 150 ul Fix / Perm tampon (sulandırmak Fix / Perm konsentrate 1: seyreltici ile 4); 850 ul 1x permeabilizasyon tamponu (ultra saf H2O ile 10x permeabilizasyon tamponu 1:10 seyreltilir).
    2. vorteks sonra tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul Fix / Perm tamponunda ve hemen pipet ile tekrar süspansiyon. Hemen hücre topaklarının tespit önlemek için tekrar süspansiyon önemlidir.
      Dikkat: Sabitleme tamponu paraformaldehid içerir ve ele ve uygun atılmalıdır.
    3. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    4. 100 ul soğuk PBS ilave edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin.
      NOT: Bu adımda itibaren santrifüj hızı hücrelerinin kaybını önlemek için artar. Tespit edildikten sonra, hücreler görünmez hale gelir ve adım 4.2.4 de açıklandığı gibi ve santrifüj hücre kaybını en aza indirmek için bittikten hemen sonra bakım süpernatantlar kaldırmak için önlemler alınmalıdır.
    5. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
      NOT: boyama bu aşamada durdurulmuş olabilir; içindeBu durumda, 200 ul PBS ile iki kez hücreleri yıkayın; Daha sonra, 250 ul PBS içinde yukarı ve ışıktan korunan, 4 ° C'de depolayın. Hücreler birkaç gün saklanabilir, ardından permeabilization devam edin. doğrudan Permeabilization devam Ancak, en iyi sonuçlar elde edilir.
    6. Vortekslemeden sonra, 200 ul permeabilizasyon tamponu ilave edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
    7. tekrar süspansiyon 200 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin.
      NOT: Burada, numuneler hücre içi boyama ve izotip kontrol numunesi bölünebilir (her numunenin uzakta yarısını almak). hücre sayıları sınırlayıcı ise, bir havuza izotip örneği (uzak her bir örnek ve havuz 10-20 ul almak) hazırlanabilir. Ayrıca, numuneler Floresan-Eksi-Bir (FMO) kontrolleri için alınabilir.
    8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
    9. içinde süspanse pelet(Önceden karıştırılmış) 44 ul permeabilizasyon tamponu artı 1 ul normal fare serumu Spesifik olmayan bağlanma bloke etme.
      Not: Bir sonraki adımda kullanılan antikorlar murin izotipi vardır, bu geçerlidir. Bu, sıçandan türetilmiş diğer antikorlar, kullanıldığı takdirde, (örneğin, sıçan serumu) bloke edilmesi için uygun bir serum içerir.
    10. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    11. antikorlar ekleyin:
      NOT: Belirli Lotların antikor konsantrasyonları bilgi. İlgili fluorochromes yüzey antijenlerine karşı antikorlar (örneğin, CD4) ile adım 4.2 yapılan değilse, ayrıca tazminat pozitif hücreler içeren örnekleri ile kullanılan fluorochromes her biri için tek lekelenmelerinin içerir.
      1. (Tek boyamalar, boyanmamış numunelerin, izotip kontrol örnekleri ve FMO kontroller hariç) örnekleri 15 ul antikor premix ekleyin: numune başına karışımlar: 0.7 ul (0.35 ug), anti-interferon gamma (IFN-γ) -FITC (yeniden uyarıldıktan sonra eğer uygulanabilir )2.3 ul (0.115 ug) CTLA-4 Mor 421, 2 ul (0.05 ug) Anti FoxP3-APC, 10 ul PBS Parlak.
      2. 4.4.11.1 kullanılan antikorlar gibi antikorun, aynı miktarları kullanılarak, kontrol numuneleri izotip 15 ul izotip antikor ön-karışımı ekleyin: numune başına karışımlar: 0.7 ul (0.35 ug) fare IgG1 K izotip kontrol FITC (eğer varsa), 0.58 ul (0.115 ug) fare IgG2a-BV421 izotipi, 0.5 ul (0.05 ug) fare IgG1 K izotip kontrol APC, 13.2 ul PBS ile yıkandı.
      3. FMO kontroller için, PBS ile bir antikor, her yerine 4.4.11.1 gibi antikor ekleyin.
    12. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    13. 200 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin. Santrifüj, adım 4.4.8 deki gibi süpernatant ve vorteks çıkarın. kez tekrarlayın.
    14. (Hacim kullanılan enstrümana göre) ve akış sitometresinde, ideal olarak hemen elde soğuk FACS tamponu yeniden süspanse hücreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 deney düzeneği bir şemasını göstermektedir. Şekil 2, manyetik izole saf CD4 + T hücreleri ve nTregs için temsili bir saflıkta kontrol boyamasını göstermektedir.

