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Immunology and Infection

Virometry प्रवाह virions की प्रतिजनी स्पेक्ट्रा और बाह्य Vesicles का विश्लेषण करने के लिए

Published: January 25, 2017 doi: 10.3791/55020
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1
1Section on Intercellular Interactions, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

Introduction

बहुकोशिकीय जीवों में कोशिकाओं को कई अलग-अलग विशेषताएं है कि एक विशेष सेल के लिए या तो अद्वितीय हो सकता है या कम से कम कोशिकाओं का अनूठा समूहों से संबंधित है। के रूप में उनके विविध आकृति विज्ञान इसका सबूत भी सुसंस्कृत क्लोन कोशिकाओं व्यक्तिगत विशेषताओं दिखा। इसके अलावा, एक सेल के व्यक्तित्व उत्पादों यह स्रावित करता जा सकता है। वायरल संक्रमण के मामले में, वायरल कणों की कोशिकाओं है कि उन्हें उत्पादन से प्रोटीन ले जा सकता है। उदाहरण के लिए, एचआईवी के लिए कई मेजबान कोशिका प्रोटीन वायरल लिफाफे में एम्बेडेड रहे हैं और वायरस है कि विभिन्न कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न कर रहे इन विशेषता प्रोटीन 1, 2 या "सेल हस्ताक्षर" ले सकते हैं।

यहाँ तक कि संक्रमण के बिना, कोशिकाओं के आसपास मीडिया छोटे बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) में जारी है। इन पुटिकाओं और कई मामलों में उनकी संरचना का जीवजनन वायरस के समान है, विशेष रूप से रेट्रोवायरस। हाल के वर्षों में यह स्पष्ट हो गया हैईवीएस, जो शुरू में 'प्लेटलेट धूल "3, माना जाता था सेल सेल संचार का एक महत्वपूर्ण शारीरिक प्रणाली का गठन किया। कहनेवाला संचार, अर्थात् सेल सेल संपर्क और बातचीत जारी किया घुलनशील अणुओं के दो अन्य प्रणालियों के साथ एक साथ, ईवीएस सामान्य शरीर विज्ञान का समन्वय और विभिन्न विकृतियों 4, 5 वायरल संक्रमण के 6, 7 सहित बदल रहे हैं।

हालांकि दोनों का विमोचन किया वायरल कणों और बाह्य पुटिकाओं अत्यधिक विविध रहे हैं, वे थोक विश्लेषण, जिसमें उनकी व्यक्तिगत विशेषताओं खो रहे हैं मुख्य रूप से विशेषता है। जो उनके अलग सतह एंटीजन के आधार पर कोशिकाओं phenotypes प्रवाह cytometry के सदृश एक विधि, व्यक्ति वायरल और वायरल कणों की तरह को चिह्नित करने की जरूरत है। दुर्भाग्य से, ईवीएस या छोटे virions मानक प्रवाह Cyto का उपयोग विश्लेषण नहीं किया जा सकताmetry तरीकों क्योंकि वे भी प्रकाश बिखरने संकेत सबसे cytometers ट्रिगर के लिए भरोसा करते हैं, जिस पर उत्पन्न करने के लिए छोटे हैं। इस सीमा को नाकाम करने के लिए, प्रतिदीप्ति ट्रिगर लागू किया जा सकता है। हालांकि, अगर ईवीएस या virions फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं यह उन्हें मुक्त एंटीबॉडी और उनके समान प्रतिदीप्ति और तुलनीय आकार की वजह से उनके समुच्चय से भेद करना मुश्किल है।

हाल ही में, हम एक नैनो आधारित उच्च throughput तरीका है कि नियमित रूप से प्रवाह cytometers 8, 9 का उपयोग अलग-अलग छोटे कणों पर एंटीजन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है विकसित की है। हम ब्याज की immunocapture कणों को MNPS को रोजगार के रूप में विभिन्न अनुप्रयोगों के 10, 11, 12, 13 के लिए अन्य समूहों द्वारा वर्णित किया गया है; हालांकि, हमारे उपन्यास तकनीक अलग-अलग तकनीक और नवीनता के कब्जा करने के लिए अनुमति देता हैएफआईसी लक्ष्यों प्रकाश बिखरने के बजाय ट्रिगर प्रतिदीप्ति का उपयोग, नि: शुल्क चल एंटीबॉडी से हस्तक्षेप के बिना प्रवाह cytometry द्वारा इन पर कब्जा कर लिया कणों की phenotyping द्वारा पीछा किया। इस विधि को विस्तृत आवेदन किया है और किसी भी viral- और गैर-वायरल छोटे विवो में कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न कण की प्रतिजनी रचना को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इन विट्रो में सतह एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की उपलब्धता प्रदान की है। हम पहले से ही कई जैविक समस्याओं का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का आवेदन किया है।

