Summary
מחקר זה מדווח על שיטה מוצלחת של תא סטרומה נגזרת רקמת שומן endoscopical (ADSC) -תווים השתלה למניעת היצרות ושט לאחר דיסקציה submucosal אנדוסקופית מורחבת (ESD) במודל של חזירים.
Abstract
בשנים האחרונות, מבנה התא גליון דרבן עניין רחב ברפואה רגנרטיבית, במיוחד עבור ניתוחים שיקומיים. פיתוח הטכנולוגיות מגוונות שילוב תאי סטרומה רקמת נגזרות שומן (ADSCs) עם חומרים ביולוגיים שונים הוביל לבניית סוגים רבים של תחליפי רקמות מהונדסות, כגון עצם, סחוס, ורקמות שומן מן המכרסם, חזירי, או ADSCs אדם. דיסקציה submucosal אנדוסקופית של הוושט המורחבת (ESD) אחראי להיווצרות היצרות הוושט. מניעת היצרות נותרת מאתגרת, ללא טיפולים יעילים זמינים. מחקרים קודמים דיווחו על האפקטיביות של השתלת תאי גיליון רירית במודל כלבים ובני אדם. ADSCs מיוחסת תכונות אנטי דלקתיות, אפקטי אפנון חיסון מקומיים, נאווסקולריזציה אינדוקציה, ויכול בידול לתוך mesenchymal שושלות הלא mesenchymal. במחקר המקורי זה מתאר את tra אנדוסקופיתnsplantation של מבנה רקמות מהונדסות ADSC למנוע היצרות הוושט במודל החזירים. בונת ADSC הורכבה משתי יריעות ADSC אלוגנאית שכבתיות על אחד את השני על קרום תומך נייר. ADSCs תויג עם fluorophore PKH67 לאפשר endomicroscopy ליזר confocal מבוסס בדיקת ניטור (pCLE). ביום ההשתלה, ESD 5 סנטימטר היקפי-חמה ידועה לגרום היצרות ושט בוצע. בעלי חיים מיד הושתלו אנדוסקופית עם 4 מבנים ADSC. ההידבקות המוחלטת של מבני ADSC הושגה לאחר 10 דקות של יישום עדין. בעלי חיים הוקרבו ביום 28. כל בעלי החיים הושתלו בהצלחה. השתלה אושרה ביום 3 עם הערכת pCLE חיובית. בהשוואה לבעלי חיים מושתלים, חיות ביקורת פתחו חומרות חמורות, עם התפתחות רקמה גדולה fibrotic, צרות עיכול תכופות יותר, ועלייה במשקל מופחת. במודל שלנו, יושתל allogeniג ADSCs, מאורגן בסדיני תא כפולים, לאחר ESD המורחבת היה מוצלח קשר חזק עם שיעור היצרות ושט תחתון.
Introduction
הנהלת גידולים בושט שטחי השתנתה עם התפתחות טכניקות אנדוסקופית חדשה. כיום, כריתה אנדוסקופית הוא טיפול הקו הראשון. ואכן, היא מזוהה עם שיעורי תחלואה ותמותה נמוכים יותר מאשר ניתוח עם תוצאות אונקולוגי שווות 1, 2, 3. כריתה הרירית אנדוסקופי (EMR) ו כריתה submucosal אנדוסקופית (ESD) הן טכניקות ביותר בשימוש נרחב. במקרה של גידול שטחי מורחב, ESD היא מועדפת. לעומת EMR, ESD מאפשר כמקשה resectioning, ללא קשר לגודל הנגע ולעצב 4, 5, 6. הסיבוך העיקרי של עיכוב ESD הוא היווצרות היצרות הוושט, אשר מתרחשת בדרך כלל בין שבוע לשבועיים לאחר כריתה. מחקרים שפורסמו לאחרונה הראו היווצרות צרות מתואמת אלגודל של הכריתה. אגודת אנדוסקופי היפנית ממליצה הימנעות ESD מגודלו ¾ של היקף הוושט כי הם קשורים עם התפתחות היצרות בלמעלה מ -90% ממקרים ואחראים הצרות אכילה חמורות והידרדרות מרכזית באיכות החיים.