F ŞEKIL 3A yolluk stratejisi sitometri akışını gösterir ve Şekil 3B temsilcisi FoxP3 ve CD25 belirtilen iTreg veya kontrol koşulları altında kültür 6. günde boyamalar flow sitometri gösterir. İn vitro uyarma üzerine en hücreleri rapamisin mevcudiyetinde azaltılır CD25, yukarı doğru düzenleyen. Sadece iTreg uyaran faktörlerin eklenmesiyle, FoxP3 + hücrelerinde açık bir popülasyon da iTreg koşullar altında CD25 + hücreler içinde zenginleştirilmiş olan, belirgin hale gelir. Şekil 3C karanlık kümeleri olarak görülen hücrelerin çoğalan ile mikroskop iTreg kültürlerin fenotipik görünüm göstermektedir. her i Bu kültür koşulları altında, TGF-β hafif proliferasyonunu arttırır ve ATRA daha proliferasyonunu arttırır: regülatör durum, hücre çoğalması bir spesifik ve üretilebilir modelini gösterir. Aynı zamanda, rapamisin ile proliferasyonunun inhibisyonu kuvvetli düşük küme boyutu ile belirgindir. çoğalma gücü mikroskopik görünümü de toplam hücre sayısı karşılık (veri dahil değildir).

QRT-PCR Şekil 4, Örnek sonuçlar iTreg (ve kontrol) FoxP3 mRNA indüksiyonu, farklı zaman noktalarında kültürlerin analiz eder. FoxP3 proteini için olduğu gibi, FoxP3 mRNA ekspresyonu rapamisin ile muamele iTregs diğer iTregs göre nispeten düşük seviyelerde sahip olan, stimüle edilmiş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında tüm iTregs daha yüksektir. NTregs bölgesindeki FoxP3 mRNA iTregs daha yüksektir.