विशेष रूप से, हम व्यक्ति एचआईवी -1 कणों 9 के आधार पर मेजबान सेल मार्कर के वितरण का मूल्यांकन, हम व्यक्तिगत डेंगू वायरस (DENV) उनकी सतह प्रोटीन 14 के विश्लेषण के आधार पर की परिपक्वता का अध्ययन किया और जांच की स्वस्थ स्वयंसेवकों और रोगियों के खून में जारी ईवीएस एक्यूट कोरोनरी सिंड्रोम (एसीएस) के साथ। एक समान सिद्धांत पर आधारित है,नई तकनीक के आवेदन विशिष्ट प्रोटोकॉल है कि नीचे वर्णित हैं के विकास की आवश्यकता है।

Protocol

1. चुंबकीय नैनोकणों के युग्मन (MNPS)

  1. वाणिज्यिक युग्मन प्रक्रिया और साथ एंटीबॉडी (पेट) दंपति MNPS करने के लिए अभिकर्मकों (आम तौर पर 1 मिलीग्राम) का प्रयोग करें। कार्बोक्जिलिक एसिड के रूप में प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ आयरन ऑक्साइड नैनोकणों उपयोग किया जाता है।
    1. एंटीबॉडी एक मात्रा में अधिक से अधिक 0.5 मिलीलीटर रहे हैं, एक 100K concentrator का उपयोग ध्यान केंद्रित। 3-5 मिनट के लिए 2,000 XG पर स्पिन।
  2. प्रक्रिया के अंत में, शमन बफर के 10 μl जोड़ने के बाद, एक 12 मिमी x 75 मिमी ट्यूब को MNPS हस्तांतरण और 3 मिलीलीटर धोने / भंडारण बफर जोड़ें। एक चुंबकीय विभाजक के केंद्र छेद में ट्यूब प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  3. सत्यापित करें MNPS ध्यान से सभी ट्यूब की ओर करने के लिए एकत्र किया है, और फिर सभी तरल बाहर pipet है। ताजा धोने / भंडारण बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और चुंबक में वापस जगह है।
  4. कई घंटे के बाद, जांच MNPS ट्यूब की ओर से एकत्र कर रहे हैं और फिर तरल बंद pipet। को धोने / भंडारण बफर के 2 मिलीलीटर का प्रयोग करेंMNPS resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. सत्यापित करें कि पेट के लिए उन्हें एक प्रासंगिक फ्लोरोसेंट फैब एंटीबॉडी टुकड़ा के साथ लेबलिंग द्वारा MNPS करने के लिए मिलकर कर रहे हैं (जैसे बकरी विरोधी माउस यदि धारा 2 में वर्णित के रूप में पकड़ने के लिए एक माउस मोनोक्लोनल Ab का उपयोग) और एक प्रवाह cytometer पर चलाते हैं।

2. लेबल एंटीबॉडी MNPS के लिए युग्मित

  1. 60 μl (3.9 x 10 12 कण) MNPS की (शर्त के अनुसार) और (एक 200 माइक्रोग्राम / एमएल वाणिज्यिक समाधान की) 5 μl लेबल फैब टुकड़े, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कब्जा Ab के निर्धारण के लिए विशिष्ट जुडा है।
  2. निरंतर मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं।
  3. 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर एक microcentrifuge में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और स्पिन के 300 μl के साथ एक 100K concentrator पूर्व गीला।
  4. 100K स्तंभ पर लेबल परिसरों शुद्ध। 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर एक microcentrifuge में 2.2 कदम से मिश्रण स्पिन, 200 μl पीबीएस के साथ धोने, और में ठीक होप्रारंभिक मात्रा।

कब्जा करने के लिए 3. लेबल अब-एमएनपी परिसर का उपयोग ब्याज के कणों (वायरस या ईवीएस)

  1. एचआईवी (60 μl) या ईवी तैयारी (100 μl) के साथ पूर्व लेबल MNPS 60 μl (3.9 x 10 12 कण) सेते हैं।
    1. विभिन्न तरीकों का उपयोग कर ईवी तैयारियों तैयार करें। यहाँ, सूक्रोज ढ़ाल पर ईवीएस को शुद्ध exosome वर्षा अभिकर्मकों का उपयोग प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा से उन्हें लेने या प्लाज्मा से सीधे अलग-थलग 8।
      नोट: इष्टतम अनुपात के एक प्रयोग के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है और तैयारी में वायरस / ईवी की एकाग्रता पर निर्भर हैं। एमएनपी अटल बिहारी अंश होना चाहिए ~ अधिक में 10 6 वायरस / ईवी अंश की एकाग्रता की तुलना में।
  2. वायरस के लिए सौम्य मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट, या ईवीएस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
  3. 2.5% माउस आईजीजी / मानव आईजीजी एफसी बंधन, धीरे भंवर ब्लॉक करने के लिए, आरटी पर 3-5 मिनट के लिए सेते जोड़ें।
  4. प्रत्येक पता लगाने के पेट के निर्माता की सिफारिश या titered सांद्रता जोड़ें और आरटी पर अतिरिक्त 20 मिनट सेते हैं।