מניעת היצרות ושט נותרת מאתגרת. מנגנוני המעורבים היווצרות צרות הם רק מוכרים חלקית. צרות תצורות נראית לנבוע התאחדות שני מנגנונים שונים: (1) גיוס הסלולר פרו-דלקתי (2) פיתוח סיסטיק מוגזם 7. טיפולים מונעים מספר הוצעו. עם זאת, התוצאות היו לא מספקות, עם יתרון קטן ותופעות לוואי חמורות 8, 9. לאחרונה, צוות יפני, Ohki et al. , הציע להשתיל גיליון תא בודד-שכבה של תאים ברירית הפה עצמיים לתוך esophצלקת ageal. השתלה בוצעה מייד לאחר ESD 10, 11. הם הדגימו את היעילות של גישה חדשנית זו, תחילה מודל כלבי ואחר כך בחולים.
רקמת הנגזרות השומן בתאי סטרומה (ADSCs) מבטיחים ברפואה רגנרטיבית. בקשתי בכמה תחומים הוכיח תוצאות מעניינות, במיוחד בתהליך ריפוי הפצע. טיפול ADSC מציע מספר יתרונות, כי התאים הם מבודדים בקלות ומזוהות עם תכונות אנטי-דלקתיות, תופעות מערכת חיסוניות מקומיות, נאווסקולריזציה אינדוקציה, ויכול בידול לתוך mesenchymal שושלות הלא mesenchymal 12, 13, 14.
במחקר קודם, צוות שלנו הוכיח את היעילות של השתלת אנדוסקופית כפולה ADSC גיליונות קודם היצרות ושטention לאחר ESD ממושכת מודל החזירים 15. במאמר זה, דיווחים על בניית ADSC גיליון וטכניקת השתלת endoscopical מוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות טופלו לפי ועדת האתיקה מחקר בעלי חיים (הנחיות משרד החקלאות הצרפתי). הפרוטוקול קיבל את אישור ועדת האתיקה המקומית הסמיכו ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת דקארט בפריז (מספר רשום 2035.02 MESR; הפקולטה לרפואה פריז דקארט, פריז, צרפת).
תרבות תיוג 1. ADSC
- השג אשר ADSCs ממוסד פרטית. ADSCs אלוגנאית תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם מדיום חיוני מינימום אלפא כוללים בסרום עגל 10% עובריים 1% אנטיביוטיקה (פניצילין סטרפטומיצין).
- השג סביב 24 x 10 6 ADSCs לכל חיה באמצעות נהלי הרחבת תא סטנדרטיים (37 ° C ו 5% CO 2). קציר ADSCs באמצעות פתרון טריפסין סטנדרטי (10 מ"ל למנה T150). בצעו ספירת תאים עם hemocytometer.
- בצע תא תיוג היום לפני ההשתלה באמצעות יחסי ציבור מכתים PKH67ocedure כמתואר להלן.
הערה: מטרת ההליך המכתים היא לאפשר תא מעקב לאחר השתלה.- כדי תווית 2 x 10 6 ADSCs, להכין פתרון (2 x 10 6 תאים עם 100 μL של הממס C) פתרון B (4 μL של PKH67 עם 1 מ"ל של הממס C).
- דגירת פתרונות A ו- B למשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של נסיוב עגל העוברי דקות 1.
- יש לשטוף את הפתרון עם 300 μL של citrated RPMI (298.5 μL של RPMI ו -1.5 μL של ציטראט) ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו 2 פעמים. שמור את התאים שכותרתו ולהגן עליהם מפני האור עד הבנייה וכו '.
2. Construct הזוגי ADSC הגיליון
- יום לפני ההשתלה, להכין צלחת תרבית תאים טמפרטורה-תגובה 12 גם עם 4 מ"ל לכל טוב של המדיום תרבית תאים, כמתואר לעיל, לפני PKH תיוג. זרעי הצלחת עם 1.5 x 10 6 PKH-labeleתאי ד לכל היטב דגירה במשך 12 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- ביום ההשתלה, לנתק את גיליון התא ומחובר על ידי דוגרי הצלחת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- לשאוב בעדינות גיליון ADSC אחד עם טפטפת שכבת אותו על נייר הידרופובי (קוטר 1.5 ס"מ). השתמש בנייר זה כמו קרום תמיכה.
- אחוז אחר גיליון ADSC בעדינות להפקיד אותו על גבי אחד את השני כדי להשיג מבנה שכבה כפולה.