ES / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg "/>
Şekil 1: iTreg indüksiyon, nTreg izolasyon ve Treg analizi için deneysel şeması. İnsan naif CD4 + T hücrelerinin ince beyaz kat izole edildi ve anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları artı 100 U / ml IL-2 ile 6 güne kadar ya yokluğunda ( 'yalancı kontrol hücreleri ile serumsuz ortam içinde uyarılmıştır ') veya farklı regülatör T uyaran faktörlerin varlığı belirtildiği gibi (' iTreg'). nTregs üretme izole edilmiş ve paralel olarak deneye tabi tutulur. Fenotipik analizi, akış sitometrisi ve QRT-PCR ile yapılabilir. Schmidt, A. ve ark modifiye. 2016 22. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: popülasyonları başlangıç Hücre saflık. Saf insan CD 4 + T hücreleri naif CD4 + T hücre Isolation kiti II insan ile izole edildi. Üst panel: naif CD4 + T hücresi saflığı, CD4, CD45RA ve CD45RO göre,% 98 94 ve en fazla 30 ait temsili bir verici saflık ( 'Tnaïve') gösterilmektedir. Ex vivo Tregs ( 'nTreg') CD25 mikro boncuklar sınırlı miktarları kullanılarak izole edilmiş ve iTreg deneyleri için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. CD25 ve CD4 göre temsili bir verici, bir nTreg saflık gösterilmiştir. Alt panel: (Şekil 3 ve canlı CD4 + hücreleri üzerinde önceden kapı olarak gerçekleştirilen) Hücre içi FoxP3 boyama üst panel aynı donörden hücreleri kullanılarak sırasıyla saf CD4 + T hücreleri ve nTregs için gösterilir. Schmidt, A. ve ark modifiye. 2016 22. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Şekil 3,
Şekil 3: iTregs ve nTregs fenotipik görünüm. İnsan naif CD4 + T hücrelerinin belirtilen koşullar altında serumsuz ortam içinde kültürlenmiştir. T-hücreleri anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları artı 100 U / ml IL-2 ( 'Stim.') ile uyarıldı. burada, belirtilen TGF-β1 ( 'TGF'), rapamisin (' Rapa'), tümü trans retinoik asit ( 'ATRA') ya da bütirat ilave edildi. nTregs üretme (izole edilmiş ex vivo çevresel kan CD25 ++ hücreleri) uyarılmamış ( 'unstim.') sol ve pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Uyarılmamış naif T hücreleri negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (A), kültürün 6. günde, hücreler, anti-CD25 ve anti-CD4 dahil olmak üzere yüzey antikorlar, daha sonra tamir edilebilir canlılığı boya ile boyanmış ve ardından, sabit / geçirgenleştirildi ve anti-FOXP3, anti-CTLA-4 veya izotipi ile hücre lekeli ile boyanmıştır devamı ROL antikorlardır. Toplama ve tazminat sitometresi Mavi ADP akışı üzerinde gerçekleştirildi ve veri FlowJo yazılımı ile analiz edilmiştir. yolluk strateji kırmızı oklarla gösterilen ve gösterilen örnek TGF + ATRA ile uyarılan bir iTreg örnek mesafesindedir. (B) hücreler, (A) 'deki gibi lekeli ve kontrol T hücreleri ve farklı protokollerin neden iTregs içinde FoxP3 ve CD25 ekspresyonu gösterilmektedir. Pseudocolor araziler, (A) 'deki gibi, CD4 + hücreler canlı bir verici, tekli ön kapılı için Örnek FoxP3 ve CD25 lekelenmelerinin göstermektedir. izotip örnek iTreg için gösterilmiştir (stimülasyonu. + TGF + ATRA) numune. 4 gün süre ile kültüre hücrelerin ayrı 96U plaka kuyuları (C) Örnek mikroskobu görüntüleri (40x büyütme). Hücrelerin karanlık kümeleri çoğalan hücreleri temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Şekil 4,
Şekil 4: iTreg farklılaşması için farklı protokoller kullanımına bağlı FoxP3 mRNA ifadesi. iTregs belirtilen koşullar altında, Şekil 3'teki gibi elde edildi ve belirli bir zaman noktalarında, hücre örnekleri alınmıştır ve RNA ekstre edildi. Uyarılmamış naif T hücreleri ve uyarılmamış nTregs üretme, 0 Örnekler QRT-PCR ile analiz edilmiştir günde numuneler alınmış ve FoxP3 mRNA ifadesi, her numune için RPL13A ekspresyonuna normalleştirilmiştir. Uyarılmamış naif T hücrelerinde FoxP3 mRNA ekspresyonu 1'e set ve hesaplanan FoxP3 mRNA katlı değişim oldu. ortalama değerlerdir gösterilmiş ve PCR aralığı temsili bir donör için kuyu çoğaltırlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan protokol, insan CD4 + FoxP3 + insan naif CD4 + T hücrelerinden iTregs sağlam indüksiyon sağlar. Biz üstün in vitro baskılayıcı fonksiyonu 22 iTregs uyarılması için, TGF-p, ATRA ve rapamisin bir arada kullanarak, son zamanlarda açıklanan yeni bir protokol içerir. Diğer yayınlanmış protokollere göre, bir başka avantajı, tek başına IL-2 varlığında, aktive edilmiş olan kontrol hücreleri ile birlikte, belirli bir iTreg uyaran faktörlerin etkileri doğrudan karşılaştırma sağlar farklı protokoller ile paralel farklı iTreg popülasyonlarının indüksiyonu, olduğu . açıklanan protokoller düşük donör değişim ile FOXP3 tekrarlanabilir indüksiyon sağlar. Bu protokol naif CD4 + T hücrelerinin, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile izole edilmiş, fakat, floresan aktive hücre sıralama da mümkündür edilir. Bu protokol ile naif CD4 + T hücrelerinin beklenen verim, tipik haliyle% 5-10 arasındadır ama şiddetle donör (yaşa) bağlıdır ve eritrositlerin yüksek fraksiyonları mevcut olduğunda aynı zamanda daha düşük görünmektedir. tahmini bir ihtiyaç varsa, PBMC'ler monosit tükenmesi adımı sırasında (adım 1.4) lekeli olabilir. Tipik haliyle, saf CD4 + T hücrelerinin verimi PBMC leke "lenfosit kapısı yüzdesi saf CD4 + T hücrelerinin" yarısı ile ilgilidir. Bu protokol CD25-yüksek (nTreg) hücreleri 29 elde etmek için CD25 boncuk sınırlı miktarda kullanır. Bununla birlikte, bu, saf Tregs değildir, ancak bunlar sadece pozitif bir kontrol olarak kullanılmak üzere Tregs açısından zenginleştirilmiştir. Saf Tregs gerekirse, diğer setleri (CD4 zenginleştirme ve CD127-tükenmesi ile kombine şekilde) kullanılmalıdır ya da seçenek olarak, CD25 + hücreleri, 10 7 hücre başına 8 ul CD25 boncukları ile önceden zenginleştirilmiş ve lekeli ve floresan-aktive edilmiş hücre tarafından kriteri sıkı CD4 + CD25 ++ perdeleme ile sıralama. Aynı zamanda CD127 dışlanma gibi diğer belirteçlerin, dahil, dikkate alınmalıdır.