4. अनबाउंड एंटीबॉडी से एमएनपी कब्जा कर लिया virions (या ईवीएस) चुंबकीय स्तंभों का उपयोग के पृथक्करण

  1. एक विभाजक चुंबक में रखकर इस्तेमाल के लिए चुंबकीय जुदाई स्तंभ तैयार करें।
  2. धो बफर (2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.5% गोजातीय सीरम albumin (पीबीएस में बीएसए)) के 500 μl के साथ स्तंभ पूर्व गीला। धो बफर कॉलम के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति।
  3. स्तंभ के लिए एमएनपी वायरस / एमएनपी-ईवी परिसरों जोड़ें और सभी तरल के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं। पूरी मात्रा के माध्यम से पारित करने की अनुमति स्तंभ को धोने बफर के 500 μl जोड़ें।
  4. धो बफर 2 अधिक समय के साथ धोने दोहराएँ।
  5. 12 मिमी बरकरार रखा एमएनपी वायरस / एमएनपी-ईवी परिसरों के संग्रह के लिए x 75 मिमी ट्यूब में चुंबक और जगह से स्तंभ निकालें। कॉलम 3 मिनट के लिए चुंबक बंद ट्यूब में खड़े हो जाओ। पीबीएस के 200 μl जोड़ें और जानेमोती गंभीरता से नीचे प्रवाह, पीबीएस के एक और 200 μl जोड़ने के लिए, और क्षालन के बाद 200 μl 4% paraformaldehyde के साथ तय कर लो।
    नोट: Paraformaldehyde एक संदिग्ध कैसरजन है और एक हवादार हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए और दस्ताने पहना जाना चाहिए।
  6. एकल virions यों / ईवीएस उच्च Throughput नमूना (एचटीएस) या अधिग्रहण करने के लिए बस से पहले गिनती मोती cytometry अच्छी तरह से मिश्रित प्रवाह जोड़ने पर बड़ा सेटिंग्स का उपयोग करें।

5. MNPS कब्जा कर लिया वायरस का विश्लेषण / एक प्रवाह cytometer साथ ईवीएस

  1. 30 मिनट के लिए प्रवाह कोशिकामापी गर्म।
  2. भागो गुणवत्ता नियंत्रण मोती।
  3. या तो MNPS या लेबल वायरस / ईवीएस की प्रतिदीप्ति पर सीमा निर्धारित करें। पृष्ठभूमि 'शोर' कम करने के लिए 0.22 माइक्रोन सीमा के लिए पीबीएस फ़िल्टर का प्रयोग करें। जहां फ़िल्टर पीबीएस कोई देता स्तर पर पीएमटी वोल्टेज का समायोजन करके सीमा निर्धारित करें, या बहुत कम, घटनाओं।
  4. कम पर चलाने के नमूने हैं। (पीछे श्रृंखला में रखा म्यान तरल पदार्थ के लिए एक अतिरिक्त 0.04 माइक्रोन इनलाइन फिल्टर का प्रयोग करेंमानक 0.2 माइक्रोन फिल्टर म्यान आगे झूठी घटनाओं को खत्म करने के लिए)।

6. कब्जा दक्षता का मूल्यांकन

  1. 3.1, 3.2 में वर्णित के रूप में fluorescently लेबल ईवीएस या एमएनपी-एबीएस के साथ एचआईवी पर कब्जा। (ईवीएस या तो एक झिल्ली डाई के साथ या उनके माल के माध्यम से लेबल किया जा सकता 15; एचआईवी जीन इनकोडिंग डाई 16 के माध्यम से या तो लेबल किया जा सकता है, या एक झिल्ली डाई 12, 17) के साथ।
  2. (4.1-4.2) में वर्णित के रूप में चुंबकीय जुदाई स्तंभ तैयार करें।
  3. स्तंभ के लिए एमएनपी वायरस / एमएनपी-ईवी परिसरों जोड़ें और सभी तरल के माध्यम से प्रवाह (अंश के माध्यम से प्रवाह) की अनुमति है। ट्यूब में अंश के माध्यम से प्रवाह लीजिए।
  4. (4.4-4.5) में वर्णित के रूप में स्तंभ पर बरकरार रखा अंश के साथ आगे बढ़ें।
  5. बाद में जुदाई (4.1-4.5) के साथ 6.3 से अंश के माध्यम से प्रवाह पर दोहराएँ कब्जा प्रक्रिया।
  6. पहले सीए से बनाए रखा अंशों का विश्लेषण करेंpture और उस कोशिकामापी उन पर चलाने के द्वारा दूसरे पर कब्जा ईवीएस या एचआईवी के फ्लोरोसेंट लेबल पर ट्रिगर पर सेट किया जाता है। दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, दोनों भागों में घटनाओं की संख्या की तुलना करें।