- חזור על הליכים אלה להשיג כמה שיותר בונה ADSC גליון לפי הצורך (4 לכל חיה).
3. הושט Submucosal אנדוסקופי Dissection (ESD)
- ביום ההשתלה, מראש בתרופות החיות עם 10 מ"ג / ק"ג של קטמין שרירית ולגרום להם עם 8 מ"ג / ק"ג של propofol תוך ורידי. לאחר מכן, לבצע אינטובציה endotracheal ולשמור על הרדמה עם שאיפה 2.5% isoflurane.
- לאחר שהחיה היא בהרדמה כללית, לבצע ESD עם gastroscאופ, videoscope, ויחידת electrosurgery.
- משתמשים בסכין אנדוסקופית וקרישה רכה להשיג סימני הגבי-היקפי חמים הנעים בין 40 סנטימטר ל -45 סנטימטרים מן קשת השיניים.
- להזריק פתרון גליצרול המכיל צבע אינדיגו ארגמן לתוך שכבת Submucosal להפרדת השכבה הרירית משכבת שרירים.
- משתמשים בסכין אנדוסקופית עם סגנון שאני endocut להשיג חתכים היקפיים.
- משתמשים בסכין אנדוסקופית עם מצב קרישה נאלץ לבצע דיסקציה submucosal, נע מן החתך הפרוקסימלי החתך דיסטלי.
- בסוף הליך ESD, לקיים את החם היקפי, 5 סנטימטר באורך צלקת ושט חושפת את מצע השרירים.
4. השתלת אנדוסקופי
- מיד לאחר ESD, אנדוסקופית להשתיל חיות עם 4 מבנים ADSC גליון כפול.
- אחוז הוא מבנה ADSC גיליון עם מלקחיים אנדוסקופיותלהגן עליו במהלך ההובלה לאתר הפצע באמצעות כובע אנדוסקופית גדול ושקוף.
- החלת את כל פני השטח של מבנה ADSC הגיליון למיטת הכיב.
- בעדינות להחיל את מבנה ADSC גליון במשך 10 דקות כדי לקבל engraftment שלם ויציב. עבור יישום, להשתמש במלקחיים אנדוסקופית או כובע אנדוסקופית ולהחיל את כל פני השטח של ADSC לבנות על שכבת Submucosal הוושט.
- חזור על הליך זה ארבע פעמים עבור כל חיה על מנת לקבל ארבעה מבני תא גיליון כפולים מושתלים לבין חסיד.
הערה: המטרה היא לכסות approximatively מחצית משטחתה הפצועה.
5. הערכה לאחר ניתוח ומעקב
- עבור כל חיה, להבטיח שיכוך כאבים שלאחר ESD עם הזריקה תוך שרירית של 0.2 מ"ג / קילו של מורפיום שלוש פעמים ביום במשך היום הראשון, ועם טיפול סותר חומצה 28-יום של esomeprazole (40 מ"ג / יום). בצעו טיפול מונע אנטיביוטי עם amoxicillב (1 גר '/ יום) למשך 7 ימים. תן הרשאה נוזלת ביום 1 ומוצקים למחרת.
- מעקב עם חיות במשך 28 ימים. השג הערכות קליניות יומיות באמצעות עשרות בליעת Mellow פנקס 16 ומדידות וריאצית משקל.
- הערכת stricture מולטימודליות: בהרדמה כללית, בימים מתוכננים 3, 14, ו -28, לבצע הערכה משולבת של התרחשות היצרות.
- בצע הערכה אנדוסקופית באמצעות תיאור צלקת, מדידת צרות, וזיהוי קרום תומך נייר. מדוד את הצרות באמצעות גסטרוסקופ לחצות דרך הצרות (בקוטר של גסטרוסקופ הוא 8 מ"מ). שים את הצלקת, לשים לב להיבט הדלקתי (אריתמה ברירית, הבצקת רירית, ואת רירית דימום ספונטני) והעדר או נוכחות של קרום תומך נייר בתוך הצלקת.
- החל חללית ירוקה pCLE דרך תעלת מפעיל גסטרוסקופ ישירות לתוך מיטת הצלקת. חיפוש איש ספונטניומאורגן אות ירוקה תואמת engraftment לבנות ADSC גליון שכותרתו PKH67.