_content "> FoxP3 düzenlemesi, iTregs nTregs farklı olduğunu not etmek, ancak önemli olan iTregs, örneğin belirli yönlerini incelemek için kullanılabilir olsa da bu FoxP3. gereklidir fakat regülatör kimliğini 30 kazandırmak için yeterli değildir dikkate alınması önemlidir nTregs ve iTregs arasındaki fark nTreg ve iTreg transcriptome ancak kısmen üst üste ile örneklendirilir çeşitli yönleriyle. karşılaştırma için, tüm deneylerde iTregs paralel olarak (ideal aynı donörden elde edilen) bir kültür nTregs nedenle çok önemlidir. ölçüldüğünde sıçangil iTregs 31. FOXP3 ek olarak diğer regülatör imza genler bu nedenle ölçülmelidir ve insan hücrelerinde aktivasyon kaynaklı FoxP3 ifadesinden ayrımı sağlamak. Örneğin, iTregs CD25 yüksek ifade göstermeli, CTLA-4 ve EOS karşılaştırıldığında Daha önce yayınlanan aktive edilmiş T hücreleri için IFN-y ve SATB1 ekspresyonu nTregs burada tarif edilen protokol ile uyarılan iTregs düşük olması gerekirken 13 FoxP3 lokusunda TSDR bölge metilasyonu tekabül iTregs sabit FoxP3 ifade olmaması. Ayrıca genom ölçekte, bu kemirgen iTregs DNA metilasyon ve histon modifikasyonları epigenetik desenler nTregs 30 bulunan desenleri yansıtmadığı açıklanmıştır. Daha önce burada neden iTregs TSDR demetilasyon sergilemedi, nTregs aksine, protokoller tarif açıklanan. Bu duruma göre, iTregs yeniden uyarılan zaman Foxp3 kaybetmiş, ancak IL-2 ve yeniden güdüleme 22 olmadan mevcudiyetinde de kültürlenmiştir FoxP3 ifade etmiştir. İlginçtir, M2 makrofaj üst fazlar kullanarak alternatif bir protokol ile uyarılan iTregs FoxP3 indüksiyon 27 TSDR demetilasyon ve TGF-β olma etken olmamasına rağmen, FoxP3 istikrar gelişmiş görüntülenen.

iTreg modifikasyonuÇok yakın zamanda 32 tarif edildiği gibi, on-on Translokasyon (TET) metilsitozin dioksijenaz enzimleri etkileyen (örneğin, vitamin C veya hidrojen sülfit gibi) bileşiklerin eklenmesi ile protokolleri indükleyen - 34 DNA metilasyonu etkileyerek Foxp3 stabilize ekleyebilir. Ayrıca, uyarım gücü ve zamanlama FoxP3 ifade ve istikrar 35 üzerinde bir etkiye sahiptir. Bu doğrultuda, yerine levha bağlı antikorların Boncuk bağlanmış CD3 / CD28 antikorları kullanımı TSDR demetilasyon 36 bağımsız olsa sıçangil iTreg in vivo baskılayıcı fonksiyonu ve kararlılığını artırmak için gösterilmiştir. varyasyon potansiyel kaynağı olarak dikkate alınması gereken bir diğer faktör daha sığır kaynaklı insan hücreleri ile% 100 çapraz-reaktif olan TGF-p tanımsız faktörler içerir serum kullanımıdır. Ayrıca, IL-2'nin, kaynak ve aktivitesi büyük ölçüde FoxP3 indüksiyonu sonucunu etkileyebilir.