7. विशिष्ट कार्यों के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन

नोट: प्रोटोकॉल के रूप में ऊपर वर्णित एचआईवी और ईवीएस के विश्लेषण के लिए आवेदन किया जा सकता है, DENV के विश्लेषण के लिए निम्नलिखित संशोधनों पेश किया जाना चाहिए:

  1. आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में 1 माइक्रोन DiI साथ virions सेते हैं। ऊष्मायन के बाद कोई ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 240,000 XG पर घनत्व ढाल माध्यम में centrifugation (10%, 20%, 25% और 35%) द्वारा दाग वायरस शुद्ध। 20% और 25% घनत्व ढाल मध्यम परतों के बीच 14 अंश लीजिए।
  2. सेते DiI आरटी पर 20 मिनट के लिए 2.5% माउस आईजीजी की उपस्थिति में पता लगाने Ab के निर्माता की सिफारिश या titered सांद्रता के साथ DENV लेबल 1 10 x 7 (60 μl)।
  3. Incubसौम्य मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए पूर्व लेबल 60 μl (3.9 x 10 12 कण) एमएनपी कब्जा Ab परिसरों के साथ मिश्रण खा लिया।
  4. चुंबकीय कॉलम ऊपर वर्णित है और प्रवाह पर विश्लेषण के रूप में अपार पेट से अलग परिणामी परिसरों।

Representative Results

एचआईवी -1 virions द्वारा सेलुलर एंटीजन के चुनिंदा कब्जा

"प्रवाह virometry" के साथ यह अब व्यक्ति वायरल कणों पर सेलुलर एंटीजन कल्पना करने के लिए संभव है। एक उदाहरण के रूप में, हम दो सेलुलर एचआईवी -1, LFA-1 और एचएलए डीआर द्वारा किए एंटीजन पर जोर दिया। इससे पहले इन दोनों एंटीजन थोक 1 में विश्लेषण एचआईवी -1 तैयारी में पहचान की गई। हम MNPS पर्यावरण एचआईवी प्रोटीन, VRC01 के खिलाफ एंटीबॉडी से एक के साथ मिलकर, और इन MNPS एचआईवी -1 virions (एचआईवी -1 LAI.04 या एचआईवी -1 SF162 परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) में उत्पादित) के साथ कब्जा कर लिया है तैयार। इसके अलावा, हम 2G12, एक और विरोधी पर्यावरण एंटीबॉडी के साथ इन virions दाग। प्रवाह virometry LFA-1 और एचएलए डीआर की उपस्थिति के बारे में एचआईवी -1 virions की एक उच्च विविधता दिखाया। पर औसत 16.7 ± 2.0% (एन = 6) और 8.6 ± 0.3% (एन = 3) एचआईवी -1 LAI.04 virions किया LFA-1 और एचएलए डॉ,क्रमशः। केवल 4.8 ± 0.6% (एन = 3) सभी virions के दोनों एंटीजन के लिए सकारात्मक थे। अन्य एचआईवी -1 तनाव पर, एचआईवी -1 SF162, इन एंटीजन 20.0 ± 4.4% पर उपस्थित थे (एन = 6) और 10.8 ± 1.3% (एन = 6) virions, क्रमशः की, जबकि दोनों एंटीजन से 6.5 ± किए गए 0.4% (चित्रा 1)।

सेलुलर प्रोटीन का वितरण कोशिकाओं है कि वायरस दोहराया पर निर्भर था। एचआईवी संक्रमित का उत्पादन virions antigenically संक्रमित PBMCs द्वारा उत्पादित उन लोगों से अलग Jurkat कोशिकाओं। एचआईवी -1 लाइ 0.4 Jurkat कोशिकाओं द्वारा उत्पादित की virions (= एन 3) 1.6 ± 1.4% ले गए और 1.6 ± 0.7% (एन = 4) LFA-1 और एचएलए डॉ क्रमशः। एचआईवी -1 SF162 Jurkat कोशिकाओं में उत्पादित virions लिए, इन मानकों थे 7.2 ± 2.5% (एन = 3) और 5.6 ± 2.7% (एन = 4)। इस प्रकार, प्रतिजनी मेकअप (कम से कम एचएलए DR और LFA-1 के लिए) एचआईवी -1 LAI.04 दो अलग अलग सेल द्वारा उत्पादित के लिए अलग थाप्रकार (पी <0.02)।

के रूप में डेंगू वायरस के मूल्यांकन के लिए आवेदन किया virometry प्रवाह

DENV परिपक्वता virions पर पी आर एम प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है। हम DENV बीएचके -1 में उत्पादित किस अंश और lovo कोशिकाओं में परिपक्व वायरस का गठन मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह virometry लागू होता है। Virions एक lipídic डाई DiI के साथ दाग रहे थे। व्यक्ति पर कब्जा कर लिया virions का विश्लेषण (= 8 n) DENVs के 48.2 ± 5.3% पर पी आर एम का पता चला। इसके विपरीत, 84.5 ± 3.4% (एन = 4) DENV का किया पी आर एम lovo कोशिकाओं में उत्पादन किया। Virions के बाकी क्रमश: 51.8 ± 5.3% (एन = 8) और 15.5 ± 3.4% (एन = 4) थे पी आर एम नकारात्मक (चित्रा 2)। इस प्रकार, प्रवाह virometry अपरिपक्व (या आंशिक रूप से परिपक्व) DENV virions से पूरी तरह से परिपक्व व्यक्ति DENV भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

कोशिकी पुटिकाओं स्वस्थ के खून में जारीस्वयंसेवकों और एक्यूट कोरोनरी सिंड्रोम के साथ रोगियों (एसीएस)

आदेश एसीएस और स्वस्थ नियंत्रण के साथ रोगियों में अलग ईवी सबसेट की जांच करने के लिए हम से CD31, CD41a, या CD63 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट MNPS युग्मित प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) से ईवीएस पर कब्जा कर लिया। ईवीएस CD31-MNPS द्वारा कब्जा कर लिया CD41a और CD63 के लिए दाग थे, CD41a-MNPS द्वारा कब्जा कर लिया ईवीएस CD31 और CD63 के लिए दाग रहे थे, और ईवीएस CD63-MNPS द्वारा कब्जा कर लिया CD31 और CD41a (चित्रा 3) के लिए दाग रहे थे।

ईवीएस की राशि एक या एसीएस रोगियों में पता लगाने के एंटीबॉडी में से दो के लिए CD31-MNPS द्वारा कब्जा कर लिया और सकारात्मक 3359 [2,328 थी; 5,472] ईवीएस / 1,272 [714 के साथ तुलना में μl; 2157] ईवीएस / स्वस्थ स्वयंसेवकों (पी = 0.001) में μl। ईवीएस की कुल राशि स्वस्थ स्वयंसेवकों के साथ तुलना में एसीएस रोगियों में CD63 द्वारा कब्जा कर लिया 3541 [1,318 थी; 5173] ईवीएस / μl बनाम 806 [488; 2,112] ईवीएस / μl (पी = 0.007)। इसमें 4,752 [3238 थे; 7173] ईवीएस /, एसीएस के साथ रोगियों CD41a-MNPS द्वारा कब्जा के प्लाज्मा में μl, जबकि स्वस्थ स्वयंसेवकों के प्लाज्मा में इस संख्या काफी कम थी 2,623 [1,927; 4188] ईवीएस / μl (पी = 0.015)। सामान्य में, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि, जबकि ईवी मात्रा में ज्यादातर एसीएस रोगियों में बढ़ रहे थे, वृद्धि की भयावहता ईवीएस के विभिन्न उप आबादी में अलग था।

आकृति 1
चित्रा 1: एचआईवी -1 विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में नकल virions में सेलुलर एंटीजन के चुनिंदा समावेश। एचआईवी (एचआईवी -1 LAI.04 या एचआईवी -1 SF162) PBMCs या Jurkat कोशिकाओं द्वारा जारी virions VRC01-MNPS के साथ कब्जा कर लिया और दूसरे विरोधी gp120 एंटीबॉडी 2G12 के साथ और एचएलए DR और LFA-1 के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। दाग की तैयारी एचएलए डीआर (सफेद सलाखों) और LFA-1 (काला बीए के लिए विश्लेषण प्रवाह के अधीन थेरुपये)। तीन से छह प्रयोगों 9 के ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: DENV virions की परिपक्वता राज्य। DENV में उत्पादित BHK-21 कोशिकाओं (ए, बी) या lovo कोशिकाओं (सी, डी) में lipídic डाई DiI साथ लेबल रहे थे और, घनत्व ढाल माध्यम में ultracentrifugation के बाद, 2H2 एंटीबॉडी (ए, सी) या के साथ पी आर एम प्रोटीन के लिए दाग निर्धारण नियंत्रण IgG2a (बी, डी) के साथ। लेबल virions तो 3H5-1-MNPS के साथ कब्जा कर लिया और प्रवाह विश्लेषण 14 के अधीन थे। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

चित्र तीन
चित्रा 3: एसीएस रोगियों और स्वस्थ नियंत्रण से ईवीएस का विश्लेषण। प्लाज्मा ईवीएस CD31-MNPS, CD63-MNPS या CD41a-MNPS के साथ कब्जा कर लिया और और CD41a और CD63, CD31 और CD41a के खिलाफ के खिलाफ CD31 और CD63, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। पर कब्जा कर लिया ईवीएस, पता लगाने के पेट के कम से कम एक साथ दाग, कल्पना और प्रवाह विश्लेषण में प्रगणित थे। डेटा मंझला और अन्तःचतुर्थक रेंज (IQR) के साथ डॉट साजिश के रूप में प्रस्तुत किया। ग्रीन प्रतीक: स्वस्थ स्वयंसेवकों (नियंत्रण), भूरे रंग के प्रतीक: एसीएस रोगियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: evaluatiप्रवाह की घटनाओं है कि अलग-अलग virions प्रतिनिधित्व के अंश का पर। (ए) एचआईवी -1। Virions के निलंबन को दो भागों में विभाजित है और दाग या तो था (बाएं पैनल) या डियो (मध्यम पैनल) के साथ किया गया था। मिश्रण के बाद, निलंबन, कि दो विभिन्न दाग virions निहित, VRC01-MNPS के साथ कब्जा कर लिया और virometry (सही पैनल) प्रवाह के अधीन था। समुच्चय (दोहरी रंग घटनाओं) की कुल घटनाओं में से कम से कम 10% का गठन किया। (बी - डी) DENV। 1 से 2: DiI से सना हुआ virions की सस्पेंशन क्रमानुसार 1 से दो गुना पतला था और 256 कोशिकामापी एक प्रवाह (बी) पर एचटीएस के साथ हासिल कर ली। DiI-DENVs 2H2 एंटीबॉडी (सी) या DiI-DENVs साथ लेबल रहे थे 3H5-1-MNPS (डी) के साथ कब्जा कर लिया गया। 1 से 2:: तैयारी सी और डी तो क्रमानुसार 1 से दो गुना पतला थे 256 और एचटीएस 14 के साथ हासिल कर ली। Virions वहाँ सभी मामलों में के बाद से कुल करने के लिए ऐसा नहीं लगता हैकमजोर पड़ने कारक और घटनाओं की संख्या के बीच एक रेखीय संबंध है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रवाह से एक कण का पता लगाना। 1 से 2: DiI से सना हुआ DENV निलंबन क्रमानुसार 1 से दो गुना पतला था और 2,048 कोशिकामापी एक प्रवाह पर एक एचटीएस उपयोग कर हासिल किया। (ए) कमजोर पड़ने कारक के एक समारोह के रूप में पहचान वायरस की संख्या। (बी) के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) DiI के DENV 14 लेबल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6: virions और बाह्य पुटिकाओं विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए युग्मित MNPS साथ कब्जा कर लिया के अंश का मूल्यांकन। लेबल एचआईवी -1 virions या ईवीएस MNPS विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए युग्मित और virometry प्रवाह के अधीन के साथ कब्जा कर लिया गया। चुंबकीय स्तंभों पर जुदाई के बाद, प्रवाह के माध्यम से (बनाए रखा नहीं) अंशों virions या ब्याज की ईवीएस की उपस्थिति है कि पहले समय में चूक गए थे के लिए विश्लेषण किया गया। (ए) लेबल एचआईवी -1 बाल virions 2G12-MNPS (बाएं पैनल) के साथ कब्जा कर लिया गया। प्रवाह के माध्यम से अंश पुनः कब्जा और virometry (सही पैनल) प्रवाह के अधीन था। पहले चक्र में ब्याज की virions के 95% के बारे में कब्जा कर लिया गया। (बी) लेबल ईवीएस विरोधी CD81 MNPS के साथ कब्जा कर लिया और चुंबकीय कॉलम (बाएं पैनल) पर अलग थे। प्रवाह के माध्यम से अंश को फिर से कब्जा कर लिया है और विश्लेषण (सही पैनल) किया गया था। पहली बार मेंचक्र ब्याज की पुटिकाओं के 99% के बारे में 8 कब्जा कर लिया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पारंपरिक प्रवाह cytometers एक व्यक्तिगत स्तर 18 पर उनकी भौतिक और रासायनिक विशेषताओं के आधार पर कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रमुख साधन बने हुए हैं। प्रवाह के बुनियादी सिद्धांतों cytometry इसके विकास के बाद से बदल नहीं किया गया है: एक सेल है कि लेजर बीम के माध्यम से गुजरता है और प्रकाश scatters एक घटना है कि सेल बाध्य फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग से चलाता का गठन किया। 300 एनएम से नीचे छोटे कणों एक कोशिकामापी की ओर तितर बितर से नहीं पाया जा सकता है के रूप में वे बड़े कोण है, जिस पर सबसे अधिक प्रवाह cytometer इकट्ठा प्रकाश 18 के तहत नहीं है और अधिक प्रकाश तितर बितर। तकनीक यहाँ वर्णित है, पहचान और प्रतिदीप्ति ट्रिगर के साथ पारंपरिक प्रवाह cytometers द्वारा कई अलग-अलग वायरस या ईवीएस पर कई एंटीजन के विश्लेषण की अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम MNPS के लिए एंटीबॉडी के युग्मन कर रहे हैं। हमारे प्रयोगों कामकाज कर रहे थेमेड एक प्रतिक्रियाशील समूह के रूप में कार्बोक्जिलिक एसिड के साथ 15 एनएम लोहे के आक्साइड नैनोकणों का उपयोग कर के रूप में पहले से वर्णित 9। निर्माता के अनुसार, प्रत्येक 15 एनएम एमएनपी 20 एंटीबॉडी की एक अधिकतम बाध्य कर सकते हैं; हम लगभग प्रति 15 एनएम एमएनपी 10 एंटीबॉडी बाँध। यह अनुमान से पहले और युग्मन के बाद एंटीबॉडी की राशि और मोती / एमएल के रूप में nanoparticle लक्षण और नौकरशाही का आकार घटाने इंस्ट्रूमेंटेशन द्वारा मापा की संख्या पर आधारित है। सिद्धांत रूप में, युग्मन कणों के एकत्रीकरण का कारण है और अवांछनीय है सकता है। कि एकत्रीकरण हमारे प्रोटोकॉल के साथ नहीं हो रहा है की जांच करने के लिए, हम nanoparticle लक्षण और नौकरशाही का आकार घटाने उपकरण के साथ यह सत्यापित। इस उपकरण के लिए कणों hydrodynamic व्यास, जो कोटिंग और एंटीबॉडी परतों के बजाय केवल 15 एनएम कोर में शामिल उपाय। हमने पाया है कि मिलकर मोती के बहुमत एक भी चोटी पर स्थित हैं (नीचे 73 ± 7.3 एनएम सभी घटनाओं के 90% के साथ 64.7 ± 4.2 एनएम पीक मतलब है)। अब-एमएनपी सह का मिश्रणvirions या सही अनुपात में ईवीएस के साथ mplexes महत्वपूर्ण है ताकि MNPS से ईवीएस / virions उच्च कई आदेशों की एकाग्रता में हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि एकल ईवीएस / virions विश्लेषण कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। कम प्रवाह में कोशिकामापी चलाने के द्वारा घटनाओं के संयोग से बचें। प्रतिदीप्ति पर अधिग्रहण को ट्रिगर और कब्जा कर लिया संस्थाओं की एकाग्रता को मापने के लिए बड़ा नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।

हालांकि, MNPS crosslinking द्वारा या एक ही nanoparticle करने के लिए दो या दो से अधिक virions के बंधन से ईवीएस या virions कुल कर सकते हैं। इस जांच करने के लिए, चित्रा 4 में वर्णित के रूप में एकत्रीकरण के लिए एक परीक्षण किया जाना है। यहाँ तक कि व्यक्तिगत रूप से कब्जा कर लिया virions या ईवीएस एक साथ प्रवाह की लेजर बीम प्रवेश कर सकते हैं। यह दो अलग अलग एंटीजन के लिए झूठी सकारात्मकता पैदा होगा। इससे बचने के लिए, प्रवाह कोशिकामापी के रूप में वर्णित सेट किया जाना चाहिए और तैयारी पतला होना चाहिए। एक जाँच कर सकते हैं एक ही उपयोग करके संयोग हो रहा है कि क्यारणनीति पिछले अंक में वर्णित है। इसके अलावा, संयोग की कमी तैयारी के धारावाहिक dilutions विश्लेषण और साबित करना है कि घटनाओं की संख्या कमजोर पड़ने के साथ रैखिक कम हो जाती है, जबकि एक fluorescently दाग प्रतिजन का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता सभी dilutions (चित्रा 5) में निरंतर बनी हुई द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। एक और मुद्दा यह है कि बहुत कुछ वायरस / ईवीएस कब्जा किया जा सकता है। यह वायरस / ईवीएस कि एंटीजन जिसके माध्यम से वे विशिष्ट MNPS द्वारा कब्जा कर रहे हैं ले जाने का सच कमी के कारण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, कब्जा की दक्षता में विभिन्न कारणों से कम है (जैसे, MNPS, इस प्रोटोकॉल के लिए विकसित virions / ईवीएस को MNPS के अनुपात से विचलन, आदि के लिए एंटीबॉडी का अकुशल युग्मन)। उत्तरार्द्ध संभावना से बचने के लिए, कब्जा की दक्षता में विशेष रूप से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। आमतौर पर, दक्षता चित्रा 6 में के रूप में 90% के बारे में होना चाहिए।

अलग एंटीबॉडी के कारण हस्तक्षेप कर सकते हैंएक दूसरे के साथ या MNPS करने के लिए मिलकर एंटीबॉडी के साथ steric बाधा। जाँच करने के लिए है कि ऐसा नहीं हुआ एक रिवर्स कब्जा प्रोटोकॉल का परीक्षण किया जाना चाहिए (पर मुक्त अस्थायी पेट से बाद जुदाई के साथ धारा 7. संक्षेप में, virions या ईवीएस में वर्णित प्रथम फ्लोरोसेंट का पता लगाने के पेट के साथ दाग होना चाहिए और फिर कब्जा कर लिया के रूप में अब-एमएनपी परिसरों से चुंबकीय कॉलम।

प्रवाह virometry virions या ईवीएस की प्रतिजनी संरचना के विश्लेषण के मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण लाभ है। नियमित जैव रासायनिक तरीकों की तैयारी में विशेष प्रोटीन की सामान्य उपस्थिति पर रिपोर्ट, लेकिन virions या ईवीएस की विविधता पर कोई जानकारी नहीं प्रदान करते हैं। इस बड़े व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कणों पर virions या ईवीएस की immunocapture भी शामिल है। इस तरह के कण व्यास में कई माइक्रोन की आम तौर पर कर रहे हैं और उनमें से प्रत्येक के सैकड़ों या virions या ईवीएस के हजारों कब्जा कर सकते हैं। इसलिए, किसी भी बाद के विश्लेषण के औसत virions / ईवीएस के गुणएक कण से कब्जा कर लिया। इसके विपरीत, प्रवाह virometry व्यास में और वर्णित प्रोटोकॉल के साथ 10-15 एनएम के MNPS का उपयोग करता घटनाओं में कम से कम 90% एक भी विरिअन या एकल ईवी प्रतिनिधित्व करते हैं।

मुख्य सीमा यह है कि virions या तैयारी में ईवीएस की पूरी आबादी का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, लेकिन केवल उन पर कब्जा कर लिया है। इस प्रकार, प्रतिजन के माध्यम से जो virions या ईवीएस कब्जा कर रहे हैं के चुनाव महत्वपूर्ण हो जाता है। इसके अलावा, विभिन्न एंटीजन की संख्या (विभिन्न एंटीजन के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की संख्या) cytometry के विपरीत प्रवाह virions या ईवीएस के छोटे सतह से सीमित है। अंत में, अलग एंटीबॉडी sterically छोटे (कोशिकाओं की तुलना में) सतह के कारण फिर से एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल है, बशर्ते कि विशिष्ट एंटीबॉडी जिसके माध्यम से वे कब्जा किया जा सकता उपलब्ध हैं किसी भी वायरस या किसी मूल के ईवी के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। व्यक्तिगत virions परमिट पर एंटीजन का विश्लेषणशोधकर्ताओं वायरल आबादी के विभिन्न भागों के रोगजनन संबोधित करने के लिए। इसके अलावा, प्लाज्मा में अलग-अलग ईवीएस की पहचान के लिए यह संभव विशेष कोशिकाओं को ईवीएस की उत्पत्ति का पता लगाने के लिए और इन कोशिकाओं की सामान्य या रोग की स्थिति और अंगों जिसमें वे रहते हैं के बारे में रिपोर्ट करने के लिए कर सकते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5 M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123 count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 एकल virions एकल बाह्य पुटिकाओं चुंबकीय नैनोकणों प्रवाह cytometer
Virometry प्रवाह virions की प्रतिजनी स्पेक्ट्रा और बाह्य Vesicles का विश्लेषण करने के लिए
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Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).

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