- בצע 2 מקרים מאונכים של בריט esophagography עם חישוק רדיולוגי (מלפנים מקרים של צד שמאל). שמור את השכיחות ההדוקה להערכת stricture (מידת היצרות (%) = [1- (האורך של הציר הקצר תחת היצרות / האורך של הציר הנורמלי תחת היצרות) x 100)]) 17, 18.
- קרבנות.
- ביום 28, בסוף תקופת המעקב, לבצע את הקרבנות. בעוד החיה עדיין תחת הרדמה כללית, להזריק 100 מ"ג / ק"ג של phenobarbital תוך ורידי. ודא מוות חי באמצעות בדיקה קלינית על ההיעדר דופק ושל נשימה ותנועה.
- לאחר חשיפת sternotomy ועוגבת, להסיר את הוושט מכל הקריב מן החי (עם קיבעון פורמלין 10% שנאגר, הטבעת פרפין, ו 4 חלקים מיקרומטר בעובי). כתם השקופיותעם Hematoxylin וזעפרן 15. Digitalize את השקופיות עבור ניתוח ממוחשב ולהשוות את קבוצות בעלי החיים 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות ADSCs ואת ההליך להשיג את גיליון ADSC מוצגת באיור 1. איור 2 מציג את הבנייה של השתל, מורכבת משני גיליונות ADSC השכבתיים על אחד את השני על קרום התמיכה במאמרם. ADSCs תויגו בעבר עם fluorophore PKH67 לאפשר ניטור שתל vivo עם pCLE. איור 3 מציג את השלבים השונים של דיסקציה submucosal המורחבת ושט אנדוסקופית, וכתוצאה מכך צלקת ושט 5 סנטימטרים חמים היקפית. איור 4 מראה את הליך ההשתלה אנדוסקופית. ההשתלה הייתה מוצלחת עבור כל בעלי החיים לאחר 10 דקות של יישום עדין. איור 5 מראה את הערכת pCLE החיובית ביום 3, המאשר את ההצלחה של הליך ההשתלה.
תקופת המעקב מותר analys stricture multimodal הוא. ההערכות השונות הראו את הנתונים הבאים ושולחן. לעומת שליטת חיות, קבוצת חית המושתלים הראתה צרות עיכול תכופות פחות ועלייה במשקל גדולה יותר על בעלי חי יום 28. אחת מהקבוצה המושתלת פתחה היצרות ושט חמורות בהשוואה לכל החיות בקבוצת הביקורת. בהשוואה לבעלי חיים מושתלים, חיות ביקורת פתחו רקמת פיברוטית משמעותית. טבלה 1 מציגה ממצאים קליניים endoscopical במהלך תקופת המעקב. איור 6 מציג את אנדוסקופית וממצאים רדיולוגיים בסוף תקופת המעקב בחי מושתלים ושאינם מושתלות. איור 7 מציג את הממצאים היסטולוגית השונים בין חיות מושתלות ושליטה. נתונים אלה מאשרים את האפקטיביות של השתלת ADSC גליון למניעת היצרות הוושט.
018fig1.jpg "/>
איור 1. Construct ADSC הגיליון. A ו- ADSCs מוקדם מעבר ב במנות תרבות סטנדרטיות עם בהגדלה שונה. גיליונות ADSC התקבלו על ידי culturing ADSCs PKH שכותרתו על מנות תרבות ממוסחרות טמפרטורה-תגובה. C. כאשר טמפרטורת הדגירה הופחתה ל 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר), כל התאים מנותקים באופן ספונטני מן משטחי הצלחת כמו סדיני ADSC שלמים, ללא צורך טיפול אנזימטי. .ד ADSC גיליון שנקטף לפני הבנייה שתל באמצעות קרום העברה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Construct הזוגי ADSC הגיליון. A, B, ו- C. יום לפני transplantation, ADSCs שכותרתו PKH נבצר בבית מספר פרקים המוקדם (P4 - P5), זורע על תרבית תאים 12 גם בטמפרטורה-תגובה, ותרבותי ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם מדיום חיוני מינימום אלפא לרבות עוברי 10% בסרום עגל 1% אנטיביוטיקה (פניצילין סטרפטומיצין). כל טוב היה מצופה קרום פולי-N-isopropylacrylamide (בתחתית של כל טוב) ו זרע עם 1.5 x 10 6 תאים. כאשר טמפרטורת הדגירה הופחתה ל 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר), כל התאים מנותקים באופן ספונטני כמו סדיני ADSC שלמים ללא צורך טיפול אנזימטי. ד סכימה התיאורטית של מבנה תא הגיליון הכפול מורכב משני גיליונות ADSC שכבתית על אחד את השני וכן להחיל קרום תומך נייר. א נוף מקרוסקופית של מבנה תא גיליון כפול הושלם. שונה מן ההפניה 15. אנא לחץ כאן t o לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Submucosal אנדוסקופי Dissection נוהל. סימני א אנדוסקופי נוצרו כדי להתוות את אזור הכריתה, הנעים בין 40 ל 45 סנטימטר לקשת השיניים מעורבות מחצית ההיקף. .ב הזרקת Submucosal של פתרון גליצרול המכיל צבע ארגמן אינדיגו. מטרת הזריקה הזאת הייתה להפריד את השכבה הרירית משכבת השרירים כדי לחשוף את שכבת submucosal. ג חתכים היקפיים בוצעו כלפי חוץ על סימני אנדוסקופית, חושפים את שכבת Submucosal המוזרקת. ד הנוף אנדוסקופית בסוף לנתיחת Submucosal מראה צלקת ושט 5 סנטימטר ארוכה חמה היקפית.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. זוגי ADSC גליון אנדוסקופי השתלת נוהל. א ארבעה ADSC בונה מוכן להשתיל. ב להגנת ADSC לבנות מתחת לכובע אנדוסקופית גדול לפני ההשתלה. ג אנדוסקופי לאור המעבר של הלוע החי, המציג את מבנה ADSC המוגן תחת הכובע אנדוסקופית. ד 10 דק 'של היישום היה מספיק כדי להשיג דבקות הגיליון. יישום בוצע באמצעות הכובע אנדוסקופית או מלקחיים אנדוסקופית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ממצאי איור 5. pCLE. pCLE ביום 3 מראה אותות ספונטניים ואינטנסיביים דומים לאלה שהושגו במבחנה, תואמים עם השתלת תאי גיליון מוצלחת. אין אות נמצאה בימים 14 ו 28. א האות במבחנה pCLE של ADSCs ההשעיה. .ב אות של ADSCs pCLE במבחנה מאורגן בסדין התא. ג in vivo בדיקת pCLE בקשת צלקת הוושט. D. תפקידו של המוסד vivo אות pCLE של ADSCs דמיינו ביום 3 לאחר ההשתלה. שונה מן ההפניה 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תוצאותשל ניתוח מורפולוגי ביום 28. בהשוואה לקבוצת הביקורת, אנדוסקופית וממצאים רדיולוגיים ביום 28 הראה היצרות קצר וקל ללא הרחבה במעלה או רירית מחדש epithelialized לחלוטין. שונה מן ההפניה 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. הערכה היסטולוגית של תחומי הצרות. הניתוח היסטולוגית בוצע לאחר הס-תיוג דיגיטציה שקופיות. אצל בעלי חיים מושתלים (א), תהליך ההחלמה היה משופר, עם epithelialization מחדש מוגבר וירידת פיתוח סיסטיק, לעומת בהמות שאינן מושתלים (B). התפתחות רקמת fibrotic Intense הייתהציין בשל הרס mucosae muscularis, פלישת שכבת muscularis הפנימית fibrotic, ופגמים ריריים גדולים. שונה מן ההפניה 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכות בטבלה 1. קלינית במהלך תקופת המעקב. הערכות קליניות בוצעו באמצעות הערכה קלינית יומית על פי תוצאת Mellow הפנקס עם וריאצית משקל. (*) Mellow פנקס להבקיע 16. שונה מן ההפניה 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במודל חזיר זה, השתלת ADSC הגיליון הייתה מוצלחת מבחינה טכנית, ואת הערכת pCLE ובחי מותרת לניטור engraftment התא. הערכות קליניות, endoscopical, רדיולוגי, היסטולוגית הוכיחו את היעילות של גיליון ADSC אנדוסקופית למניעת היצרות ושט לאחר ESD המורחבת.
השתלת אנדוסקופית של פתרון גליצרול ADSC המכיל גיליון צבע ארגמן אינדיגו היא גישה חדשנית ברפואה רגנרטיבית. Ohki et al. הראשון שתיאר את הליך ההשתלה אנדוסקופית. במחקריהם, בונה תא גיליון הורכבו גיליונות תא אפיתל ריריים אוראליים השכבתיים על שכבה דקה של difluoride polyvinylidene, משמשים קרום תמיכה 10, 11, 19. קרום התמיכה הובן עם מלקחי אנדוסקופית והניח בזהירות על מיטת הכיב. celדבקות l הגיליון הושגה לאחר 10 דקות של יישום עדין. הליך זה טרם שוחזר. במחקר זה, בונת ADSC גיליון כפולה הושתלה מסיבות מרובות. הבחירה של ADSC התבססה על מספר מחקרים הראו יכולות אנטי דלקתיות שלהם, במיוחד בתהליך ריפוי העור. ADSCs ידועים לווסת אינטראקציות keratinocyte פיברובלסטים 7. המנגנון של התפתחות פיברוזיס הוא מורכב רק הבין באופן חלקי. השפעת paracrine נראית לשחק תפקיד מרכזי בפעולת ADSC, כולל ייצור גורם אנטי דלקתי, כגון TGFβ וגורם פרו-angiogenic 20.
יש השתלת ADSC גליון אנדוסקופי מספר מגבלות. ראשית, סדיני תא יושמו במשך 10 דקות כדי צלקת הוושט להשיג הדבקה יציבה. חלק זה של ההליך היה מאתגר, קשה מבחינה טכנית, והיה צריכה להתבצע על ידי endoscopist מנוסה. אף על פי כן, כל בעלי החיים הושתלו בהצלחה, המאשר את ההיתכנות של הליך אנדוסקופי. לאחרונה, השימוש במכשיר 3D מודפס כדי לשפר את ההצלחה של השתלת תאי גליון דווח 21. שנית, טכניקה זו קשורה עם שיעור הישרדות ידוע. צלקת הוושט היא סביבה אגרסיבית לתאים. מנת תגובה בטמפרטורה מאפשרת לייצור גיליון התא לבנות דרך תאי מטריקס ועל היצירה של קשרי תא. לכן, כדי לשפר את שיעור ההישרדות ואת האינטראקציות ADSC, מבנה ADSC גליון כפול נבחר 22, 23. מחקר זה לא נועד להעריך גם את שיעור הישרדות תא או את ההשפעה במינון של השתלה על מניעת היצרות ושט, אשר הן שאלות חשובות. שלישית, כמו ואח Ohki. , שימוש קרום תמיכה היה צורך לבצע את הבנית גיליון ADSC. אָחוֹראה השתלה, קרום תומך נייר לא ניתן להסירו ללא הרס מבנה. תוך ושט זה חומר זר היה אחראי על הדלקת המוגברת. טכניקת אופטימיזציה תאפשר להסרת קרום תומך נייר.
ניטור השתלה עם pCLE היה גם מאתגר. טכניקת הדמיה אנדוסקופית חדשה זו מאפשרת ניתוח היסטולוגית vivo, כולל הדמיה של דפוס הבלוטות, מיקרו-כלי דם, ושינוי הסלולר. pCLE הוערכה מחלות העיכול רבים, כגון מחלות מעי דלקתיות, ושט בארט, וציסטות הלבלב רִירָנִי 24, 25. Fluorophore PKH67 תואם pCLE שימש תיוג תא. אות ניאון תואמת עם הנוכחות של גיליון ADSC נצפתה 4 חיות ביום 3. זה תוצאה חיובית שקפה את ההצלחה של השתלת ADSC הגיליון. עם זאת, becaיש השימוש PKH67 אות ירד לאורך זמן לאחר חלוקת תא, הערכת pCLE הייתה אפשרית רק כמה ימים לאחר השתלת 26. Ohki et al. ו קאנאי et al. תא פיקוח השתלת גיליון באמצעות immunostaining, והם אישרו את נוכחותם של תאים עד יום 8 לאחר ההשתלה. תאי בוגרים שמשו במחקר זה, אשר יש את היתרון של immunostaining הספציפי.
צרות ושט היא אחד תופעות לוואי החמורות ביותר הבאים ESD, וכך להגביל פיתוח טכניקה. טכניקות אופטימליות כדי למנוע היווצרות צרה עדיין חסרות. בפרקטיקה קלינית, חולים עם ESD ושט המורחב מוכתב טיפולים מונעים שונים, כגון סטרואידים, רחבות בלון אנדוסקופית, או ושט סטנט 27. יישום של ביולוגי מקומי נערך, עם תוצאות שונות 28, 29 30, 31. אלא מפלצת מיני וגדילת epithelialization מחדש נצפה צלקת הוושט. עבור תפקוד מערכת חיסון מקומי, מעט נתונים זמינים בספרות על הזרקת ADSC או יישום קרום שפיר 32, 33. מסדר stricture מתעכב ושיעור stricture ירד נצפו.
במודל חזיר זה, הליך השתלת אנדוסקופית תא הגיליון בוצע בהצלחה. ADSCs המושתלים מאורגן בסדינים תא כפול הפגינו את יכולתם למנוע היווצרות היצרות הוושט לאחר ESD המורחבת. מנגנוני המעורבים ריפוי ADSCתהליך הם הבינו היטב ויש מתחקיר במחקרים עתידיים. לפיכך, ולאור התוצאות המבטיחות אלה, ניסוי קליני צריך להתנהל על מנת להעריך את האפקטיביות של לבנות ADSC הגיליון הוארך לאחר ESD בחולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transparent endoscopic cap Q180 compatible | Olympus Optical Co | ||
| GIF-Q180 gastroscope | Olympus Optical Co | ||
| Videoscope System Exera II | Olympus Optical Co | ||
| Injection needle 18 G | Olympus Optical Co | ||
| Electrosurgery unit ERBE ICC 350 | ERBE Technology | ||
| Indigo carmin 1% | Life | ||
| Endoscopic hybrid knife | Life | ||
| Minisonde Z pCLE green probe | Mauna Kea Technology | You must learn how to use the probe. The manipulation could be difficult. | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12105C | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T146 | |
| Alpha minimum essential medium | Thermo Fisher | 22561-021 | |
| Phosphate-Buffered Salines | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| PKH67 dye kit | Sigma Aldrich | Mini67-KT | |
| 12-well temperature responsive cell culture dish | Upcell Thermo Scientific | 174900 | Feel the weel with 4 mL standard medium culture 30 min before seeding cells |
| Esomeprazole 40 mg | Biogaran | ||
| Moprhine sulfate 50 mg/mL | Lavoisier | ||
| Amoxicilline 1 g | Biogaran | ||
| Ketamine 250 mg/5 mL | Panpharma | ||
| Propofol 10 mg/mL | Fresenius | ||
| Hydrophobic paper | Carrefour |
References
- Ono, S., Fujishiro, M., et al. Long-term outcomes of endoscopic submucosal dissection for superficial esophageal squamous cell neoplasms. Gastrointestinal endoscopy. 70 (5), 860-866 (2009).
- Pech, O., May, A., et al. Long-term efficacy and safety of endoscopic resection for patients with mucosal adenocarcinoma of the esophagus. Gastroenterology. 146 (3), 652-660 (2014).
- Yahagi, N. Is esophageal endoscopic submucosal dissection an extreme treatment modality, or can it be a standard treatment modality. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (6), 1073-1075 (2008).
- Rösch, T., Sarbia, M., et al. Attempted endoscopic en bloc resection of mucosal and submucosal tumors using insulated-tip knives: a pilot series. Endoscopy. 36 (9), 788-801 (2004).
- Chennat, J., Ross, A. S., et al. Advanced pathology under squamous epithelium on initial EMR specimens in patients with Barrett's esophagus and high-grade dysplasia or intramucosal carcinoma: implications for surveillance and endotherapy management. Gastrointestinal endoscopy. 70 (3), 417-421 (2009).
- Oyama, T., Tomori, A., et al. Endoscopic submucosal dissection of early esophageal cancer. Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association. 3 (7), Suppl 1 67-70 (2005).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Yamaguchi, N., Isomoto, H., et al. Effect of oral prednisolone on esophageal stricture after complete circular endoscopic submucosal dissection for superficial esophageal squamous cell carcinoma: a case report. Digestion. 83 (4), 291-295 (2011).
- Hanaoka, N., Ishihara, R., et al. Intralesional steroid injection to prevent stricture after endoscopic submucosal dissection for esophageal cancer: a controlled prospective study. Endoscopy. 44 (11), 1007-1011 (2012).
- Ohki, T., Yamato, M., et al. Treatment of oesophageal ulcerations using endoscopic transplantation of tissue-engineered autologous oral mucosal epithelial cell sheets in a canine model. Gut. 55 (12), 1704-1710 (2006).
- Ohki, T., Yamato, M., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- García-Gómez, I., Elvira, G., et al. Mesenchymal stem cells: biological properties and clinical applications. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1453-1468 (2010).
- Jorgensen, C., Noël, D. Mesenchymal stem cells in osteoarticular diseases. Regenerative Medicine. 6 (6), Suppl 44-51 (2011).
- Antonic, A., Sena, E. S., et al. Stem cell transplantation in traumatic spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis of animal studies. PLoS biology. 11 (12), 1001738 (2013).
- Perrod, G., Rahmi, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLOS ONE. 11 (3), 0148249 (2016).
- Mellow, M. H., Pinkas, H. Endoscopic laser therapy for malignancies affecting the esophagus and gastroesophageal junction. Analysis of technical and functional efficacy. Archives of Internal Medicine. 145 (8), 1443-1446 (1985).
- N.A.S.C.E.T. Beneficial effect of carotid endarterectomy in symptomatic patients with high-grade carotid stenosis. The New England Journal of Medicine. 325 (7), 445-453 (1991).
- Randomised trial of endarterectomy for recently symptomatic carotid stenosis: final results of the MRC European Carotid Surgery Trial (ECST). Lancet. 351 (9113), 1379-1387 (1998).
- Kanai, N., Yamato, M., Ohki, T., Yamamoto, M., Okano, T. Fabricated autologous epidermal cell sheets for the prevention of esophageal stricture after circumferential ESD in a porcine model. Gastrointestinal Endoscopy. 76 (4), 873-881 (2012).
- Aggarwal, S., Pittenger, M. F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 105 (4), 1815-1822 (2005).
- Maeda, M., Kanai, N., et al. Endoscopic cell sheet transplantation device developed by using a 3-dimensional printer and its feasibility evaluation in a porcine model. Gastrointestinal Endoscopy. , (2015).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., et al. Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro. Nature Protocols. 7 (5), 850-858 (2012).
- Nishida, K., Yamato, M., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. The New England Journal of Medicine. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Napoléon, B., Lemaistre, A. -I., et al. A novel approach to the diagnosis of pancreatic serous cystadenoma: needle-based confocal laser endomicroscopy. Endoscopy. 47 (1), 26-32 (2015).
- Gabbani, T., Manetti, N., Bonanomi, A. G., Annese, A. L., Annese, V. New endoscopic imaging techniques in surveillance of inflammatory bowel disease. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 7 (3), 230-236 (2015).
- Nagyova, M., Slovinska, L., et al. A comparative study of PKH67, DiI, and BrdU labeling techniques for tracing rat mesenchymal stem cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 50 (7), 656-663 (2014).
- Jain, D., Singhal, S. Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection. Clinical Endoscopy. 49 (3), 241-256 (2016).
- Lua, G. W., Tang, J., Liu, F., Li, Z. S. Prevention of Esophageal Strictures After Endoscopic Submucosal Dissection: A Promising Therapy Using Carboxymethyl Cellulose Sheets. Digestive Diseases and Sciences. 61 (6), 1763-1769 (2016).
- Sakaguchi, Y., Tsuji, Y., et al. Triamcinolone Injection and Shielding with Polyglycolic Acid Sheets and Fibrin Glue for Postoperative Stricture Prevention after Esophageal Endoscopic Resection: A Pilot Study. The American Journal of Gastroenterology. 111 (4), 581-583 (2016).
- Sakurai, T., Miyazaki, S., Miyata, G., Satomi, S., Hori, Y. Autologous buccal keratinocyte implantation for the prevention of stenosis after EMR of the esophagus. Gastrointestinal endoscopy. 66 (1), 167-173 (2007).
- Nieponice, A., McGrath, K., et al. An extracellular matrix scaffold for esophageal stricture prevention after circumferential EMR. Gastrointestinal Endoscopy. 69 (2), 289-296 (2009).
- Honda, M., Hori, Y., et al. Use of adipose tissue-derived stromal cells for prevention of esophageal stricture after circumferential EMR in a canine model. Gastrointestinal endoscopy. 73 (4), 777-784 (2011).
- Barret, M., Pratico, C. A., et al. Amniotic membrane grafts for the prevention of esophageal stricture after circumferential endoscopic submucosal dissection. PloS One. 9 (7), 100236 (2014).