Önemli bir fTregs eature bu protokolde oluşturulan iTregs ile sonradan test edilmesi gerekmektedir onların baskılayıcı yeteneğidir. ITregs ile bastırma deneyleri önemsiz olmadığı unutulmamalıdır ve iTregs baskılayıcı yetenekleri hakkında literatür tartışmalıdır. Bu karboksifloresan süksinimidil ester (CFSE) sulandırılması olarak çıktılan akış sitometrisi göre in vitro proliferasyon deneyleri ile 41 en yaygın olarak kullanılan - çeşitli yöntemler ve protokoller, insan Tregs başka 22,37 yayınlanmıştır baskılayıcı fonksiyonunu değerlendirmek için. Yıkama ve söndürme tahlillerinde kullanımdan önce iTregs dinlenme önemlidir ve bu iTregs, nTregs aksine, anerjik olmayabilir ama söndürme deneyleri sırasında kendilerini çoğalan göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Bu, IL-2 tüketen, son derece önemli bir kontrol bastırıcı hücreler CTLA-4 salgısının yoluyla, spesifik olmayan bastırma (derecesinin belirlenmesi için mock' T hücrelerini stimüle kullanmak çok dikkateption ve FoxP3 + regülatör T spesifik etkileri ilgili olmayan aktive edilmiş T hücreleri ile kültür büyümesi) ve bu kontrol sık olmaması literatürde bazı tartışmalara katkıda bulunabilir. Bu kontrolü kullanarak, sadece TGF-β / ATRA / Rapa kaynaklı iTregs vitro 22 baskılayıcı aktivite gösterdiğini belirledi. Böylece, baskılayıcı aktivitesi ile ilgili olarak (FoxP3 + hücreleri değil yüksek fraksiyonu olsa da), TGF-β / ATRA / Rapa iTregs indükleme tarif edilen protokollere yapılan faktörler en iyi kombinasyonu olduğu sonucuna varıldı. Bununla birlikte, in vitro baskılayıcı aktivitesi mutlaka in vivo baskılayıcı aktivitesi yansıtmaz ve gerçekten de bu protokoller tarafından üretilen insan iTregs en az 22 test edilen koşullar altında bir ksenogeneik greftleme karşı -host hastalık modelinde bastırmak olmadığını tespit ettik. Bu TSDR demetilasyon 22 eksikliği ile uyumlu olarak, tekrar uyarıyı takiben iTregs kayboldu dengesiz FoxP3 ekspresyonu ile ilişkili olabilir

hangi iTreg özelliklerinin yönü (FOXP3 + hücrelerinin yüksek fraksiyonu, üstün baskılayıcı aktivite, FoxP3 istikrar) belirli bir araştırma sorusu için en önemli olan bağlı olarak, farklı protokoller zor genellikle 'en iyi tanımlamak için render, bu soruları incelemek için en uygun olabilir Treg indüksiyon için 'protokol. Ayrıca, çeşitli yukarıda açıklanan ince deneysel farklılıklar sonuçları etkileyebilir ve hatta iTreg nesil 42 için görünüşte benzer protokolleri ile raporlar arasında görünen TGF-β-kaynaklı iTregs fenotipi ve baskılayıcı fonksiyonu açısından tartışmalara katkıda bulunabilir. Örneğin, hatta, bir laboratuarda, serum ihtiva eden RPMI ortamı içinde TGF-p ve IL-2 ile indüklenen iTregs bazı bastırıcı aktivitesi, TGF-β / IL-2 ile indüklenen iTregs üretilen ise, hücreler 27 kontrol ile karşılaştırıldığında gösterdiği görülmektedir tanımlanmış serumsuz T hücre kültürü ortamı olup 22, D miFOXP3 benzer düzeylerde espite.

Bu protokollere dayalı gelecekteki uygulamalar ayrıca sitokin üreten efektör T hücreleri ve optimum baskılayıcı aktiviteye dönüşüm olmadan istikrarlı FoxP3 ifadesi, TSDR demetilasyon, istikrarlı fenotip ile bir fenotip elde etmek için Treg indüksiyon koşulları optimize etmek için gayret göstermelisiniz. adaptif transfer otoimmün ve inflamatuar hastalıkların potansiyel tedavisi için son derece umut vericidir Treg transferi hangi terapi gelecekte, yaklaşımları için iTreg indüksiyon protokolleri daha da geliştirilmesi yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA, FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99.7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
Human serum albumin 50 g/L Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 eBioscience 17-4714-42
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 μg eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution: contains paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

Immunology Sayı 118 düzenleyici T hücreleri regülatör CD4 + T hücreleri manyetik hücre izolasyonu, sitokinler FoxP3 TGF-β IL-2 hücre içi sitometrisi QRT-PCR Akış
Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 <sup>+</sup> T hücrelerinden insan CD4 <sup>+</sup> FoxP3 <sup>+</sup> Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) <em>in vitro ayrımında</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, A., Éliás, S.,… More

Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter